Il lavoro è stato supportato dal NIH / National Center for Complementary and Alternative Medicine (R21AT00978) (1-P01-002048-01) (K01-AT-002166-01), il Centro nazionale per le risorse di ricerca (P41RR14075), la malattia mentale e Neuroscienze Discovery Institute (mente) e il cervello del progetto Grant (NS 34189).

Parte 1: preparazione del consenso informato e soggetti Volontari adulti sani sono reclutati per lo studio in base alle Institutional Review Board ha approvato le procedure. Consenso informato da parte del soggetto è firmato prima dell&#39;inizio dello studio. Parte 2: Installazione apparecchiature di monitoraggio fisiologico L&#39;AD Instruments sistema PowerLab permette di dati fisiologici per essere sincronizzato con la scansione fMRI utilizzando il segnale di attivazione fMRI registrato su un canale di ingresso. Si tratta di un sistema portatile basato con ingressi per ECG, respirazione, la risposta di conduttanza cutanea, pulsossimetria, e qualsiasi altro segnale fisiologico che avrebbe bisogno di essere registrati. <ol><li> Se un sistema respiratorio cintura è in uso, il trasduttore deve essere collegato ad una presa elettrica nella stanza adiacente allo scanner, con il tubo che porta alla cintura alimentato tramite ingresso nella stanza di scansione e un connettore BNC che porta alla PowerLab nel scansione sala di controllo. </li><li> Se un trigger viene utilizzato per sincronizzare i dati fisiologici ai dati fMRI, poi un cavo BNC deve collegare anche il segnale di trigger MRI scanner al PowerLab nella sala di controllo di scansione. </li><li> Raccogliere dispositivi di monitoraggio. Quattro elettrodi ECG saranno necessari, così come un cavo ECG collegato ad un MR-compatibile In rollcart sistema Vivo. </li><li> Se la conduttività della pelle viene misurato, collegare connettori conduttanza della pelle nella breakout box nella camera di scansione, e hanno conduttanza cutanea gel pronto in sala di scansione. </li></ol> Parte 3: soggetto Preparazione per la scansione MR <ol><li> E &#39;importante escludere l&#39;ansia e la stanchezza eccessiva, il giorno della scansione poiché lo stato di base possono influenzare la risposta del cervello alla stimolazione agopuntura. Suggerisci il soggetto mangiare un pasto leggero prima della procedura in modo che le reazioni debolezza e spiacevoli possono essere evitati. </li><li> Istruire il soggetto a giacere supino nella macchina indossando tappi per le orecchie per sopprimere il rumore dello scanner e con la testa immobilizzata da supporti imbottiti. Dato che il rapporto segnale / rumore di scansioni agopuntura stimolazione è basso rispetto al motore comune o compiti visivi, i dati tende ad essere più facilmente danneggiati dal movimento della testa. Un supporto è posto sotto le ginocchia per mantenere il talloni formano la superficie della barella per ridurre il movimento del corpo. La bobina è fissata la testa e gli ammortizzatori sono regolati per il comfort. Per una sessione media di scansione di 2 ore, il comfort è di vitale importanza per la scansione senza interruzioni. </li><li> Se il monitoraggio fisiologico è desiderato, soggetto deve essere preparato secondo la sezione precedente prima di essere messo nello scanner. È auspicabile per monitorare la veglia del soggetto con eye-tracking durante le scansioni, se disponibile. </li><li> Allega 4 elettrodi ECG al torace in alto a sinistra del soggetto (per soggetti di sesso femminile, prendere le dovute precauzioni privacy quali l&#39;abbassamento dei bui sulla finestra alla baia nella sala di controllo di scansione e chiudere la porta dello scanner). Collegare il cavo agli elettrodi e al dispositivo in Vivo. Per motivi di sicurezza questo cavo e tutti gli altri cavi che porta al soggetto deve essere eseguito direttamente sul tavolo di scansione, senza formare un loop. Accendere il dispositivo in Vivo e verificare la qualità del segnale ECG. Regolare il posizionamento dell&#39;elettrodo, se necessario. </li><li> Riempire i pozzetti degli elettrodi SCR con gel conduttore. Questo gel speciale SCR dovrebbe essere isotonica per la pelle. Eseguire lo zero circuito aperto nel software grafico. Collegare gli elettrodi SCR a 2 pastiglie adiacente distale delle dita della mano del soggetto avvolgendo il velcro intorno come ermeticamente come è comodo. </li></ol> Parte 4: MR funzionale di sequenze di immagini su misura per la stimolazione di immagini agopuntura. <ol><li> Usiamo un 1,5 o 3,0 Tesla Siemens Trio MRI sistema (Siemens, Erlangen, Germania) attrezzata per l&#39;imaging eco planare con una