בהכרת תודה אנו מודים תמיכה BHR דרך גרנט דיסקברי וכן כלי מחקר גרנט כלי מן למדעי הטבע וההנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC). אנחנו גם מכירים את ה אודה תסיסנית Bloomington המניות המרכז מתן מניות גנטי ששימשו את רצפי למשל לחיות הדמיה.

הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף עוברים על מיץ ענבים רגיל צלחות אגר 4. זה נוח להשתמש אוטומטית תסיסנית ביצה אספן (Flymax ציוד מדעי בע&quot;מ). שימוש סינכרוני מבוים אוספים העובר יהיה להפחית את מספר dechorionations כי יש לבצע כדי להשיג מספרי נאותה של עוברים בשלב ההתפתחותי הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שקופית dechorionation ידי הצמדת נייר דבק דו צדדית לשקופית מיקרוסקופ; להסיר את הגיבוי מהקלטת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו את חדר הדמיה חיים על ידי חיתוך פיסת רקמה להשתלב היטב את החדר. מניחים את הרקמה הבאר רטוב עם מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Halocarbon מערבבים שמן (Halocarbon מוצרים קורפ) צמיגות סדרה 700 ו סדרה 56 ביחס של 1:01. התערובת ניתן לאחסן ולהשתמש בהם ללא הגבלת זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כמה טיפות קטנות של שמן halocarbon על פני השטח של coverslip (22 X 40 מ&quot;מ, מס &#39;2). הנפח לא קריטי אבל צריך להיות בסדר גודל של μl 20-40. </li></ol> נוהל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת stereomicroscope, לאסוף עוברים מן מיץ ענבים צלחות אגר או באמצעות זוג מלקחיים של צורף (מס &#39;5) או מברשת צבע יפה מאוד. עוברים נוטים להיצמד זה לזה טיפים של מלקחיים, הם התכנסו בקלות גושים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת stereomicroscope, בעדינות להוריד את גושי עוברים שיש להם דבק בקצות מלקחיים על פני השטח של הסרט בשקופית dechorionation. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוב באמצעות stereomicroscope, בעדינות דחיפה או שבץ עוברי עם הצד של מלקחיים על מנת לפרוץ את סיסית דונגי החיצוני ללא פקיעת הקרום הפנימי vitelline (העובר יתפוצץ אם קרום vitelline מקרע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סיסית החיצוני כבר מקרע, להקניט את העובר מן סיסית, העובר dechorionated נוטה לדבוק פני השטח של מלקחיים. תשמרי על עצמך כדי להימנע מלגעת העובר dechorionated לפני השטח של הסרט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע העובר הוא dechorionated, במהירות ולהעביר אותו עד טיפת הכין בעבר שמן halocarbon על coverslip. מגע קצה של מלקחיים נושאת את העובר dechorionated אל פני השטח של טיפת שמן halocarbon - זו מזיזה את העובר מן מלקחיים לתוך השמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אישור העברה של העובר עד טיפת שמן. ניתן לעשות זאת בעין בלתי מזוינת ובלבד שאתה עובד על רקע שחור להשתמש במקור סיבים אופטיים תאורה להגדיר בזווית אלכסונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שתנסה dechorionate אחר העובר, לנקות שמן מלקחיים. מלקחיים מצופה בשמן יש לרכוש פחות על פני השטח סיסית, מה שהופך dechorionation קשה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברים Dechorionated הם קליל בשמן halocarbon. באמצעות מלקחיים או מכחול תוך צפייה דרך stereomicroscope, לדחוף את העובר אל החלק התחתון של טיפת שמן ומסדרים אותו למיקום הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהר להפוך את coverslip מעל הבאר של החדר הדמיה לחיות. ודא העוברים נחים נגד coverslip בכיוון הרצוי. בשל הציפה שלהם בשמן, העוברים כעת לצוף על פני השטח התחתון של coverslip. תקן את coverslip לחדר הדמיה לחיות עם הקלטת. לאוורר את החדר על ידי חיתוך חורים הקלטת באזור שבו הקלטת משתרע על פני הפער בין סוף coverslip ואת הקצה של הבאר של החדר הדמיה לחיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף או stereomicroscope הקרינה כעת ניתן להשתמש לתמונה עוברים. </li></ol>

<ol>
	<li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila.">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J. Cell Biol. 149, 471-490 (2000).</li><li>Schock, F., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+processes+associated+with+germ+band+retraction+in.">Cellular processes associated with germ band retraction in.</a> , 248-2429 (2002).</li><li>Reed, B. H., Wilk, R., Schock, F., Lipshitz, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin-dependent+apposition+of+Drosophila+extraembryonic+membranes+promotes+morphogenesis+and+prevents+anoikis.">Integrin-dependent apposition of Drosophila extraembryonic membranes promotes morphogenesis and prevents anoikis.</a> Curr. Biol. 14, 372-380 (2004).</li><li>Wieschaus, E. p., Nusslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila: a practical approach. , 199-227 (1986).</li></ol>

