העבודה נתמכה על ידי המרכז NIH / הלאומי לרפואה משלימה ואלטרנטיבית (R21AT00978) (1-P01-002048-01) (K01-AT-002166-01), המרכז הלאומי למשאבי מחקר (P41RR14075), מחלת נפש ו Neuroscience מכון דיסקברי (MIND) והמוח פרויקט גרנט (NS 34,189).

חלק 1: הסכמה מדעת הכנה ובכפוף מתנדבים בוגרים בריאים מגויסים למחקר לפי עמוד סקירה מוסדיים אישרה הליכים. הסכמה מדעת של הנושא הוא חתם לפני תחילת המחקר. חלק 2: הגדרת ציוד ניטור פיזיולוגי מערכת מכשירים לספירה PowerLab מאפשר נתונים פיזיולוגיים להיות מסונכרן עם הסריקה באמצעות fMRI את האות ההדק fMRI מוקלט בערוץ קלט. זוהי מערכת מבוססת מחשב נייד עם תשומות עבור א.ק.ג., נשימה, מוליכות חשמלית של העור בתגובה, oximetry הדופק, וכל אות פיזיולוגיים אחרים, כי היה צריך להיות מוקלט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מערכת חגורת הנשימה נמצא בשימוש, מתמר חייב להיות מחובר לשקע החשמל בחדר הסמוך לסורק, עם צינור המוביל את תיאבונו של חגורת דרך כניסת לחדר לסרוק מחבר BNC המוביל PowerLab ב סריקה חדר הבקרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ההדק נמצא בשימוש כדי לסנכרן את הנתונים הפיזיולוגיים נתוני ה-fMRI, אז כבל BNC צריך גם לחבר את אות ה-MRI ההדק הסורק PowerLab בחדר הבקרה סריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף מכשירי ניטור. ארבע אלקטרודות א.ק.ג. יהיה צורך, כמו גם כבל א.ק.ג. מחובר MR-תואם ב rollcart מערכת Vivo. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם המוליכות החשמלית של העור נמדדת, חבר את מוליכות העור מחברים לתוך תיבת הפריצה בחדר הסריקה, יש מוליכות העור בג&#39;ל מוכן בחדר הסריקה. </li></ol> חלק 3: נושא הכנת MR סריקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לשלול חרדה עייפות מיותרת וביום הסריקה כי המדינה בסיסיים יכולים להשפיע על תגובת המוח לגירוי אקופונקטורה. הצע נושא לאכול ארוחה קלה לפני ההליך, כך התגובות חולשה מטרידה ניתן להימנע מכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדריכו את הנושא לשכב פרקדן במכונה עם אטמי אוזניים כדי לדכא רעש סורק עם ראש משותקת על ידי תומך מרופד. מאז יחס אות / רעש של סורק אקופונקטורה נמוך בהשוואה מנוע משותף או משימות חזותיים, נתונים נוטה להיפגם בקלות רבה יותר על ידי תנועת הראש. תמיכה ממוקמת מתחת לברכיים כדי לשמור על עקבים הטופס את פני השטח של האלונקה כדי להפחית את התנועה בגוף. סליל ראש מחוזק וכריות מותאמים לנוחות. להפעלת הסריקה הממוצע של 2 שעות, נוחות היא חיונית לצורך סריקה ללא הפרעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ניטור פיזיולוגי הוא הרצוי, הנושא צריך להיות מוכן על פי הסעיף הקודם, בטרם הוכנס הסורק. רצוי לעקוב אחר ערות של הנושא עם מעקב עיניים במהלך סריקות אם זמין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף 4 אלקטרודות א.ק. ג אל החזה השמאלית העליונה של הנושא (עבור נושאים נשים, לנקוט באמצעי זהירות פרטיות כגון הפחתת תריסים על החלון כדי המפרץ בחדר הבקרה סריקה סוגרת את הדלת סורק). צרף כבל על אלקטרודות של המכשיר ב Vivo. בטיחות זה כבל ואת כל הכבלים האחרים מובילים לנושא צריך לרוץ ישירות על שולחן הסריקה, מבלי להרכיב כל לולאות. הפעל את המכשיר ב Vivo ולבדוק איכות האות ECG. התאם את מיקום האלקטרודה במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את הבארות של אלקטרודות SCR עם ג&#39;ל מוליך. זה ג&#39;ל מיוחד SCR צריך להיות שוה לעור. בצע לפתוח אפס במעגל בתוכנה תרשים. צרף אלקטרודות SCR ל 2 כריות סמוך אצבע הדיסטלי של היד של הנבדק על ידי גלישת ולקרו סביב חזק ככל נוח. </li></ol> חלק 4: פונקציונלית MR רצפים הדמיה המותאמים אקופונקטורה הדמיה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים 1.5 או 3.0 טסלה סימנס שלישיית מערכת MRI (סימנס, Erlangen, גרמניה) מצויד הדמיה מישוריים הד עם סליל ראש תקן ריבועית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המחקרים