עבודה זו נתמכה על ידי מענק GM096076 מתכנית AREA-NIH.

1. הכנת זבובים לנתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדם זבובים בריאים של גנוטיפ הרצוי (לדוגמה, מבטא חלבון ה-GFP שכותרת-) שהם פחות משבוע ישן. בחר 10-15 נקבות גדולות עם בטן בצבע שמנת מעוגלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את הזבובים הנבחרים וכמה (3-5) זכרים לבקבוקון המכיל מזון קל yeasted חדש ולאפשר את הזבובים להשמין במשך ימים ב 25 ° C. עיין וייל ואח&#39;. 6 לפרטים של הכנת דרוזופילה. פיטום הזבובים מבטיחים כי מגוון שלבים, במיוחד שלבים 8-12, יהיה זמין להדמיה. פטם גרוע או unfattened טס בדרך כלל מכיל רק שלבים מוקדמים מאוד (1-6) ו( שלב 14) ביציות בשלות. </li></ol> 2. הכנה של ביציות לדימות באמצעות מיקרוסקופ מתחם זקוף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שקופית זכוכית רגילה ידי הדבקת 2 coverslips לשקופית, מלבד כ 1 סנטימטר, באמצעות greas סיליקוןדואר. השתמש רק בגריז מספיק כדי להבטיח איטום טוב בין coverslip והשקופיות. לחיצה כלפי מטה בחוזקה בכל coverslip תתפשט הגריז דק ואחיד. הוסף מעט שמן halocarbon 27 (Sigma) לצומת בין coverslips והשקופיות. הם ישמשו כמפרידים כדי למנוע פציעת ביציות מבודדות בשלבים הבאים. המספר 1.5 coverslips עובד היטב, עם עובי ממוצע (0.16-0.18 מ&quot;מ) שתואם לזה של ביציות בשלב מאוחרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 2-3 טיפין של שמן halocarbon 27 על פני השטח של 2 מ&quot;מ coverslip 22. כדי לקבל את הביציות הבריאות ביותר האפשריות, נשי פרטית יוסר מבקבוקון המזון באמצעות pipetting פה והונח בעדינות לתוך שמן halocarbon בלי ההרדמה ראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחי מנתחים חדים (כגון דומון # 5), להצמיד את הזבוב נגד coverslip ולמשוך את קצה הבטן. הסר את השחלות על ידי גרירתם על פני השטח של coverslip, תחת השמן. זו תקדם adhesion של הביציות לcoverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להקניט מלבד שחלות, מחפש ביציות כי הם לפחות 10B השלב oogenesis. ביציות בשלב זה ניתן לזהות על ידי מחפש תאי ביצה שבביצית מעסיקה לפחות 50-60% מהנפח הכולל של תא הביצה. בנקודה זו בoogenesis, את תאי הזקיק המונחים על הביצית הפכו עמודים, ומקיפים את הביצית מכל צדדיו, פרט לאזור קטן שבו חיבורים לתאי האחות יישארו. השתמש במלקחיים כדי להסיר ביציות בודדות מנדן ovariole. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך, באמצעות 1-3 נקבות, עד 5-8 ביציות שלא נפגעו היו מבודדות על coverslip. הסר את כל רקמת unuseable. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות להפוך coverslip המכיל את הביציות לשקופית המוכנה מראש כדי שהביציות מוצבות בין שני מפרידים. אל תלחץ על coverslip ההפוך כמו שיפגע בביציות. במידת צורך, להוסיף כמות קטנה של שמן לhalocarbon tהוא הקצוות של &quot;הכריך&quot; כדי להבטיח את המקום מלאים. (אופציונלי:. בוא שקופית מנוחה לכמה דקות כדי לאפשר ליישוב של coverslip) השקופיות מוכנות כעת להדמיה. </li></ol> 3. הכנה של ביציות לדימות באמצעות מיקרוסקופ מתחם הפוך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביציות הם נתחו למעשה כאמורים בסעיף 2, פרט לכך שצלחות פטרי הקטנות עם הוספת תחתית זכוכית (מאטק, 35 מ&quot;מ) משמשות במקום coverslips. מיותר כדי לכסות את הדגימה, ולאחר נתיחה, רקמה יכולה להיות צלמה ישירות בכלים, אבל יש להקפיד על מנת להבטיח את הביציות תישארנה מכוסית בשמן ואסור להתייבש. </li></ol> 4. חי הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא את הביצית אל מוקד באמצעות דסק&quot;ש או אופטיקה לעומת שלב ולבחון את הביצית לכל סימן של ניזק, כגון דליפה בציטופלסמה, או בולט של תאי זקיק. ביציות רק תמונה שמוצגות בריאים ולא ניזוקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Streaמינג ניתן לפקח באופן ישיר, ללא צורך בתיוג GFP, מאז שלפוחית ​​חלמון בציטופלסמה היא autofluorescent 7. אות זה יכול להיות שנתפסה בטווח של FITC ההיקף אך סביר להניח כי צורך בהגדרות רווח גבוהות יותר מאלה המשמשים לחלבוני ה-GFP שכותרת-. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> את התמונות הטובות ביותר של הזרמה מתקבלות מחלקים אופטיים שמתחת לפני השטח של הביצית שמונחת על זכוכית זכוכית coverslip / פטרי. הנה הביצית היא שטוחה מעט, מה שהופך למטוס טוב יותר מפוקוס. תמונות יכולות להיות שנתפסו ב200X - 1000 X. באמצעות ההסדר שתואר כאן, מטרות אוויריות צריכות לשמש, מאחר coverslip יוצר מחסום בין הביצית והאובייקטיבית. זה אופטימלי כי זה מאוד מצמצם סחף ותנועה של המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שאזור של עניין הוא בפוקוס, כבה את אופטיקה brighfield ולעבור להדמית confocal. השימוש בפונקציית הסריקה / תצוגה מקדימה המהירה של התוכנה, להתאים להתמקד ולהשיגבמידת צורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרות עבור לכידה תשתנינה ממיקרוסקופ למיקרוסקופ, אבל פרמטרים כלליים הם כדלקמן: השתמשו באורך גל עירור של 488 ננומטר ~ וגל פליטה של ​​~ 515 ננומטר. הגדר את ציר Z-לכידה כך שציר Z-נשאר קבוע, בפיגור של 10 שניות בין מסגרות. לכידת רצף מבחן המסגרות 5-10 כדי להבטיח הביצית היא נייחת והמטוס של מוקד הוא מתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף זמן פקיעה טיפוסי יהיה ללכוד בין 20-50 מסגרות, וניתן לסקור באופן מיידי לאחר השלים להעריך את איכות וידאו. התהליך ניתן לחזור לתאים אחרים בשקופית, או נקבות נוספות ניתן גזור לפי צורך. </li></ol> 5. פתרון בעיות ומשותפות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להיסחף - בעת שימוש במיקרוסקופ זקוף, תאים יכולים לעתים להיסחף בשל התפשטות של נפט. זו ניתן למזער באמצעות מספיק שמן רק כדי לכסות את השטח שמתחת לcoverslip. אם בעיות נמשכות, השתמש גרם סיליקון פחותrease למפרידים מדביקים על השקופית. </li></ol> הערה: חלק מחבילות תוכנת confocal לאפשר מעקב תא, אך באופן כללי, עדיף לזנוח את ההדמיה של ביציות נסחפו ובמקום להשתמש בפריט נוסף. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אין סימנים של זרימה - אם ההזרמה לא ברורה, סביר להניח בשל אחת משתי סיבות: או שמישור המיקוד ללכידת תמונה הם לא נכונים (בדרך כלל עמוק מדי לתוך הפנים של הביצית) או הביצית פגומה. זמן ותרגול יכולים למזער שתי טעויות. </li></ol>