אנו מתארים שיטה חדשה להכנת עוברים תסיסנית לניתוח הדמיה לחיות, שאנו מכנים את פרוטוקול ירידה תלוי. למרבה הצער, לא ניתן להשתמש בפרוטוקול ירידה תלוי אם עובדים עם מיקרוסקופ הפוכה. במקרה זה הטכניקה הרבדה (כפי שתואר לעיל מופשט) יש להשתמש דחיסה של עוברים שרידים דאגה. בניסויים שבהם צורת התא ואת גודל נמדדים על מנת לחשב את הכוחות הקשורים לתנועת המוךפו&quot;גנטי שהולך, שימוש במיקרוסקופ זקוף פרוטוקול טיפה תלויה היא בגלל דחיסה עדיפה על העובר מופחת. כמו כן, דחיסה מופחת לעובר באמצעות פרוטוקול ירידה תלוי יש תוצאה של הצגת משטח עגול, מעוותת של העובר בעוד טכניקה הרבדה מציג משטח שטוח. בעת שימוש מיקרוסקופיה confocal היא, אם כן, יש צורך לאסוף רחבה Z-מחסנית (פרוסות יותר לכל מחסנית) כאשר באמצעות פרוטוקול ירידה לעומת תלוי בשיטת הרבדה. מספר גדל של פרוסות לכל מחסנית-Z, לעומת זאת, עליות זמן הרכישה וכן רעילות תמונה או צילום הלבנת הקשורים עירור הלייזר. ברור לטובת הניסוי קשור דחיסה מופחת היא לקזז במקצת על ידי עלייה Z-מחסנית פעמים הרכישה. למרות הגידול הזה בזמן Z-מחסנית הרכישה, עם זאת, ראינו הכדאיות מעולה של עוברים באמצעות פרוטוקול ירידה תלוי. פרוטוקול הירידה תלוי מוגבל גם תצפית של העוברים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, שבו נתיב האור של האירוע האור הנפלט אינו עובר תא חי הדמיה. Live-דימות באמצעות מיקרוסקופ עוברים DIC או אחרים שאינם אופטיקה הקרינה ניתן להשיג על ידי שינוי התא החי הדמיה כדי לאפשר נתיב האור הקבל דרך העובר על תנאי. חשש בעת שימוש בטכניקה ירידה תלוי יכול להיות תנועה לא רצויה או &quot;מרחפים&quot; של העוברים בשדה הראייה במהלך הרכישה timelapse. כאשר צף כנגד התחתון של coverslip הפוכה, אנו מוצאים כי העוברים הם להפליא יציבה לא שינוי המיקום בעת שימוש או יבש או טבילה מטרות שמן. Multipoint רכישת timelapse באמצעות מיקרוסקופ ממונע הבמה גם לא לשבש את העמדות של עוברים, כי הם מוכנים באמצעות פרוטוקול ירידה תלוי. כל תנועה של עוברים מוכן באמצעות טכניקה ירידה תלוי ניתן למנוע על ידי צמצום גודלו של טיפת שמן halocarbon ולהבטיח כי טיפות שמן נפרדים אינם פיוזינג או הפתילה בשולי חיים הדמיה קאמרית בסדר.

ציוד סטנדרטי החומרים הדרושים כדי להכין עוברים לחיות הדמיה באמצעות פרוטוקול ירידה תלוי כוללים את הפריטים הבאים: שקופיות מיקרוסקופ, coverslips (22 x 40 מ&quot;מ, מס &#39;2), פעמיים צדדי קלטת, מלקחיים של צורף (דומון סגנון מס&#39; 5 ), שמן halocarbon סדרה 56 סדרה 700 (Halocarbon מוצרים קורפ), סכין או כלי להב חד כתער קצה, נייר, מספריים, מים מזוקקים, הקלטת למטרות כלליות, וכן pipet מתאים ומספק μl 20-40. פרוטוקול הדמיה לחיות גם דורש קאמרית מחוייט הדמיה לחיות. זה הוכן על ידי קיצוץ של 5 מ&quot;מ חושב גיליון פלסטיק פוליקרבונט לממדי שקופיות מיקרוסקופ רגיל (75 X 25 מ&quot;מ) באמצעות הרוטור ליצירת דיכאון עמוק 3mm בשקופית (20 X 55 מ&quot;מ). גישה stereomicroscope (לנתח מיקרוסקופ) ומקור סיבים אופטיים תאורה נדרשת גם.

the preparation of drosophila embryos for live-imaging using the hanging drop protocol

חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מבוססי timelapse לחיות הדמיה היא טכניקה רבת עוצמה ללימוד תקנה הגנטי של תהליכים דינמיים כגון המורפוגנזה רקמות, תאים תאים הידבקות, או מוות של תאים. עוברים תסיסנית להביע GFP הם צילמו בקלות או באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופי או confocal. המטרה של כל פרוטוקול לחיות הדמיה היא למזער השפעות מזיקות כגון התייבשות היפוקסיה. פרוטוקולים קודמים להכנת עוברים תסיסנית לניתוח לחיות הדמיה יש מעורב הצבת עוברים dechorionated בשמן halocarbon ו הרבדה אותם בין halocarbon גז קרום חדיר ו coverslip<sup&gt; 1-3</sup&gt;. המבוא של דחיסה באמצעות עוברים גובר בצורה זו מהווה סיבוך בלתי רצויות לניתוח biomechanical מבוססי כל המורפוגנזה. השיטה שלנו, שאנו מכנים את פרוטוקול ירידה תלוי, תוצאות מצוינות הכדאיות של עוברים בזמן ההדמיה לחיות ואינו דורש כי עוברים להיות דחוס. בקצרה, את פרוטוקול ירידה תלוי מערבת את המיקום של עוברים בטיפת שמן halocarbon כי הוא הושעה coverslip, שהוא, בתורו, קבוע בעמדה מעל חדר לח. בנוסף לאספקת חילוף הגזים ומניעת התייבשות, הסדר זה מנצל את כושר הציפה של העוברים בשמן halocarbon כדי למנוע מהם נסחף מתוך עמדה במהלך הרכישה timelapse. וידאו זה מתאר בפירוט כיצד לאסוף ולהכין עוברים תסיסנית הדמיה לחיות באמצעות פרוטוקול ירידה תלוי. פרוטוקול זה מתאים עוברים הדמיה dechorionated באמצעות stereomicroscopy או מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף המתחם.

Watch this Scientific Journal Video about The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol at JoVE.com

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

שיטה פשוטה, זולה, יעילה של הכנת עוברים תסיסנית לניתוח לחיות הדמיה מוצג. פרוטוקול שלנו מספק לחות חילוף הגזים ולא לדחוס את העובר תסיסנית. שיטה זו מתאימה עבור הדמיה GFP מבוססי לחיות עוברים תסיסנית באמצעות מיקרוסקופ stereomicroscope או תרכובת זקוף.

הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

the-preparation-drosophila-embryos-for-live-imaging-using-hanging

Google

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

15.0K Views.  University of Waterloo. שיטה פשוטה, זולה, יעילה של הכנת עוברים תסיסנית לניתוח לחיות הדמיה מוצג. פרוטוקול שלנו מספק לחות חילוף הגזים ולא לדחוס את העובר תסיסנית. שיטה זו מתאימה עבור הדמיה GFP מבוססי לחיות עוברים תסיסנית באמצעות מיקרוסקופ stereomicroscope או תרכובת זקוף.

Video: The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos and their dechorionation using bleach are demonstrated. Using a glass pipet attached to a mouth suction tube, we illustrate the removal of all cells from single embryos. The method for dispersing cells from each embyro into a small (5 l) drop of medium on an uncoated glass coverslip is demonstrated. A view through the microscope at 1 hour after plating illustrates the preferred cell density. Most of the cells that survive when grown in defined medium are neuroblasts that divide one or more times in culture before extending neuritic processes by 12-24 hours. A view through the microscope illustrates the level of neurite outgrowth and branching expected in a healthy culture at 2 days in vitro. The cultures are grown in a simple bicarbonate based defined medium, in a 5% CO2 incubator at 22-24&deg;C. Neuritic processes continue to elaborate over the first week in culture and when they make contact with neurites from neighboring cells they often form functional synaptic connections. Neurons in these cultures express voltage-gated sodium, calcium, and potassium channels and are electrically excitable. This culture system is useful for studying molecular genetic and environmental factors that regulate neuronal differentiation, excitability, and synapse formation/function.

This video demonstrates the preparation of primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. Views of live cultures show cells 1 hour after plating and differentiated neurons after 2 days of growth in a bicarbonate-based defined medium. The neurons are electrically excitable and form synaptic connections.

הכנת תרבויות העצבית מ Midgastrula עוברים שלב תסיסנית

This video illustrates the procedure for making primary neuronal cultures from midgastrula stage Drosophila embryos. The methods for collecting embryos ...

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either remain a stem cell or become another type of cell with a more specialized function, This promising of science is leading scientists to investigate the possibility of cell-based therapies to treat disease.

When culture in suspension without antidifferentiation factors, embryonic stem cells spontaneously differentiate and form three-dimensional multicellular aggregates. These cell aggregates are called embryoid bodies(EB). Hanging drop culture is a widely used EB formation induction method. The rounded bottom of hanging drop allows the aggregation of ES cells which can provide mES cells a good environment for forming EBs. The number of ES cells aggregatied in a hanging drop can be controlled by varying the number of cells in the initial cell suspension to be hung as a drop from the lid of Petri dish. Using this method we can reproducibly form homogeneous EBs from a predetermined number of ES cells. 

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem mES Cells Using the Hanging Drop Method

This video demonstrates how to conduct in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells to embryoid bodies using the hanging drop method.

בשנת בידול במבחנה של עכבר גזע עובריים (MES) תאים שימוש בשיטה Drop Hanging

Stem cells have the remarkable potential to develop into many different cell types. When a stem cell divides, each new cell has the potential to either ...

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

חיים הדמיה של המוח על ידי עוברי דג הזברה מיקרוסקופיה confocal

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

הכנת הפרט תסיסנית ביצה צ&#39;יימברס הדמיה חיים

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

העגבניות / GFP-FLP / FRT שיטת ההדמיה חיה של פסיפס למבוגרים בלבד<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאי קולטי אור

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...