שלנו במשך השנים באופן עקבי הוכיחו כי הדיקור היה פעולה נרחב על פני מערכות תפקודית ברמות מרובות של המוח. מבנים הממוקמת בבסיס המוח כגון האמיגדלה, ההיפוקמפוס, קליפת המוח הקדם חזיתית הגחון המדיאלי subgenual ואזורים רגישים במיוחד חפצים הרגישות. חשוב לבדוק כל סריקה פונקציונלי EPI כדי לשלול איבוד אות באזורים אלה, כמו שמצאנו הבדלים הפסד של אותות בין שני דגמים של סורק סימנס עם עוצמת השדה דומה עם רצף MRI דומה לאיסוף נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוסות המוח מדלל עדיפים להפחתת הרגישות חפצים. פרוסות בעובי 3 מ&quot;מ עם 0.6 מ&quot;מ או 0.75 מ&quot;מ פער בכיוון sagittal או צירית משמשים כדי לכסות את המוח כולו כולל גזע המוח ואת המוח הקטן, בהתאם לקיבולת הזיכרון של מערכת הדמיה. אוריינטציות אחרות עובי פרוסת יכול לשמש הדמיה מוחית חלקית. תשומת לב מיוחדת אנו מקדישים לנושאים אלה לתרום יותרהממצאים עקביים של השפעות הדיקור על המבנים בבסיס המוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סריקות תפקודיות נרכשות עם רצף T2 *- משוקלל הד שיפוע (TR / TE 4000/30 ms, 200 מ&quot;מ FOV, מטריצה ​​זווית 64x64, להפוך 90 מעלות, עובי פרוסת 3.0 מ&quot;מ, פער 0.6 מ&quot;מ). רכשנו סך של 150 נקודות זמן 10 דקות. אוסף תמונה קודמת 4 סריקות דמה כדי לאפשר איזון של האות fMRI. TE קצר מפחית רגישות חפצים. TR ארוך יחסית היתרי כיסוי המוח כולו עם רזולוציה מרחבית גבוהה. </li></ol> חלק 5: Localizer הראשוני סריקות אנטומיים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני סריקות פונקציונלי עם דיקור מנוהלים, סריקה Localizer, סריקה ברזולוציה גבוהה אנטומי, ואת T1 משוקלל 3D MP-בהתקף נרכשים כדי להבטיח מיקום נכון חוסן אנטומי. תצפית כללי בשלב זה יכול להבטיח כי סריקות מיותרות לא מנוהלים. Localizer, סריקה קצרה מאוד, מבטיח כי המוח כולו נכלל בסריקה, ומאפשרת לך קו זה עם קו AC-PC. אם יש חריגות החשוד, החוקרים תשלח תמונות רדיולוג מיומן אבל לא צריך לעשות שום טענות על מה על הסריקה נושאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סריקות הראשונית לקחת בערך 20 דקות בסך הכל. צפייה קצרה יכול להגיד את החוקר אם זה יהיה שימושי להמשיך סריקה. זהו זמן טוב לדבר עם הנושא ולוודא כי הם עדיין נוח ולא חווים כל תופעות לוואי מלהיות מגנט. </li></ol> חלק 6: דיקור עם ניטור fMRI מבין שתי צורות הטיפול (מניפולציה מחט ידני וגירוי חשמלי), וידיאו זה יהיה מוגבל ידני דיקור, אשר יש היסטוריה הרבה יותר של שימוש קליני. אקופונקטורה מנוהל בריצות כפולות נקודות דיקור קלאסיות LI4 מצד, LV3 ברגל או ST36 על הרגל, העסקת סטריליים, חד פעמי רק דיקור במחטים לשימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדריכו את הנושאים להירגע, לשמור בעיניים עצומות ולהימנע תנועות במהלך סריקה. כדי למנוע גירוי מזיק, אנחנו דווקא להנחות את הנושא להעלות אצבע אחת אם כל התחושות דיקור גישות ציון של 8, ולהעלות שתי אצבעות במקרה של כאב חד של תואר כלשהו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הכנסת, מחט רגישות pretest של הנושא סובלנות מניפולציה מחט כדי לעזור לבחור את עומק הכניסה ואת הכוח של מניפולציה על איסוף הנתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הדמיה תפקודית 10 דקות, המחט הוא הסתובב במשך דקות 2 במהלך M1 ו-M2, והשאיר במקום בתקופות שאר R1 (2min)), R2 (3min), R3 (1 דקות). האקופונקטורה מקפיד לא להתקרב או לעזוב את הנושא ישירות לפני או אחרי תקופת גירוי, כמו גם בתנועה העלולים להשפיע על התוצאות. (Paradigm, איור 1) <img src="/files/ftp_upload/1190/1190fig1.n.