batteria standard testa di secondo grado. </li><li> I nostri studi nel corso degli anni costantemente dimostrato che l&#39;agopuntura era un&#39;azione di vasta portata rispetto ai sistemi a più livelli funzionali del cervello. Le strutture si trova alla base del cervello come l&#39;amigdala, ippocampo, corteccia mediale prefrontale ventrale e aree subgenual sono particolarmente suscettibili agli artefatti di suscettibilità. E &#39;importante controllare ogni scansione EPI funzionale escludere la perdita di segnale in queste regioni come abbiamo trovato differenze nella perdita di segnali tra due modelli di uno scanner Siemens con forza campo simile e con una sequenza simile risonanza magnetica per la raccolta dei dati. </li><li> Sezioni di cervello più sottili sono preferibili per ridurre gli artefatti di suscettibilità. Fette di 3 mm di spessore da 0,6 mm o 0,75 mm di distanza l&#39;orientamento sagittale o assiale sono utilizzati per coprire l&#39;intero cervello compreso il tronco cerebrale ed il cervelletto a seconda della capacità di memoria del sistema di imaging. Altri orientamenti e lo spessore fetta può essere utilizzato per l&#39;imaging cerebrale parziale. La particolare attenzione che paghiamo a questi problemi contribuire alla piùrisultati coerenti di effetti dell&#39;agopuntura sulle strutture alla base del cervello. </li><li> Le scansioni sono funzionali acquisiti con un T2 *- ponderata sequenza gradient echo (TR / TE 4000/30 ms, FOV 200 mm, matrice 64x64, angolo di capovolgere 90 °, spessore di strato 3,0 mm, gap 0,6 mm). Abbiamo acquisito un totale di 150 punti in 10 minuti di tempo. Raccolta di immagini è preceduto da 4 scansioni fittizio per consentire equilibrio del segnale fMRI. Minore è la TE riduce gli artefatti di suscettibilità. Il TR relativamente lungo consente una copertura intero cervello ad alta risoluzione spaziale. </li></ol> Parte 5: Il localizzatore iniziale e scansioni anatomiche <ol><li> Prima delle analisi funzionale con l&#39;agopuntura sono gestiti, una scansione localizzatore, una scansione ad alta risoluzione anatomica, e il T1 ponderata 3D MP-RAGE sono acquisiti per assicurare un corretto posizionamento e la solidità anatomica. Osservazione generale a questo punto posso assicurare che le scansioni non necessarie non vengono eseguiti. Il localizzatore, una scansione molto breve, assicura che l&#39;intero cervello è incluso nella scansione e ti permette di linea in su con l&#39;AC-PC linea. Se ci sono delle anomalie sospette, i ricercatori invierà le immagini in un formato radiologo ma non dovrebbe alcun diritto sui quali è la scansione soggetti. </li><li> La scansione iniziale di circa 20 minuti totali. Visualizzazione breve può dire se il ricercatore sarà utile per continuare la scansione. Questo è un buon momento per parlare con il soggetto e assicurarsi che siano ancora comodo e non ha riscontrato un effetto negativo di essere nel magnete. </li></ol> Parte 6: L&#39;agopuntura con monitoraggio fMRI Delle due forme di trattamento (manipolazione aghi manuale e stimolazione elettrica), il video sarà limitata a manuale di agopuntura, che ha una storia molto più lunga di uso clinico. Stimolazione agopuntura viene somministrato in cicli duplicato agopunti classici LI4 invece, LV3 sul piede o ST36 sulla gamba, impiegando sterile, una volta utilizzare solo aghi per agopuntura. <ol><li> Istruire i soggetti a rilassarsi, tenere gli occhi chiusi e astenersi da movimenti durante la scansione. Per evitare la stimolazione nociva, di uno specifico istruire il soggetto a sollevare un dito se una delle sensazioni che l&#39;agopuntura si avvicina a un punteggio di 8, e alzare due dita in caso di dolore acuto di qualsiasi grado. </li><li> Dopo aver inserito il, pretest sensibilità l&#39;ago del soggetto e la tolleranza di manipolazione aghi per scegliere la profondità di inserimento e la forza di manipolazione per la raccolta dati. </li><li> Durante i 10 minuti di imaging funzionale, l&#39;ago viene ruotato per 2 minuti durante la M1 e M2, e lasciati sul posto durante i periodi di riposo R1 (2min)), R2 (3 minuti), R3 (1 min). L&#39;agopuntore si assicura di non avvicinarsi o lasciare il soggetto direttamente prima o dopo il periodo di stimolazione, come anche che il movimento potrebbero influenzare i risultati. (Paradigma, Fig. 1) <img src="/files/ftp_upload/1190/1190fig1.n.