<ol>
	<li>Becalska, A. N., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+up+mRNA+localization+in+Drosophila+oogenesis.">Lighting up mRNA localization in Drosophila oogenesis.</a> Dev. 136, 2493-2503 (2009).</li><li>He, L., Wang, X., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shining+light+on+Drosophila+oogenesis:+Live+imaging+of+egg+development.">Shining light on Drosophila oogenesis: Live imaging of egg development.</a> Curr. Opin. Gen. Dev. 21, 612-619 (2011).</li><li>King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ovarian development Drosophila melanogaster. , (1970).</li><li>Spradling, A. C., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+genetics+of+oogenesis.">Developmental genetics of oogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 1, 1-70 (1993).</li><li>Serbus, L. R., Cha, B. -. J., Theurkauf, W. E., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+and+the+actin+cytoskeleton+control+kinesin-driven+cytoplasmic+streaming+in+Drosophila+oocytes.">Dynein and the actin cytoskeleton control kinesin-driven cytoplasmic streaming in Drosophila oocytes.</a> Dev. 132, 3743-3752 (2005).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+Individual+Drosophila+Egg+Chambers+for+Live+Imaging.">Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (60), e3679 (2012).</li><li>Theurkauf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+microtubule-dependent+cytoplasmic+streaming+in+cappuccino+and+spire+mutant+oocytes.">Premature microtubule-dependent cytoplasmic streaming in cappuccino and spire mutant oocytes.</a> Science. 265, 2093-2096 (1998).</li><li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila.">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> PNAS. 98, 15050-15055 (2001).</li><li>R&#246;per, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rtnl1+is+enriched+in+a+specialized+germline+ER+that+associates+with+ribonucleoprotein+granule+components.">Rtnl1 is enriched in a specialized germline ER that associates with ribonucleoprotein granule components.</a> J. Cell Sci. 120, 1081-1092 (2007).</li><li>Pokrywka, N. J., Payne-Tobin, A., Raley-Susman, K. M., Swartzman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules,+the+ER+and+Exu:+New+associations+revealed+by+analysis+of+mini+spindles+mutations.">Microtubules, the ER and Exu: New associations revealed by analysis of mini spindles mutations.</a> Mech. Dev. 126, 289-300 (2009).</li><li>Petri, W. H., Mindrinos, M. N., Lombard, M. F., Margaritis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+the+Drosophila+chorion.ih+a+chemically+defined+organ+culture+medium.">In vitro development of the Drosophila chorion.ih a chemically defined organ culture medium.</a> Wilhelm Roux's Arch., Devl. Biol. 186, 351-362 (1979).</li></ol>

