Die Arbeit wurde durch die NIH / National Center for Complementary and Alternative Medicine (R21AT00978) (1-P01-002048-01) (K01-AT-002166-01), das National Center for Research Resources (P41RR14075), der Mental Illness unterstützt und Neuroscience Discovery Institute (MIND) und der Brain Project Grant (NS 34189).

Teil 1: Informierte Zustimmung und unter Vorbereitung Gesunden erwachsenen Probanden für die Studie nach Institutional Review Board genehmigten Verfahren eingestellt. Informierte Zustimmung durch das Subjekt ist vor Beginn der Studie unterschrieben. Teil 2: Einrichten physiologischen Überwachungsgeräten Die AD Instruments PowerLab System ermöglicht physiologischen Daten mit der fMRI-Scan mit Hilfe der fMRI-Trigger-Signal auf einen Eingang Kanal aufgezeichnet synchronisiert werden. Dies ist eine Laptop-basiertes System mit Eingängen für EKG, Atmung, Hautleitwert Antwort, Pulsoximetrie, und alle anderen physiologischen Signal, das aufgezeichnet werden müssen, wäre. <ol><li> Wenn eine respiratorische Gurtsystem verwendet wird, muss der Wandler angeschlossen werden an eine Steckdose im Zimmer neben dem Scanner, mit dem Schlauch, der am Gürtel gefüttert über den Zulauf in die Scan-Raum und ein BNC-Stecker, die zum PowerLab in der Scan-Leitwarte. </li><li> Wenn ein Trigger verwendet wird, um die physiologischen Daten der fMRI-Daten zu synchronisieren, dann ein BNC-Kabel muss auch eine Verbindung der MRT-Trigger-Signal an den PowerLab in der Scan-Leitwarte. </li><li> Gather Überwachungseinrichtungen. Vier EKG-Elektroden benötigt, sowie eine EKG-Kabel verbunden mit einem MR-kompatiblen In-vivo-System rollcart werden. </li><li> Wenn Hautleitfähigkeit gemessen wird, stecken Sie den Hautleitwert Stecker in die Breakout-Box in der Scan-Zimmer und haben Hautleitfähigkeit Gel bereit in der Scan-Raum. </li></ol> Teil 3: Vorbereitung Thema für MR-Untersuchung <ol><li> Es ist wichtig, auszuschließen, unangemessene Angst und Müdigkeit am Tag des Scans, weil Grundzustand die Reaktion des Gehirns auf Akupunkturstimulation beeinflussen können. Schlagen Sie das Thema eine leichte Mahlzeit vor dem Eingriff, so dass Schwäche und unerwünschte Reaktionen können vermieden werden. </li><li> Weisen Sie den Gegenstand auf dem Rücken liegen in der Maschine tragen Ohrenstöpsel zum Scanner Rauschen zu unterdrücken und mit dem Kopf durch die gepolsterten Trägern immobilisiert. Da das Signal / Rausch-Verhältnis von Akupunkturstimulation Scans ist gering mit gemeinsamen Motor oder visuelle Aufgaben im Vergleich, neigt die Daten leichter durch Kopfbewegungen beschädigt. Eine Unterstützung ist unter den Knien platziert, damit die Fersen bilden die Oberfläche der Trage auf Körperbewegung zu reduzieren. Der Kopf Spule befestigt und Kissen sind für den Komfort angepasst. Für einen durchschnittlichen Scan-Sitzung von 2 Stunden ist der Komfort wichtig für ununterbrochene Scannen. </li><li> Wenn physiologischen Überwachung gewünscht ist, sollte Gegenstand nach dem vorigen Abschnitt, bevor sie in den Scanner legen vorbereitet werden. Es ist wünschenswert, um die Wachheit des Subjekts mit Eye-Tracking-Monitor während der Scans, sofern verfügbar. </li><li> Bringen Sie 4 EKG-Elektroden auf das Thema der linken oberen Brust (für weibliche Probanden, nehmen den Datenschutz Vorsichtsmaßnahmen wie Senkung der Jalousien am Fenster auf die Bucht in der Scan-Leitwarte und Ausschalten des Scanners Tür). Attach-Kabel an die Elektroden und die In-vivo-Gerät. Aus Sicherheitsgründen dieses Kabel und alle anderen Kabel, die zu dem Thema sollten direkt laufen entlang der Scan-Tabelle, ohne Bildung von Schleifen. Schalten Sie den In-vivo-Gerät und überprüfen Sie die EKG-Signal-Qualität. Passen Elektrode Positionierung, wenn nötig. </li><li> Füllen Sie den Vertiefungen der SCR-Elektroden mit leitfähiges Gel. Diese speziellen SCR-Gel sollte isotonisch sein, um die Haut. Führen Leerlauf Null in Chart-Software. Bringen Sie SCR Elektroden 2 angrenzenden distalen Fingerkuppen der Hand der Versuchsperson durch Umwickeln der Klettverschluss um so dicht wie bequem ist. </li></ol> Teil 4: Funktionelle MR-Bildgebung Sequenzen zur Bildgebung Akupunkturstimulation zugeschnitten. <ol><li> Wir verwenden eine 1,5 oder 3,0 Tesla Siemens Trio MRT-System (Siemens, Erlangen, Deutschland) für Echo-Planar-Bildgebung mit einem Standard-quadratischen Kopfspule ausgestattet. </li><li> Unsere Untersuchungen über die Jahre immer wieder bewiesen, dass Akupunktur umfangreiche Maßnahmen über funktionale Systeme auf verschiedenen