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Agopuntura Paradigma fMRI. </li><li> Al completamento della stimolazione agopuntura, l&#39;agopuntore registra la forza con cui l&#39;ago resiste manipolazione. Alla fine di ogni scansione, un altro investigatore personale chiede al soggetto di grado le sensazioni provate su una scala da 1-10. La lista, dolore, fastidio, pressione, pienezza, pesantezza, intorpidimento, formicolio, dolore sordo, il dolore acuto, si basa sull&#39;esperienza della comunità agopuntore e precedenti dati sperimentali piuttosto che questionari dolore nella letteratura. La risposta psico-fisica è classificato come un tipico gruppo deqi e un altro gruppo di deqi mescolato con dolore acuto sulla base di questi record. </li><li> Parla con i soggetti tra le scansioni per assicurarsi che stare tranquillo e stare svegli. Se una qualsiasi parte del loro corpo comincia a crampi o sentire a disagio, il personale di ricerca in loco dovrebbero adottare misure appropriate per alleviare il disagio. Movimenti generati dal soggetto potrebbe causare la corruzione dei dati. Soggetti occasionali possono addormentarsi durante la scansione, che possa modificare la risposta emodinamica. </li></ol> Parte 7: Elaborazione Dati <ol><li> Più livelli di analisi possono essere eseguite. Un modello lineare generale utilizza periodi di riposo come base per determinare la variazione del segnale BOLD% MR ad ogni voxel del cervello durante il compito. Determina inoltre la significatività statistica di questi cambiamenti e rimuove i dati BOLD che non raggiungono il 3 voxel contigue di uno specifico valore-p. </li><li> Eseguire seme analisi basata croce di correlazione per mostrare la connettività funzionale tra una regione neurologici e il resto del cervello. Questo viene fatto selezionando una delle regioni di riferimento e confrontando il suo tempo portate con quella di ogni voxel altri nel cervello. Altre analisi, come analisi delle componenti indipendenti, analisi dei cluster fuzzy, modelli di equazioni strutturali, causalità Granger può essere applicata. </li><li> Dati fisiologici possonoessere analizzati da una media di risposta entro le finestre relative alla stimolazione aghi dell&#39;agopuntura. Per esempio, i dati ECG può essere commentato per tempi complessi QRS seguita da analisi della frequenza cardiaca e variabilità della frequenza cardiaca. </li></ol> Parte 8: Risultati <img src="/files/ftp_upload/1190/1190fig2.n.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Risposta emodinamica in agopuntura vs deqi stimolazione tattile a destra LI4, ST36 e LV3 (52 runs/37 soggetti). I grappoli di strutture disattivato l&#39;mPFC (corteccia prefrontale mediale) (1), MPC (corteccia parietale mediale) (2), MTL (mediale del lobo temporale) (3), erano più importanti in agopuntura (Fig. A) che in stimolazione tattile (Fig. B). Disattivazione estensiva del diritto BA22/21 (4) in agopuntura non è stata osservata nei stimolazione tattile. Il BA43 sensomotorio (5) e la corteccia associativa (6) ha mostrato più di attivazione nella stimolazione tattile che in agopuntura (non mostrato). È interessante notare che il diritto insula anteriore, (7) è stato attivato in agopuntura e non nella stimolazione tattile. (P &lt;0,0001). <img src="/files/ftp_upload/1190/1190fig3.n.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Deqi in risposta emodinamica (52 runs/37 soggetti) rispetto al deqi mescolato con dolore acuto (52 runs/29 soggetti) durante la stimolazione agopuntura a destra LI4, ST36 e LV3, La disattivazione di spicco del mPFC (1), MPC ( 2) e MTL (3) visto con dolore deqi assente (Fig. A) è stato attenuato in presenza di dolore (Fig. B). Con dolore, l&#39;attivazione della corteccia sensomotoria e associazione (4) è diventato più prominenti, e un sottoinsieme delle regioni limbiche e paralimbica come il MIDC / SMA (5), postC_BA23 (6), Amy (7), e verme cerebellare ( 8) diventa attivo. Il diritto insula anteriore (9) era marcatamente attivato in deqi mentre le più piccole aree di insula anteriore e posteriore (10) sono stati attivati ​​bilateralmente nel dolore. P &lt;0,0001. <img src="/files/ftp_upload/1190/1190fig4.n.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4 Sovrapposizione di limbico-paralimbica-neocorticale rete (LPNN) in agopuntura con la rete in modalità predefinita (DMN);. La risposta BOLD del LPNN da GLM analisi (Fig. A) e per modello senza fuzzy cluster analysis (Fig. B ) durante la stimolazione agopuntura a LI4, ST36 e LV3 mostrano modelli praticamente identici con il DMN (Fig.C, adattato da Shulman et al, 1997). Gruppi di regioni con riduzione del segnale coerente appaiono nella corteccia prefrontale mediale (1), postero-mediale della corteccia (2) e del lobo temporale (3). p &lt;0,0001.