אין לי מה לחשוף.

ביציות תסיסנית הן מערכת מודל תכליתית לטיפול במגוון רחב של שאלות הקשורות לתפקיד ולארגון של תאים ורכיבי subcellular. הבנה מלאה של תפקוד חלבון דורשת ניטור של שני היבטי מרחב ובזמן של התנהגות חלבון. התקדמות בשתי מערכות הדמיה ואת הכלים העומדים לרשות Drosophilists הגנטיים מאפשר למעבדות קטנות אפילו לבצע ניסויי הדמיה באיכות גבוהה בביציות חיים. כאן אני מתאר פרוטוקול כדי לנתח את ההתנהגות של חלבונים ומבנים GFP מתויגים או autofluorescent במהלך אמצע ל- oogenesis מאוחר שיכול לשמש בשילוב עם מגוון רחב של רקע גנטי כדי לחקור תפקוד חלבון. בפרוטוקול זה אני מתאר את התהליך שבו ביציות מוכנות להדמיה ואת הגדרות confocal הבסיסיות שתאפשרנה רכישת זמן לשגות וידאו של חלבונים ומבני ניאון. detai נוסףls על הכנת ביצית מתוארים על ידי וייל ואח&#39;. 6 מגוון רחב של זני זבובים מבטאים חלבונים שתויגו endogenously דרך אקסון לוכדים זמינים 8, ואין ספור גרסות חלבון יכולות להיות מהונדסות והחזירו לזבובים. בעבודה עם רקמת חיה, בריאות מהדגימות היא בעלת חשיבות עליונה. תאי ביצית מ10B הבמה יכולים להשלים oogenesis באופנת מהות אוטונומית 11, מה שהופך אותם אידיאליים למחקרי הדמיה לטווח קצרים. יש להקפיד בכמה שלבים עיקריים כדי לקבל נתונים באיכות גבוהה. במהלך נתיחה חשובה לתמרן שחלות וביציות קטנים ככל האפשר, וכדי למזער את כמות הזמן בין נתיחה וההשלמה של הדמיה. באופן אידיאלי, תחנת נתיחה קטנה צריכה להיות ממוקמת באותו החדר שבו שוכן היקף confocal, ורק כמה תאי ביצה בכל פעם צריכים להיות צלם. המספר מומלץ כאן (5-8) מבטיח שזמן הנתיחה ממוזער תוך מיקסום הסבירות לקבלת תמונות באיכות טובה. אני ממליץ לכידת סדרה קצרה של תמונות כדי להעריך את איכות תמונה ולאשר כי ללכוד הגדרות מותאמות, לפני צילום רצף זמן פקיעה ארוך יותר. רוב התוכנות מאפשרות מסגרות בודדות כדי להינצל, והתמונות הללו אז יכולות להיות מנותחות במגוון דרכים באמצעות 12 ImageJ או תוכנה אחרת.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> שמן Halocarbon 27 </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> H8773-100 מ&quot;ל </td><td></td></tr><tr><td> # 5SF מלקחיים </td><td> כלי מדע פיין </td><td> 11252-00 </td><td></td></tr><tr><td> גריז הסיליקון </td><td> סיגמה אולדריץ </td><td> Z273554-1EA </td><td></td></tr><tr><td> צלחות פטרי עם תחתית מהזכוכית </td><td> מאטק </td><td> P35G-0-20-C </td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of gfp-labeled proteins in drosophila oocytes