Ebenen des Gehirns hatte. Die Strukturen auf der Basis des Gehirns wie der Amygdala, Hippocampus, ventralen medialen präfrontalen Kortex und subgenual Gebieten sind besonders anfällig für Suszeptibilitätsartefakte. Es ist wichtig, jeden EPI funktionellen Scan überprüfen, um auszuschließen, Signalverlust in diesen Regionen, wie wir Unterschiede in Verlust von Signalen zwischen zwei Modellen einer Siemens-Scanner mit ähnlichen Feldstärke und mit einer ähnlichen MRT-Sequenz für die Datensammlung gefunden. </li><li> Thinner Hirnschnitten vorzuziehen sind zur Reduzierung der Anfälligkeit Artefakte. Slices 3 mm dick mit 0,6 mm oder 0,75 mm Lücke in der sagittalen oder axialen Ausrichtung werden verwendet, um das gesamte Gehirn einschließlich der Hirnstamm und Kleinhirn abhängig von der Speicherkapazität des bildgebenden Systems zu decken. Andere Orientierungen und Schichtdicke kann für partielle Bildgebung des Gehirns eingesetzt werden. Die besondere Aufmerksamkeit für diese Themen beitragen, die mehrkonsistenten Befunde der Akupunktur Auswirkungen auf die Strukturen an der Basis des Gehirns. </li><li> Die funktionalen Scans mit erworben T2 *- gewichtete Gradienten-Echo-Sequenz (TR / TE 4000/30 ms, FOV 200 mm, Matrix 64x64, Flipwinkel 90 °, Schichtdicke 3,0 mm, Abstand 0,6 mm). Wir erwarben insgesamt 150 Zeitpunkten in 10 min. Bild Sammlung wird durch 4 Dummy-Scans voraus, um für die Äquilibrierung des fMRI-Signals zu ermöglichen. Die kürzere TE reduziert Suszeptibilitätsartefakte. Die relativ lange TR erlaubt gesamte Gehirn Abdeckung mit hoher räumlicher Auflösung. </li></ol> Teil 5: Die erste Localizer und anatomischen Scans <ol><li> Vor funktionalen Scans mit Akupunktur ausgeführt werden, sind ein Localizer-Scan, eine hohe Auflösung anatomischen Scans und die T1-gewichtete 3D-MP-RAGE erworben, um die korrekte Positionierung und anatomischen Solidität zu gewährleisten. Allgemeine Bemerkung zu diesem Zeitpunkt kann Ihnen versichern, dass unnötige Scans nicht ausgeführt werden. Der Localizer, eine sehr kurze Scan, stellt sicher, dass das gesamte Gehirn in der Scan ist im Preis inbegriffen und ermöglicht Ihnen, es Line-Up mit der AC-PC Linie. Wenn es irgendwelche verdächtige Anomalien sind, werden die Forscher Bilder auf einen geschulten Radiologen schicken, sollte aber keine Ansprüche stellen über das, was auf der Scan-to-Themen. </li><li> Die ersten Scans dauern ca. 20 Minuten insgesamt. Kurze Betrachtung kann sagen, der Prüfer, wenn es sein wird nützlich sein, den Scanvorgang fortzusetzen. Dies ist ein guter Zeitpunkt, um mit dem Thema zu sprechen und stellen Sie sicher, dass sie noch komfortabler und keine Probleme nachteilige Nebenwirkungen von in der Magnet. </li></ol> Teil 6: Akupunktur mit fMRI Überwachung Von den beiden Formen der Behandlung (manuelle Nadel Manipulation und elektrische Stimulation), wird das Video auf manuelle Akupunktur, die eine viel längere Geschichte der klinischen Anwendung hat begrenzt werden. Akupunktur Stimulation ist in zweifacher Ausfertigung läuft der klassischen Akupunkturpunkte LI4 auf der Hand, LV3 auf dem Fuß oder ST36 am Bein verabreicht wird, beschäftigt sterile, den einmaligen Gebrauch nur Akupunkturnadeln. <ol><li> Weisen Themen zu entspannen, halten die Augen geschlossen und von Bewegungen während des Scanvorgangs zu unterlassen. Zur Vermeidung von schädlichen Stimulation, wir gezielt anweisen, das Thema zu einem Finger heben, wenn eine der Akupunktur Empfindungen nähert sich einem Wert von 8, und heben Sie mit zwei Fingern bei starken Schmerzen jeglicher Grad. </li><li> Nach dem Einsetzen der Nadel, Pretest des Subjekts Sensibilität und Toleranz gegenüber Nadelmanipulation zu helfen, wählen Sie die Eintauchtiefe und die Kraft der Manipulation für die Datenerfassung. </li><li> Während der 10 min funktionellen Bildgebung wird die Nadel gedreht für 2 min bei M1 und M2, und links in die während der Ruhezeiten R1 (2min)), R2 (3min), R3 (1 min). Der Akupunkteur stellt sicher, dass nicht zu nähern oder verlassen das Thema direkt vor oder nach der Stimulation Zeit, da selbst diese Bewegung könnte die Ergebnisse beeinflussen. (Paradigm, Abb. 1) <img src="/files/ftp_upload/1190/1190fig1.n.