<ol>
	<li>Hui, K. K. S., Liu, J., Marina, O., Napadow, V., Haselgrove, C., Kwong, K. K., Kennedy, D. N., Makris, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+integrated+response+of+the+human+cerebro-cerebellar+and+limbic+systems+to+acupuncture+stimulation+at+ST+36+as+evidenced+by+fMRI.">The integrated response of the human cerebro-cerebellar and limbic systems to acupuncture stimulation at ST 36 as evidenced by fMRI.</a> Neuroimage. 27 (3), 479-496 (2005).</li><li>Hui, K. K. S., Marina, O., Claunch, J. D., Nixon, E. E., Fang, J., Liu, J., Li, M., Napadow, V., Vangel, M., Makris, N., Chan, S. T., Kwong, K. K., Rosen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acupuncture+mobilizes+the+brain's+default+mode+and+its+anti-correlated+network+in+healthy+subjects.">Acupuncture mobilizes the brain's default mode and its anti-correlated network in healthy subjects.</a> Brain Res. 1287, 84-103 (2009).</li><li>Napadow, V., Dhond, R. P., Purdon, P., Kettner, N., Makris, N., Kwong, K. K., Hui, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+acupuncture+fMRI+in+the+human+brainstem+with+heart+rate+variability.">Correlating acupuncture fMRI in the human brainstem with heart rate variability.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 5, 4496-4499 (2005).</li><li>Shulman, G. L., Corbetta, M., Buckner, R. L., Raichle, M. E., Fiez, J. A., Miezin, F. M., Petersen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-down+modulation+of+early+sensory+cortex.">Top-down modulation of early sensory cortex.</a> Cereb. Cortex. 7 (3), 193-206 (1997).</li></ol>