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. פרדיגמה דיקור fMRI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השלמת אקופונקטורה, האקופונקטורה את הרשומות הכוח שבו המחט מתנגד מניפולציה. בסוף כל סריקה, אחרת הצוות החוקר שואל את הנושא לתחושות כיתה מנוסה בסולם של 1-10. הרשימה, כאב, כאב, לחץ, מלאות, כבדות, חוסר תחושה, עקצוץ, כאב עמום, כאב חד, מבוסס על ניסיון של הקהילה האקופונקטורה לבין נתוני הניסוי הקודם ולא שאלונים כאב בספרות. תגובת פסיכופיסיות מסווגת כקבוצה deqi טיפוסי קבוצה נוספת של deqi מעורבב עם כאב חד המבוסס על רשומות אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבר אל נושאים בין סריקות כדי לוודא שהם מרגישים נוח והם להישאר ער. אם חלק כלשהו של הגוף שלהם מתחיל לכאוב או להרגיש לא נוח, צוות מחקר באתר יש לנקוט בצעדים המתאימים על מנת להקל על אי נוחות. תנועות שנוצר על ידי הנושא יגרום נזק לנתונים. נושאים מזדמנים יכולים להירדם במהלך סריקה, אשר ישפיע על התגובה hemodynamic. </li></ol> חלק 7: עיבוד נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רמות מרובות של ניתוח ניתן להריץ. מודל ליניארי כללי משתמשת תקופות מנוחה כבסיס לקביעת אות BOLD% MR לשנות את כל voxel המוח במהלך המשימה. הוא גם קובע את המובהקות הסטטיסטית של שינויים אלה ומסיר נתונים BOLD כי אינם מגיעים 3 voxels רציף ב מסוים p-value. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע זרע מבוססי ניתוח קורלציה בין להראות את קישוריות תפקודית בין אזור אחד נוירולוגיות שאר המוח. הדבר נעשה על ידי בחירת אזורים התייחסות משווה שלה בזמן כמובן עם זה של כל voxel אחרים במוח. ניתוחים אחרים כגון ניתוח מרכיבים עצמאיים, ניתוח אשכולות מטושטשת, מידול משוואות מבניות, סיבתיות גריינג&#39;ר יכול להיות מיושם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתונים פיזיולוגיים יכוליםלהיות מנותח על ידי ממוצעים של תגובה בתוך חלונות הקשורים לגירוי מחט דיקור. לדוגמה, נתוני אק&quot;ג ניתן להוסיף הערות על תזמון QRS קומפלקס ואחריו ניתוח של קצב הלב ואת קצב השתנות הלב. </li></ol> חלק 8: תוצאות <img src="/files/ftp_upload/1190/1190fig2.n.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. בתגובה hemodynamic דיקור deqi לעומת גירוי מישוש ב LI4 הנכון, ST36 ו LV3 (52 runs/37 נבדקים). אשכולות של מבנים מנוטרל ב (קליפת המוח הקדמית המדיאלי) MPFC (1), MPC (קליפת המוח הקודקודית המדיאלי) (2), MTL (באונה הטמפורלית מדיאלית) (3), בלטו יותר אקופונקטורה (איור) מאשר גירוי מישוש (איור ב &#39;). שחרור משרות נרחב של BA22/21 ימין (4) דיקור לא נצפתה גירוי מישוש. BA43 הסנסורית (5) ו העמותה קליפת המוח (6) הראו הפעלה יותר לגירוי חוש המישוש מאשר דיקור (לא מוצג). מעניין, האינסולה הקדמי הימני, (7) הופעל דיקור ולא גירוי מישוש. (P &lt;0.0001). <img src="/files/ftp_upload/1190/1190fig3.n.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. בתגובה hemodynamic ב deqi (52 runs/37 נבדקים) לעומת deqi מעורבב עם כאב חד (52 runs/29 נבדקים) במהלך אקופונקטורה ב LI4 הנכון, ST36 ו LV3, שחרור משרות הבולטים של MPFC (1), MPC ( 2) ו MTL (3) ראיתי עם כאב deqi נעדר (איור א &#39;) נחלש בנוכחות הכאב (איור ב&#39;). עם הכאב, הפעלה של קליפת המוח הסנסורית העמותה (4) הפכו בולטים יותר, קבוצת משנה של אזורים הלימבית paralimbic כגון midC / SMA (5), postC_BA23 (6), איימי (7), ו vermis cerebellar ( 8) הפך לפעיל. הזכות הקדמי האינסולה (9) הופעל ניכרת deqi בעוד אזורים קטנים של האינסולה הקדמי ואת האחורי (10) הופעלו בילטרלי בכאב. P &lt;0.0001. <img src="/files/ftp_upload/1190/1190fig4.n.jpg" alt="איור 4" /> איור 4 חפיפה של רשת הלימבית-paralimbic-neocortical (LPNN) דיקור עם הרשת במצב ברירת המחדל (DMN). תגובת BOLD של LPNN על ידי ניתוח GLM (Fig.A) ועל ידי ניתוח מודל ללא Cluster Fuzzy (איור ב &#39; ) במהלך אקופונקטורה ב LI4, ST36 ו LV3 להראות דפוסים כמעט זהים עם DMN (Fig.C, עיבוד שולמן et al, 1997). אשכולות של אזורים עם ירידות אות קוהרנטית מופיעים קליפת המוח הקדם חזיתית המדיאלי (1), postero-הקורטקס המדיאלי (2) ו באונה הטמפורלית (3). p &lt;0.0001.