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Akupunktur fMRI Paradigm. </li><li> Nach Abschluss der Akupunkturstimulation, Aufzeichnungen der Akupunkteur die Kraft, mit der die Nadel widersteht Manipulation. Am Ende jedes Scans, fragt ein anderer Mitarbeiter Prüfer den zur Bewertung der Empfindungen auf einer Skala von 1-10 erlebt. Die Liste, Schmerzen, Druck, Völlegefühl, Schwere, Taubheit, Kribbeln, dumpfen Schmerz, stechender Schmerz, basiert auf den Erfahrungen der Akupunkteur Gemeinde und früheren experimentellen Daten und nicht als Schmerz Fragebögen in der Literatur. Die psycho-Ansprechen ist definiert als ein typisches deqi Gruppe und eine weitere Gruppe von deqi mit scharfen Schmerz auf diese Aufzeichnungen basierten gemischt eingestuft. </li><li> Sprechen Sie die Themen zwischen den Scans um sicherzustellen, dass sie sich wohl fühlen und sie wach bleiben. Wenn irgendein Teil ihres Körpers beginnt zu verkrampfen oder sich unwohl fühlen, sollten die wissenschaftlichen Mitarbeiter vor Ort geeignete Maßnahmen ergreifen, um die Beschwerden zu lindern. Bewegungen, die durch das Thema erzeugt würde Datenverluste verursachen. Gelegentliche Fächer können einzuschlafen während des Scannens, was die hämodynamische Reaktion beeinflussen. </li></ol> Teil 7: Data Processing <ol><li> Mehrere Ebenen der Analyse ausgeführt werden können. Eine allgemeine lineare Modell verwendet Ruhezeiten als Grundlage für die% BOLD MR-Signal ändern bei jedem Voxel des Gehirns während der Aufgabe zu bestimmen. Er bestimmt auch die statistische Signifikanz dieser Veränderungen und entfernt BOLD Daten, die nicht zu erreichen do 3 zusammenhängende Voxel zu einem bestimmten p-Wert. </li><li> Führen Sie Samen-basierte Kreuzkorrelation Analyse auf die funktionelle Konnektivität zwischen einer neurologischen Region und dem Rest des Gehirns zeigen. Dies wird durch die Auswahl eines Referenz-Regionen und den Vergleich ihrer zeitlichen Verlauf mit der jedes anderen Voxel im Gehirn getan. Andere Analysen wie Independent Component Analysis, Fuzzy-Clusteranalyse, Strukturgleichungsmodelle, Granger Kausalität angewandt werden kann. </li><li> Physiologische Daten könnendurch Mittelung Antwort innerhalb von Fenstern im Zusammenhang mit Akupunkturnadeln Stimulation analysiert werden. Zum Beispiel kann EKG-Daten annotiert werden für QRS-Komplex Timing durch die Analyse von Herzfrequenz und Herzfrequenz-Variabilität gefolgt. </li></ol> Teil 8: Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/1190/1190fig2.n.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Hämodynamischen Antwort in Akupunktur deqi vs taktile Stimulation im rechten LI4, ST36 und LV3 (52 runs/37 Probanden). Die Cluster deaktiviert Strukturen an der MPFC (medialen präfrontalen Kortex) (1), MPC (medial parietalen Kortex) (2), MTL (medialen Temporallappen) (3), wurden noch ausgeprägter in Akupunktur (Abb. A) als in taktile Stimulation (Abb. B). Umfangreiche Deaktivierung der rechten BA22/21 (4) in der Akupunktur war nicht in taktile Stimulation beobachtet. Die sensomotorischen BA43 (5) und Assoziationskortex (6) zeigte eine verstärkte Aktivierung in taktile Stimulation als in der Akupunktur (nicht dargestellt). Interessanterweise war die rechte vordere Insula, (7) in Akupunktur und nicht in taktile Stimulation aktiviert. (P &lt;0,0001). <img src="/files/ftp_upload/1190/1190fig3.n.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Hämodynamischen Antwort in deqi (52 runs/37 Themen) versus deqi mit starken Schmerzen (52 runs/29 Probanden) bei der Akupunktur Stimulation im rechten LI4, ST36 und LV3, Der prominente Deaktivierung der MPFC (1) gemischt, MPC-( 2) und MTL (3) mit deqi fehlen Schmerzen (Abb. A) gesehen wurde abgeschwächt in Gegenwart von Schmerzen (Abb. B). Mit Schmerzen, wurde die Aktivierung des sensomotorischen Kortex und Vereinigungsfreiheit (4) in den Vordergrund, und eine Teilmenge des limbischen und paralimbischen Regionen wie dem MIDC / SMA (5), postC_BA23 (6), Amy (7), und Kleinhirnwurms ( 8) wurde aktiviert. Die rechte vordere Insula (9) war deutlich in deqi aktiviert werden, während kleinere Bereiche der vorderen und hinteren Isolierung (10) wurden bilateral in Schmerz aktiviert. P &lt;0,0001. <img src="/files/ftp_upload/1190/1190fig4.n.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4 Overlap von limbischen-paralimbischen-neokortikalen Netzwerk (LPNN) in Akupunktur mit der Standard-Modus-Netzwerk (DMN);. Die BOLD Antwort der LPNN von GLM-Analyse (Abb. A) und Modell-free Fuzzy Cluster-Analyse (Abb. B ) bei der Akupunktur Stimulation bei LI4 zeigen ST36 und LV3 nahezu identische Muster mit dem DMN (Fig.C, adaptiert von Shulman et al, 1997). Cluster von Regionen mit kohärentes Signal verringert erscheinen in der medialen präfrontalen Kortex (1), postero-medialen Cortex (2) und Schläfenlappen (3). p &lt;0,0001.