L&#39;impiego di tecniche appropriate, l&#39;esperienza del agopuntore e un campione di grandi dimensioni per consentire la separazione dagli effetti confondenti di involontarie stimolazione nociva sono importanti per l&#39;acquisizione e l&#39;interpretazione dei dati fMRI agopuntura. I nostri studi di diversi punti di agopuntura classica, indicano che l&#39;agopuntura modula la rete limbico, un importante sistema di regolazione intrinseca del cervello umano. La rete mostra una significativa sovrapposizione con la moda...

monitoring acupuncture effects on human brain by fmri

Risonanza magnetica funzionale è utilizzato per studiare gli effetti dell&#39;agopuntura sulla risposta BOLD e la connettività funzionale del cervello umano. Risultati dimostrano che l&#39;agopuntura mobilita un limbico-paralimbica-neocorticale rete e le sue proprietà anti-correlato sensomotorio / paralimbica rete a più livelli del cervello e che la risposta emodinamica è influenzato dalla risposta psico-fisico. Monitoraggio fisiologico possono essere eseguite per esplorare la risposta periferica della funzione nervoso autonomo. Questo video descrive gli studi eseguiti a LI4 (hegu), ST36 (zusanli) e LV3 (taichong), agopunti classici che sono comunemente usati per le azioni di modulazione e riduzione del dolore. Alcuni problemi che richiedono attenzione nelle applicazioni della risonanza magnetica funzionale all&#39;indagine agopuntura sono noti.

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Monitoring Acupuncture Effects on Human Brain by fMRI

Monitoraggio FMRI e fisiologico è usato per studiare gli effetti di Agopuntura sul sistema nervoso centrale e periferico. Agopuntura mobilita un limbico-paralimbica-neocorticale rete, con notevole sovrapposizione con la rete in modalità di default, a modulare l&#39;attività neurologica, forse in relazione al suo effetto autonomo nel sistema nervoso periferico.

Agopuntura Effetti monitoraggio cervello umano da fMRI

Functional MRI is used to study the effects of acupuncture on the BOLD response and the functional connectivity of the human brain.  Results demonstrate ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.3K Views.  Massachusetts General Hospital and Harvard Medical School. Monitoraggio FMRI e fisiologico è usato per studiare gli effetti di Agopuntura sul sistema nervoso centrale e periferico. Agopuntura mobilita un limbico-paralimbica-neocorticale rete, con notevole sovrapposizione con la rete in modalità di default, a modulare l'attività neurologica, forse in relazione al suo effetto autonomo nel sistema nervoso periferico.

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Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Studi genetici di proteine ​​umane di riparazione del DNA Utilizzando lievito come sistema modello

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Ricerca

Biologia

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

Analizzando la funzione di GTPasi Small Microiniezione di plasmidi in cellule epiteliali polarizzate

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Mapping the After-effects of Theta Burst Stimulation on the Human Auditory Cortex with Functional Imaging