<ol>
	<li>Hui, K. K. S., Liu, J., Marina, O., Napadow, V., Haselgrove, C., Kwong, K. K., Kennedy, D. N., Makris, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+integrated+response+of+the+human+cerebro-cerebellar+and+limbic+systems+to+acupuncture+stimulation+at+ST+36+as+evidenced+by+fMRI.">The integrated response of the human cerebro-cerebellar and limbic systems to acupuncture stimulation at ST 36 as evidenced by fMRI.</a> Neuroimage. 27 (3), 479-496 (2005).</li><li>Hui, K. K. S., Marina, O., Claunch, J. D., Nixon, E. E., Fang, J., Liu, J., Li, M., Napadow, V., Vangel, M., Makris, N., Chan, S. T., Kwong, K. K., Rosen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acupuncture+mobilizes+the+brain's+default+mode+and+its+anti-correlated+network+in+healthy+subjects.">Acupuncture mobilizes the brain's default mode and its anti-correlated network in healthy subjects.</a> Brain Res. 1287, 84-103 (2009).</li><li>Napadow, V., Dhond, R. P., Purdon, P., Kettner, N., Makris, N., Kwong, K. K., Hui, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+acupuncture+fMRI+in+the+human+brainstem+with+heart+rate+variability.">Correlating acupuncture fMRI in the human brainstem with heart rate variability.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 5, 4496-4499 (2005).</li><li>Shulman, G. L., Corbetta, M., Buckner, R. L., Raichle, M. E., Fiez, J. A., Miezin, F. M., Petersen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+modulation+of+early+sensory+cortex.">Top-down modulation of early sensory cortex.</a> Cereb. Cortex. 7 (3), 193-206 (1997).</li></ol>