ביצית דרוזופילה הוקמה כמערכת תכליתית לחקירת שאלות בסיסיות כגון פונקצית cytoskeletal, ארגון תא, ומבנה אברון ותפקודו. הזמינות של חלבונים שונים GFP מתויג-אומרת שתהליכים תאיים רבים יכולים להיות במעקב בתאים חיים במשך דקות או שעות, ושימוש בטכניקה זו, תהליכים כגון RNP תחבורה, המורפוגנזה אפיתל, ושיפוץ רקמה כבר תארו בפירוט רב ב1,2 תסיסנית ביציות. היכולת לבצע הדמית וידאו בשילוב עם רפרטואר עשיר של מוטציות מאפשרת מגוון עצום של גנים ותהליכים שיש לבחון בפירוט מדהים. דוגמה אחת כזו היא התהליך של הזרמת ooplasmic, אשר יוזם ב3,4 אמצע oogenesis. תנועה נמרצת זו של שלפוחית ​​cytoplasmic היא microtubule ו5 kinesin תלוי ומספקת sys שימושיTEM לחקירת תפקוד cytoskeleton בשלבים האלה. כאן אני מציג את פרוטוקול לזמן לשגות הדמיה של ביציות חיים באמצעות כמעט כל התקנת מיקרוסקופיה confocal.

הדמיה של חלבוני ה-GFP שכותרת-תשתנה בהתאם לכמה חזק החלבון מתויג מתבטא. ביצית אמצע במה להביע reticulon דמוי 1 (Rtnl-1), אקסון מתויג עם GFP 8,9 מייצרת איתות חזקה. Rtnl-1 מופיע לשיתוף לוקליזציה עם microtubules הנוכח במהלך הזרמת ooplasmic 10 (איור 1 א &#39;) הארוך. Rtnl-1 הוא סמן טוב להתבוננות הזרמה, וגם חיווי של ארגון microtubule בביציות בשלב מאוחרות. הזרמת Ooplasmic בתא ביצת wildtype ניכרה כתנועה מורגשת של שלפוחית ​​החלמון autofluorescent בעת שימוש בשיעור לכידה של פריים אחד בכל 10 (תרשים 1B) שניות. היטל מקסימאלי של חמש מסגרות יכול להיות שנוצר כדי לסמן את הנתיב של שלפוחית ​​מרגשת. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50044/50044fig1.jpg" /> איור 1. חי הדמיה של שניהם autofluorescent וGFP-tagged מבנים.) תמונת זמן לשגות אחת של 11 ביצית במה להביע Rtnl1-GFP ב400x. סיבי Rtnl1-GFP לנוע בתנועה גלית בביציות זרימה. B) 5 היטל מרבי מסגרת של תא ביצת 10B שלב שבו שלפוחית ​​החלמון autofluorescent הייתה צלם כל 10 שניות לסך 50 שניות, בהגדלה של 400x. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes at JoVE.com

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

פרוטוקול עבור הדמית חיה של חלבוני GFP-tagged או מבני autofluorescent באדם<em&gt; דרוזופילה</emביציות&gt; מתוארות.

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

live-imaging-of-gfp-labeled-proteins-in-drosophila-oocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

11.2K Views.  Vassar College. פרוטוקול עבור הדמית חיה של חלבוני GFP-tagged או מבני autofluorescent באדם דרוזופילה מתוארות.

Video: Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

הדמיה חיה של נדידת תאים גליה את הדיסק העין דמותי תסיסנית

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

תיוג פלורסנט של COS-7-SNAP הבעת תג חלבונים Fusion עבור דימות תא חי

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current techniques used to view such processes are somewhat limited. The following protocol describes a new technique for mounting fixed and labeled Drosophila embryos for coronal viewing with confocal imaging. This method consists of embedding embryos between two layers of glycerin jelly mounting media, and imaging jelly strips positioned upright. The first step for sandwiching the embryos is to make a thin bedding of glycerin jelly on a slide. Next, embryos are carefully aligned on this surface and covered with a second layer of jelly. After the second layer is solidified, strips of jelly are cut and flipped upright for imaging. Alternatives are described for visualizing the embryos depending upon the type of microscope stand to be used. Since all cells along the dorsal-ventral axis are imaged within a single confocal Z-plane, our method allows precise measurement and comparison of fluorescent signals without photobleaching or light scattering common to 3D reconstructions of longitudinally mounted embryos.

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Here we present a mounting protocol for stained Drosophila embryos in an upright position that allows imaging of cross-sections using Confocal microscopy.

הדמיה של זקופה תסיסנית עוברים

Several well-known morphogenetic gradients and cellular movements occur along the dorsal/ventral axis of the Drosophila embryo. However, the current ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

צורה הדמיה תא שינוי חיים תסיסנית עוברים

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

הכנת הפרט תסיסנית ביצה צ&#39;יימברס הדמיה חיים

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.