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent progress, the functional properties and lateralization of the human auditory cortex are far from being fully understood. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) is a non-invasive technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability via the application of localized magnetic field pulses, and represents a unique method of exploring plasticity and connectivity. It has only recently begun to be applied to understand auditory cortical function 2. 
An important issue in using TMS is that the physiological consequences of the stimulation are difficult to establish. Although many TMS studies make the implicit assumption that the area targeted by the coil is the area affected, this need not be the case, particularly for complex cognitive functions which depend on interactions across many brain regions 3. One solution to this problem is to combine TMS with functional Magnetic resonance imaging (fMRI). The idea here is that fMRI will provide an index of changes in brain activity associated with TMS. Thus, fMRI would give an independent means of assessing which areas are affected by TMS and how they are modulated 4. In addition, fMRI allows the assessment of functional connectivity, which represents a measure of the temporal coupling between distant regions. It can thus be useful not only to measure the net activity modulation induced by TMS in given locations, but also the degree to which the network properties are affected by TMS, via any observed changes in functional connectivity.
Different approaches exist to combine TMS and functional imaging according to the temporal order of the methods. Functional MRI can be applied before, during, after, or both before and after TMS. Recently, some studies interleaved TMS and fMRI in order to provide online mapping of the functional changes induced by TMS 5-7. However, this online combination has many technical problems, including the static artifacts resulting from the presence of the TMS coil in the scanner room, or the effects of TMS pulses on the process of MR image formation. But more importantly, the loud acoustic noise induced by TMS (increased compared with standard use because of the resonance of the scanner bore) and the increased TMS coil vibrations (caused by the strong mechanical forces due to the static magnetic field of the MR scanner) constitute a crucial problem when studying auditory processing. 
This is one reason why fMRI was carried out before and after TMS in the present study. Similar approaches have been used to target the motor cortex 8,9, premotor cortex 10, primary somatosensory cortex 11,12 and language-related areas 13, but so far no combined TMS-fMRI study has investigated the auditory cortex. The purpose of this article is to provide details concerning the protocol and considerations necessary to successfully combine these two neuroscientific tools to investigate auditory processing. 
Previously we showed that repetitive TMS (rTMS) at high and low frequencies (resp. 10 Hz and 1 Hz) applied over the auditory cortex modulated response time (RT) in a melody discrimination task 2. We also showed that RT modulation was correlated with functional connectivity in the auditory network assessed using fMRI: the higher the functional connectivity between left and right auditory cortices during task performance, the higher the facilitatory effect (i.e. decreased RT) observed with rTMS. However those findings were mainly correlational, as fMRI was performed before rTMS. Here, fMRI was carried out before and immediately after TMS to provide direct measures of the functional organization of the auditory cortex, and more specifically of the plastic reorganization of the auditory neural network occurring after the neural intervention provided by TMS. 
Combined fMRI and TMS applied over the auditory cortex should enable a better understanding of brain mechanisms of auditory processing, providing physiological information about functional effects of TMS. This knowledge could be useful for many cognitive neuroscience applications, as well as for optimizing therapeutic applications of TMS, particularly in auditory-related disorders.

Auditory processing is the basis of speech and music-related processing. Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) has been used successfully to study cognitive, sensory and motor systems but has rarely been applied to audition. Here we investigated TMS combined with functional Magnetic Resonance Imaging to understand the functional organization of auditory cortex.

Mappatura delle postumi di Theta Burst stimolazione sulla corteccia uditiva umana con imaging funzionale

Auditory cortex pertains to the processing of sound, which is at the basis of speech or music-related processing1. However, despite considerable recent ...

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific shapes. Drosophila tracheal terminal cells have become a powerful genetic model to identify and elucidate the roles of genes required for generating cellular morphologies. Terminal cells are a component of a branched tubular network, the tracheal system that functions to supply oxygen to internal tissues. Terminal cells are an excellent model for investigating questions of cell shape as they possess two distinct cellular architectures. First, terminal cells have an elaborate branched morphology, similar to complex neurons; second, terminal cell branches are formed as thin tubes and contain a membrane-bound intracellular lumen. Quantitative analysis of terminal cell branch number, branch organization and individual branch shape, can be used to provide information about the role of specific genetic mechanisms in the making of a branched cell. Analysis of tube formation in these cells can reveal conserved mechanisms of tubulogenesis common to other tubular networks, such as the vertebrate vasculature. Here we describe techniques that can be used to rapidly fix, image, and analyze both branching patterns and tube formation in terminal cells within Drosophila larvae. These techniques can be used to analyze terminal cells in wild-type and mutant animals, or genetic mosaics. Because of the high efficiency of this protocol, it is also well suited for genetic, RNAi-based, or drug screens in the Drosophila tracheal system.