<ol>
	<li>Hui, K. K. S., Liu, J., Marina, O., Napadow, V., Haselgrove, C., Kwong, K. K., Kennedy, D. N., Makris, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+integrated+response+of+the+human+cerebro-cerebellar+and+limbic+systems+to+acupuncture+stimulation+at+ST+36+as+evidenced+by+fMRI.">The integrated response of the human cerebro-cerebellar and limbic systems to acupuncture stimulation at ST 36 as evidenced by fMRI.</a> Neuroimage. 27 (3), 479-496 (2005).</li><li>Hui, K. K. S., Marina, O., Claunch, J. D., Nixon, E. E., Fang, J., Liu, J., Li, M., Napadow, V., Vangel, M., Makris, N., Chan, S. T., Kwong, K. K., Rosen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acupuncture+mobilizes+the+brain's+default+mode+and+its+anti-correlated+network+in+healthy+subjects.">Acupuncture mobilizes the brain's default mode and its anti-correlated network in healthy subjects.</a> Brain Res. 1287, 84-103 (2009).</li><li>Napadow, V., Dhond, R. P., Purdon, P., Kettner, N., Makris, N., Kwong, K. K., Hui, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+acupuncture+fMRI+in+the+human+brainstem+with+heart+rate+variability.">Correlating acupuncture fMRI in the human brainstem with heart rate variability.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 5, 4496-4499 (2005).</li><li>Shulman, G. L., Corbetta, M., Buckner, R. L., Raichle, M. E., Fiez, J. A., Miezin, F. M., Petersen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+modulation+of+early+sensory+cortex.">Top-down modulation of early sensory cortex.</a> Cereb. Cortex. 7 (3), 193-206 (1997).</li></ol>