העסקתו של טכניקות ראויה, את החוויה של האקופונקטורה לבין גודל המדגם גדול כדי לאפשר הפרדה בין השפעות בלבול של גירוי מזיק בשוגג חשובים ברכישת ופרשנות של נתונים דיקור fMRI. המחקרים שלנו של נקודות דיקור קלאסיות כמה עולה כי דיקור מודולציה הרשת הלימבית, מערכת חשובה הרגולציה ?...

monitoring acupuncture effects on human brain by fmri

Functional MRI משמש כדי לחקור את ההשפעות של אקופונקטורה על התגובה BOLD ואת קישוריות תפקודית של המוח האנושי. תוצאות מראים כי דיקור מגייסת רשת הלימבית-paralimbic-neocortical ואנטי בקורלציה שלה הסנסורית / paralimbic רשת ברמות מרובות של המוח שהתגובה hemodynamic מושפעת התגובה פסיכופיסיות. ניטור פיזיולוגית ניתן לבצע כדי לחקור את התגובה היקפי של תפקוד העצבים האוטונומית. וידאו זה מתאר את המחקרים שבוצעו ב LI4 (Hegu), ST36 (zusanli) ו LV3 (taichong), נקודות הדיקור הקלאסיות שאינן בשימוש נפוץ לפעולות modulatory וכאב להפחתת. בעיות מסוימות הדורשות טיפול ביישומים של fMRI לחקירה דיקור מצוינים.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI at JoVE.com

Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

ניטור FMRI ופיזיולוגיות משמש כדי לחקור את ההשפעות של אקופונקטורה על מערכות העצבים המרכזית ואת הפריפריה. דיקור מגייסת רשת הלימבית-paralimbic-neocortical, עם חפיפה גדולה עם רשת מצב ברירת המחדל, כדי לווסת את פעילות נוירולוגית, ייתכן שהיה קשור אפקט האוטונומית שלה במערכת העצבים ההיקפית.

דיקור ניטור השפעות על המוח האנושי על ידי fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

monitoring-acupuncture-effects-on-human-brain-by-fmri

Research

JoVE Journal

Biology

15.2K Views.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. ניטור FMRI ופיזיולוגיות משמש כדי לחקור את ההשפעות של אקופונקטורה על מערכות העצבים המרכזית ואת הפריפריה. דיקור מגייסת רשת הלימבית-paralimbic-neocortical, עם חפיפה גדולה עם רשת מצב ברירת המחדל, כדי לווסת את פעילות נוירולוגית, ייתכן שהיה קשור אפקט האוטונומית שלה במערכת העצבים ...

Video: Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

מחקרים גנטיים של חלבונים תיקון דנ&quot;א אנושי באמצעות שמרים כמודל למערכת

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

ניתוח פונקציה של GTPases קטנים על ידי Microinjection של פלסמידים לתוך תאים אפיתל מקוטב

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent progress, the functional properties and lateralization of the human auditory cortex are far from being fully understood. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a non-invasive technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses, and represents a unique method of exploring plasticity and connectivity. It has only recently begun to be applied to understand auditory cortical function 2. 
An important issue in using TMS is that the physiological consequences of the stimulation are difficult to establish. Although many TMS studies make the implicit assumption that the area targeted by the coil is the area affected, this need not be the case, particularly for complex cognitive functions which depend on interactions across many brain regions 3. One solution to this problem is to combine TMS with functional Magnetic resonance imaging (fMRI). The idea here is that fMRI will provide an index of changes in brain activity associated with TMS. Thus, fMRI would give an independent means of assessing which areas are affected by TMS and how they are modulated 4. In addition, fMRI allows the assessment of functional connectivity, which represents a measure of the temporal coupling between distant regions. It can thus be useful not only to measure the net activity modulation induced by TMS in given locations, but also the degree to which the network properties are affected by TMS, via any observed changes in functional connectivity.
Different approaches exist to combine TMS and functional imaging according to the temporal order of the methods. Functional MRI can be applied before, during, after, or both before and after TMS. Recently, some studies interleaved TMS and fMRI in order to provide online mapping of the functional changes induced by TMS 5-7. However, this online combination has many technical problems, including the static artifacts resulting from the presence of the TMS coil in the scanner room, or the effects of TMS pulses on the process of MR image formation. But more importantly, the loud acoustic noise induced by TMS (increased compared with standard use because of the resonance of the scanner bore) and the increased TMS coil vibrations (caused by the strong mechanical forces due to the static magnetic field of the MR scanner) constitute a crucial problem when studying auditory processing. 
This is one reason why fMRI was carried out before and after TMS in the present study. Similar approaches have been used to target the motor cortex 8,9, premotor cortex 10, primary somatosensory cortex 11,12 and language-related areas 13, but so far no combined TMS-fMRI study has investigated the auditory cortex. The purpose of this article is to provide details concerning the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools to investigate auditory processing. 
Previously we showed that repetitive TMS (rTMS) at high and low frequencies (resp. 10 Hz and 1 Hz) applied over the auditory cortex modulated response time (RT) in a melody discrimination task 2. We also showed that RT modulation was correlated with functional connectivity in the auditory network assessed using fMRI: the higher the functional connectivity between left and right auditory cortices during task performance, the higher the facilitatory effect (i.e. decreased RT) observed with rTMS. However those findings were mainly correlational, as fMRI was performed before rTMS. Here, fMRI was carried out before and immediately after TMS to provide direct measures of the functional organization of the auditory cortex, and more specifically of the plastic reorganization of the auditory neural network occurring after the neural intervention provided by TMS. 
Combined fMRI and TMS applied over the auditory cortex should enable a better understanding of brain mechanisms of auditory processing, providing physiological information about functional effects of TMS. This knowledge could be useful for many cognitive neuroscience applications, as well as for optimizing therapeutic applications of TMS, particularly in auditory-related disorders.