Examination of Drosophila Larval Tracheal Terminal Cells by Light Microscopy

Here, we present a method for light microscopy analysis of tracheal terminal cells in Drosophila larvae. This method allows for quick examination of branch and lumen morphology in whole animals and would be useful for analysis of individual mutants or screens for mutations affecting terminal cell development.

Esame della<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvali tracheali Terminal cellule al microscopio ottico

Cell shape is critical for cell function. However, despite the importance of cell morphology, little is known about how individual cells generate specific ...

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of central nervous system injuries in vivo, possibly by reducing oxidative stress. However, effects of R/NIR-LT on oxidative stress have been shown to vary depending on wavelength or intensity of irradiation. Studies comparing treatment parameters are lacking, due to absence of commercially available devices that deliver multiple wavelengths or intensities, suitable for high through-put in vitro optimization studies. This protocol describes a technique for delivery of light at a range of wavelengths and intensities to optimize therapeutic doses required for a given injury model. We hypothesized that a method of delivering light, in which wavelength and intensity parameters could easily be altered, could facilitate determination of an optimal dose of R/NIR-LT for reducing reactive oxygen species (ROS) in vitro.
Non-coherent Xenon light was filtered through narrow-band interference filters to deliver varying wavelengths (center wavelengths of 440, 550, 670 and 810nm) and fluences (8.5 x 10-3 to 3.8 x 10-1 J/cm2) of light to cultured cells. Light output from the apparatus was calibrated to emit therapeutically relevant, equal quantal doses of light at each wavelength. Reactive species were detected in glutamate stressed cells treated with the light, using DCFH-DA and H2O2 sensitive fluorescent dyes.&#160;
We successfully delivered light at a range of physiologically and therapeutically relevant wavelengths and intensities, to cultured cells exposed to glutamate as a model of CNS injury. While the fluences of R/NIR-LT used in the current study did not exert an effect on ROS generated by the cultured cells, the method of light delivery is applicable to other systems including isolated mitochondria or more physiologically relevant organotypic slice culture models, and could be used to assess effects on a range of outcome measures of oxidative metabolism.

Method for the Assessment of Effects of a Range of Wavelengths and Intensities of Red/near-infrared Light Therapy on Oxidative Stress In Vitro

Non-coherent Xenon light was passed through narrow-band interference and neutral density filters to deliver light of varying wavelength and intensity to cultured cells. This protocol was used to assess the effects of red/near-infrared light therapy on production of reactive species in vitro: no effects were observed using the tested parameters.

Metodo per la valutazione degli effetti di un intervallo di lunghezze d&#39;onda e intensità di / vicino-infrarosso di terapia della luce rossa sullo stress ossidativo<em&gt; In Vitro</em

Red/near-infrared light therapy (R/NIR-LT), delivered by laser or light emitting diode (LED), improves functional and morphological outcomes in a range of ...

Methods for Comparing Nutrients in Beebread Made by Africanized and European Honey Bees and the Effects on Hemolymph Protein Titers

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees collect and convert to beebread by placing colonies in a specially constructed enclosed flight area. Methods were developed to analyze the protein and amino acid composition of the pollen and beebread. We also describe how consumption of the beebread was measured and methods used to determine adult worker bee hemolymph protein titers after feeding on beebread for 4, 7 and 11 days after emergence. Methods were applied to determine if genotype affects the conversion of pollen to beebread and the rate that bees consume and acquire protein from it. Two subspecies (European and Africanized honey bees; EHB and AHB respectively) were provided with the same pollen source. Based on the developed methods, beebread made by both subspecies had lower protein concentrations and pH values than the pollen. In general, amino acid concentrations in beebread made by either EHB or AHB were similar and occurred at higher levels in beebread than in pollen. Both AHB and EHB consumed significantly more of the beebread made by AHB than by EHB. Though EHB and AHB consumed similar amounts of each type of beebread, hemolymph protein concentrations in AHB were higher than in EHB. Differences in protein acquisition between AHB and EHB might reflect environmental adaptations related to the geographic region where each subspecies evolved. These differences could contribute to the successful establishment of AHB populations in the New World because of the effects on brood rearing and colony growth.