Der Einsatz von richtigen Techniken, die Erfahrung der Akupunkteur und eine große Stichprobe zur Trennung von verwirrenden Auswirkungen einer unbeabsichtigten schädlichen Stimulation ermöglichen, sind in den Erwerb und die Auslegung der Akupunktur fMRI-Daten wichtig. Unsere Untersuchungen von mehreren klassischen Akupunkturpunkte zeigen, dass Akupunktur das limbische Netzwerk, eine wichtige intrinsische Regulierungssystem des menschlichen Gehirns moduliert. Das Netzwerk zeigt deutliche Überschneidungen mit der Stand...

monitoring acupuncture effects on human brain by fmri

Functional MRI wird verwendet, um die Wirkung von Akupunktur auf die BOLD-Antwort und die funktionelle Konnektivität des menschlichen Gehirns zu studieren. Die Ergebnisse zeigen, dass Akupunktur eine limbische-paralimbischen-neokortikalen Netzwerk mobilisiert und seine anti-korreliert sensomotorischen / paralimbischen Netzwerk auf mehreren Ebenen des Gehirns und die hämodynamische Reaktion wird durch die psychophysische Reaktion beeinflusst. Physiologische Überwachung durchgeführt werden, um die periphere Reaktion des vegetativen Nerven-Funktion zu erforschen. Dieses Video beschreibt das Studium an LI4 (Hegu) durchgeführt, ST36 (Zusanli) und LV3 (Taichong), klassische Akupunkturpunkte, die üblicherweise für modulatorische und Schmerz-reduzierende Maßnahmen verwendet werden. Einige Fragen, die Aufmerksamkeit erfordern in der Anwendung von fMRI zur Akupunktur Untersuchung werden zur Kenntnis genommen.