Auditory processing is the basis of speech and music-related processing. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) has been used successfully to study cognitive, sensory and motor systems but has rarely been applied to audition. Here we investigated TMS combined with functional Magnetic Resonance Imaging to understand the functional organization of auditory cortex.

מיפוי לאחר הלוואי של תטא Burst גירוי בקורטקס השמיעתי האנושי בהדמיה תפקודית

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific shapes. Drosophila tracheal terminal cells have become a powerful genetic model to identify and elucidate the roles of genes required for generating cellular morphologies. Terminal cells are a component of a branched tubular network, the tracheal system that functions to supply oxygen to internal tissues. Terminal cells are an excellent model for investigating questions of cell shape as they possess two distinct cellular architectures. First, terminal cells have an elaborate branched morphology, similar to complex neurons; second, terminal cell branches are formed as thin tubes and contain a membrane-bound intracellular lumen. Quantitative analysis of terminal cell branch number, branch organization and individual branch shape, can be used to provide information about the role of specific genetic mechanisms in the making of a branched cell. Analysis of tube formation in these cells can reveal conserved mechanisms of tubulogenesis common to other tubular networks, such as the vertebrate vasculature. Here we describe techniques that can be used to rapidly fix, image, and analyze both branching patterns and tube formation in terminal cells within Drosophila larvae. These techniques can be used to analyze terminal cells in wild-type and mutant animals, or genetic mosaics. Because of the high efficiency of this protocol, it is also well suited for genetic, RNAi-based, or drug screens in the Drosophila tracheal system.

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Here, we present a method for light microscopy analysis of tracheal terminal cells in Drosophila larvae. This method allows for quick examination of branch and lumen morphology in whole animals and would be useful for analysis of individual mutants or screens for mutations affecting terminal cell development.

בחינה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; Terminal תאי קני הזחל על ידי מיקרוסקופ אור

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

שיטה להערכת ההשפעות של טווח של אורכי גל ועוצמות של אדום / טיפול באור האינפרה-אדום קרוב בסטרס חמצוני<em&gt; במבחנה</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees collect and convert to beebread by placing colonies in a specially constructed enclosed flight area. Methods were developed to analyze the protein and amino acid composition of the pollen and beebread. We also describe how consumption of the beebread was measured and methods used to determine adult worker bee hemolymph protein titers after feeding on beebread for 4, 7 and 11 days after emergence. Methods were applied to determine if genotype affects the conversion of pollen to beebread and the rate that bees consume and acquire protein from it. Two subspecies (European and Africanized honey bees; EHB and AHB respectively) were provided with the same pollen source. Based on the developed methods, beebread made by both subspecies had lower protein concentrations and pH values than the pollen. In general, amino acid concentrations in beebread made by either EHB or AHB were similar and occurred at higher levels in beebread than in pollen. Both AHB and EHB consumed significantly more of the beebread made by AHB than by EHB. Though EHB and AHB consumed similar amounts of each type of beebread, hemolymph protein concentrations in AHB were higher than in EHB. Differences in protein acquisition between AHB and EHB might reflect environmental adaptations related to the geographic region where each subspecies evolved. These differences could contribute to the successful establishment of AHB populations in the New World because of the effects on brood rearing and colony growth.

Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.

שיטות להשוואה בין חומרים מזינים בBeebread נוצרו על ידי דבורים דבש Africanized ואירופאי והשפעות על titers חלבון Hemolymph

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

כימות של דביקות תא האנדותל<em&gt; במבחנה</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

ניטור הומאוסטזה סידן endoplasmic reticulum שימוש<em&gt; Gaussia</em&gt; לוציפראז SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

בידוד של אזורים הגנומי ספציפיים וזיהוי של Associated מולקולות על ידי enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

ניתוח Glucocorticoid צואה: לא פולשני ניטור הכליה ב Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...