Here are methods to quantify nutrients in pollen before and after its conversion to beebread by two subspecies of honeybees. We describe techniques to measure beebread consumption and resulting protein titers in both subspecies.

Metodi per confrontare nutrienti in beebread Made by africanizzate e miele europeo api e gli effetti sulla I titoli emolinfa Protein

Honey bees obtain nutrients from pollen they collect and store in the hive as beebread. We developed methods to control the pollen source that bees ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

La quantificazione di adesività delle cellule endoteliali<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic levels. Tight control over ER calcium is imperative for protein folding, modification and trafficking. Perturbations to ER calcium can result in the activation of the unfolded protein response, a three-prong ER stress response mechanism, and contribute to pathogenesis in a variety of diseases. The ability to monitor ER calcium alterations during disease onset and progression is important in principle, yet challenging in practice. Currently available methods for monitoring ER calcium, such as calcium-dependent fluorescent dyes and proteins, have provided insight into ER calcium dynamics in cells, however these tools are not well suited for in vivo studies. Our lab has demonstrated that a modification to the carboxy-terminus of Gaussia luciferase confers secretion of the reporter in response to ER calcium depletion. The methods for using a luciferase based, secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) for in vitro and in vivo applications are described herein. This video highlights hepatic injections, pharmacological manipulation of GLuc-SERCaMP, blood collection and processing, and assay parameters for longitudinal monitoring of ER calcium.

Monitoring Endoplasmic Reticulum Calcium Homeostasis Using a Gaussia Luciferase SERCaMP

Endoplasmic reticulum calcium homeostasis is disrupted in diverse pathologies. A secreted ER calcium monitoring protein (SERCaMP) reporter can be used to detect disruptions in the ER calcium store. This protocol describes the use of a Gaussia luciferase SERCaMP to examine ER calcium homeostasis in vitro and in vivo.

Monitoraggio reticolo endoplasmatico calcio omeostasi Utilizzando un<em&gt; Gaussia</em&gt; Luciferasi SERCaMP

The endoplasmic reticulum (ER) contains the highest level of intracellular calcium, with concentrations approximately 5,000-fold greater than cytoplasmic ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

L&#39;isolamento di regioni genomiche specifici e l&#39;identificazione di molecole da Associated enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, corticotrophin releasing hormone (CRH) is released from the hypothalamus in the brain. This stimulates the release of adrenocorticotrophic hormone (ACTH) from the pituitary gland, which in turn stimulates release of glucocorticoids from the adrenal gland. In horses the glucocorticoid corticosterone is responsible for several adaptations needed to support equine flight behaviour and subsequent removal from the aversive situation. Corticosterone metabolites can be detected in the feces of horses and assessment offers a non-invasive option to evaluate long term patterns of adrenal activity. Fecal assessment offers advantages over other techniques that monitor adrenal activity including blood plasma and saliva analysis. The non-invasive nature of the method avoids sampling stress which can confound results. It also allows the opportunity for repeated sampling over time and is ideal for studies in free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay (EIA) used to assess feces for corticosterone, in addition to the associated biochemical validation.

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. The method offers a non-invasive option to assess long term patterns in both domestic and free ranging horses. This protocol describes the enzyme linked immunoassay involved and the associated biochemical validation.

Fecale Analisi glucocorticoidi: non invasivo di monitoraggio surrenale in equidi

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

Methods Article

Agopuntura Effetti monitoraggio cervello umano da fMRI