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Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

FMRI und physiologischen Überwachung wird verwendet, um die Auswirkungen der Akupunktur auf dem zentralen und peripheren Nervensystem zu studieren. Akupunktur mobilisiert eine limbische-paralimbischen-neokortikalen Netzwerk, mit großer Überschneidung mit der Standard-Modus-Netzwerk, zu modulieren neurologische Aktivität, möglicherweise seine autonome Wirkung in den peripheren Nervensystems.

Überwachung Akupunktur Effects on Human Brain von fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.2K Aufrufe.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. FMRI und physiologischen Überwachung wird verwendet, um die Auswirkungen der Akupunktur auf dem zentralen und peripheren Nervensystem zu studieren. Akupunktur mobilisiert eine limbische-paralimbischen-neokortikalen Netzwerk, mit großer Überschneidung mit der Standard-Modus-Netzwerk, zu modulieren neurologische Aktivität, möglicherweise seine autonome Wirkung in den peripheren Nervensystems.

Serie: Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Genetic Studies of Human DNA-Reparatur-Proteinen unter Verwendung von Hefe als Modellsystem

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Forschung

Biologie

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

Die Analyse der Funktion von kleinen GTPasen durch Mikroinjektion von Plasmiden in polarisierten Epithelzellen

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent progress, the functional properties and lateralization of the human auditory cortex are far from being fully understood. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a non-invasive technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses, and represents a unique method of exploring plasticity and connectivity. It has only recently begun to be applied to understand auditory cortical function 2. 
An important issue in using TMS is that the physiological consequences of the stimulation are difficult to establish. Although many TMS studies make the implicit assumption that the area targeted by the coil is the area affected, this need not be the case, particularly for complex cognitive functions which depend on interactions across many brain regions 3. One solution to this problem is to combine TMS with functional Magnetic resonance imaging (fMRI). The idea here is that fMRI will provide an index of changes in brain activity associated with TMS. Thus, fMRI would give an independent means of assessing which areas are affected by TMS and how they are modulated 4. In addition, fMRI allows the assessment of functional connectivity, which represents a measure of the temporal coupling between distant regions. It can thus be useful not only to measure the net activity modulation induced by TMS in given locations, but also the degree to which the network properties are affected by TMS, via any observed changes in functional connectivity.
Different approaches exist to combine TMS and functional imaging according to the temporal order of the methods. Functional MRI can be applied before, during, after, or both before and after TMS. Recently, some studies interleaved TMS and fMRI in order to provide online mapping of the functional changes induced by TMS 5-7. However, this online combination has many technical problems, including the static artifacts resulting from the presence of the TMS coil in the scanner room, or the effects of TMS pulses on the process of MR image formation. But more importantly, the loud acoustic noise induced by TMS (increased compared with standard use because of the resonance of the scanner bore) and the increased TMS coil vibrations (caused by the strong mechanical forces due to the static magnetic field of the MR scanner) constitute a crucial problem when studying auditory processing. 
This is one reason why fMRI was carried out before and after TMS in the present study. Similar approaches have been used to target the motor cortex 8,9, premotor cortex 10, primary somatosensory cortex 11,12 and language-related areas 13, but so far no combined TMS-fMRI study has investigated the auditory cortex. The purpose of this article is to provide details concerning the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools to investigate auditory processing. 
Previously we showed that repetitive TMS (rTMS) at high and low frequencies (resp. 10 Hz and 1 Hz) applied over the auditory cortex modulated response time (RT) in a melody discrimination task 2. We also showed that RT modulation was correlated with functional connectivity in the auditory network assessed using fMRI: the higher the functional connectivity between left and right auditory cortices during task performance, the higher the facilitatory effect (i.e. decreased RT) observed with rTMS. However those findings were mainly correlational, as fMRI was performed before rTMS. Here, fMRI was carried out before and immediately after TMS to provide direct measures of the functional organization of the auditory cortex, and more specifically of the plastic reorganization of the auditory neural network occurring after the neural intervention provided by TMS. 
Combined fMRI and TMS applied over the auditory cortex should enable a better understanding of brain mechanisms of auditory processing, providing physiological information about functional effects of TMS. This knowledge could be useful for many cognitive neuroscience applications, as well as for optimizing therapeutic applications of TMS, particularly in auditory-related disorders.

Auditory processing is the basis of speech and music-related processing. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) has been used successfully to study cognitive, sensory and motor systems but has rarely been applied to audition. Here we investigated TMS combined with functional Magnetic Resonance Imaging to understand the functional organization of auditory cortex.

Kartierung der Nachwirkungen der Theta Burst Stimulation auf das menschliche Gehör Cortex mit Functional Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific shapes. Drosophila tracheal terminal cells have become a powerful genetic model to identify and elucidate the roles of genes required for generating cellular morphologies. Terminal cells are a component of a branched tubular network, the tracheal system that functions to supply oxygen to internal tissues. Terminal cells are an excellent model for investigating questions of cell shape as they possess two distinct cellular architectures. First, terminal cells have an elaborate branched morphology, similar to complex neurons; second, terminal cell branches are formed as thin tubes and contain a membrane-bound intracellular lumen. Quantitative analysis of terminal cell branch number, branch organization and individual branch shape, can be used to provide information about the role of specific genetic mechanisms in the making of a branched cell. Analysis of tube formation in these cells can reveal conserved mechanisms of tubulogenesis common to other tubular networks, such as the vertebrate vasculature. Here we describe techniques that can be used to rapidly fix, image, and analyze both branching patterns and tube formation in terminal cells within Drosophila larvae. These techniques can be used to analyze terminal cells in wild-type and mutant animals, or genetic mosaics. Because of the high efficiency of this protocol, it is also well suited for genetic, RNAi-based, or drug screens in the Drosophila tracheal system.

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Here, we present a method for light microscopy analysis of tracheal terminal cells in Drosophila larvae. This method allows for quick examination of branch and lumen morphology in whole animals and would be useful for analysis of individual mutants or screens for mutations affecting terminal cell development.

Prüfung der<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven Tracheal Terminal-Cells durch Lichtmikroskopie

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Verfahren zur Beurteilung der Auswirkungen einer Reihe von Wellenlängen und Intensitäten von Rot / Nah-Infrarot-Licht-Therapie auf oxidativen Stress<em&gt; In-vitro-</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees collect and convert to beebread by placing colonies in a specially constructed enclosed flight area. Methods were developed to analyze the protein and amino acid composition of the pollen and beebread. We also describe how consumption of the beebread was measured and methods used to determine adult worker bee hemolymph protein titers after feeding on beebread for 4, 7 and 11 days after emergence. Methods were applied to determine if genotype affects the conversion of pollen to beebread and the rate that bees consume and acquire protein from it. Two subspecies (European and Africanized honey bees; EHB and AHB respectively) were provided with the same pollen source. Based on the developed methods, beebread made by both subspecies had lower protein concentrations and pH values than the pollen. In general, amino acid concentrations in beebread made by either EHB or AHB were similar and occurred at higher levels in beebread than in pollen. Both AHB and EHB consumed significantly more of the beebread made by AHB than by EHB. Though EHB and AHB consumed similar amounts of each type of beebread, hemolymph protein concentrations in AHB were higher than in EHB. Differences in protein acquisition between AHB and EHB might reflect environmental adaptations related to the geographic region where each subspecies evolved. These differences could contribute to the successful establishment of AHB populations in the New World because of the effects on brood rearing and colony growth.

Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.

Methoden zum Vergleich der Nährstoffe in Bienenbrot Hergestellt von Africanized und europäischen Honigbienen und die Auswirkungen auf die Hämolymphe Protein Titer

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Die Quantifizierung der Endothelial Cell Haftfähigkeit<em&gt; In-vitro-</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Überwachung Endoplasmatischen Reticulum Calciumhomöostase Mit ein<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

Isolierung von spezifischen genomischen Regionen und Identifizierung von assoziierten Moleküle durch enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecal Glucocorticoid-Analyse: Nicht-invasive Monitoring-Adrenal in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...