Name: generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue
Uploaded: 2009-07-07T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue at JoVE.com

כדי לעבוד בתנאים סטריליים, מומלץ לבצע את כל השלבים ברדס זרימה למינרית. 1. חומרים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רקמה עצבית דיסוציאציה Kit (P) (רכיבים: פתרון 1,2, 3 ו 4, מאגר אחסון) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום ההפרדה מסננים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי) המיאלין חרוזים להסרת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטא mercaptoethanol </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> gentleMACS Dissociator </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> C צינורות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> MACSmix Rotator Tube </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS (w / o) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS (w) </li></ul><ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים לפני תחילת הפרוטוקול: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנקס &quot;שנאגרו מלח פתרון ללא קטיונים divalent Ca 2 + או Mg 2 + (HBSS (w / o) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS, סטנדרטי, כלומר עם Ca 2 + ו - Mg 2 + (HBSS (w) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם epitope את האנטיגן עניין ביישומים הבאים, להשתמש או Papain מבוססי רקמות עצביות דיסוציאציה Kit (P) או טריפסין מבוססי רקמות עצביות דיסוציאציה Kit (T). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הפתרונות הבאים מן הרקמה עצבית דיסוציאציה קיט: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון 2: להוסיף בטא mercaptoethanol מ&quot;מ 0.067 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון 4: לפזר אבקת הצפת 0.7 מ&quot;ל אחסון (מסופק בערכה), לערבב בעדינות (לא מערבולת) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנזימים מערבבים 1: פתרון 1.9 מ&quot;ל פיפטה 2 ו 50 פתרון μl 1 (הן ערכה) לתוך צינור C ו דגירה של 10-15 דקות על 37 ° C. זה מספיק כדי לנתק 400 מ&quot;ג של רקמת המוח. </li></ol></li></ol> 2. Dissociating הרקמה העצבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את רקמת המוח בתוך שפופרת המכילה 1 מ&quot;ל HBSS (w / o) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת העכבר המוח לתוך הצינור C המכיל 1950 μL של מיקס אנזימים שחומם מראש 1. (הערה: בפרוטוקול זה נכתב עבור 400 מ&quot;ג ≤, אבל כרכים פתרון וניתן לשנותם כדי להכיל עד 1600 מ&quot;ג של רקמת המוח לכל Tube C) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את Tube C על Dissociator gentleMACS ולהפעיל תוכנית &quot;m_brain_01&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם סיבוב (4 סל&quot;ד באמצעות Rotator Tube MACSmix) במשך 15 דקות על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את Tube C על Dissociator gentleMACS ולהפעיל תוכנית &quot;m_brain_02&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך השלב דיסוציאציה להכין 30 μl של אנזימים מערבבים 2 מ&quot;ג לכל 400 ברקמת ידי ערבוב בעדינות 20 μl של פתרון 3 ו - 10 μl של פתרון 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף מערבבים אנזימים 2 עד התחתית C באמצעות כובע, מחצה אטום ומערבבים בעדינות מבלי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה Tube C עם רוטציה של 10 דקות ב 37 מעלות באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את Tube C על Dissociator gentleMACS ולהפעיל תוכנית &quot;m_brain_03&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה Tube C עם רוטציה של 10 דקות ב 37 מעלות באינקובטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה בקצרה לאסוף את דגימת בחלק התחתון של הצינור. </li></ol> 3. סינון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מסנן מספיק גדול כדי לאפשר מעבר לתאים של עניין. למשל, תאים פורקינג&#39; הם גדולים מדי כדי לעבור דרך מסנן 30 מיקרומטר, אך Prominin-1 + תאים תהיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה μl suitable1000 כדי להסיר את התאים בצורה Tube C באמצעות כובע, מחצה אטום ולהחיל אותו מסנן ההפרדה מראש על צינור איסוף 15 מ&quot;ל. (הערה: עבור גודל מדגם גדול יותר להשתמש צינור איסוף 50 מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את המסנן עם 10 מ&quot;ל של HBSS (w). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התאים מסוננים על XG 300 דקות 10 ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend supernatent בינוני או חיץ של בחירה עבור יישומים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר פסולת מיאלין, המיאלין הסרת להשתמש חרוזים. </li></ol> 4. תוצאות נציג: אנא ראו איורים 1-3 <img src="/files/ftp_upload/1267/Fig_1.png" alt="תאנה 1" /> איור. 1 דיסוציאציה המוח עם Dissociator gentleMACS הביא תאים קיימא 97%, כפי שמראה ניתוח תזרים cytometric. <img src="/files/ftp_upload/1267/1267fig2.png" alt="תאנה 2" /> איור. 2 תמונת מיקרוסקופ אור של היווצרות neurosphere לאחר מיון התא מגנטי באמצעות אנטי Prominin-1 microbeads לאחר 7 ימים של טיפוח MACS ® NeuroMedium בתוספת MACS B27 מוסף PLUS. תאים שהוכנו מהמוח CD1 העכבר (P3), תוך שימוש ברקמה עצבית דיסוציאציה Kit (P). <img src="/files/ftp_upload/1267/1267fig4.jpg" alt="תאנה 3.5" /> איור. 3 פסולת המיאלין של תא בודד המתלים פוגמת במידה ניכרת בידוד תא, סילוק פסולת המיאלין על ידי הסרת חרוזים המיאלין מגביר תא הפרדות יעילות. עבור הפרדות MACS באמצעות אנטי Prominin-1 microbeads, P22 במוח העכבר היה ניתק באמצעות רקמה עצבית דיסוציאציה Kit (P). תאים ההשעיה תא בודד היו גם להשתמש ישירות עבור ההפרדה, או הוגשו המיאלין דלדול באמצעות חרוזים המיאלין הסרת. השוואת דגימות ללא הפרדה עם הסרת המיאלין, מוכיח כי הטוהר גבוהה יותר עבור דגימות עם הסרת המיאלין הקודם.

<ol>
	<li>Hardt, O., Scholz, C., K&#252;sters, D., Yanagawa, Y., Pennartz, S., Cremer, H., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+analysis+defines+differences+between+region-specific+GABAergic+neurons.">Gene expression analysis defines differences between region-specific GABAergic neurons.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 418-428 (2008).</li><li>Lee, J. K., McCoy, M. K., Harms, A. S., Ruhn, K. A., Gold, S. J., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulator+of+G-protein+signaling+10+promotes+dopaminergic+neuron+survival+via+regulation+of+the+microglial+inflammatory+response.">Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response.</a> J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).</li><li>K&#246;rnyei, Z., G&#243;cza, E., R&#252;hl, R., Orsolits, B., V&#246;r&#246;s, E., Szab&#243;, B., V&#225;govits, B., Madar&#225;sz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglia-derived+retinoic+acid+is+a+key+factor+in+glia-induced+neurogenesis.">Astroglia-derived retinoic acid is a key factor in glia-induced neurogenesis.</a> FASEB J. 21, 2496-2509 (2007).</li><li>Meylan, F., Davidson, T. S., Kahle, E., Kinder, M., Acharya, K., Jankovic, D., Bundoc, V., Hodges, M., Shevach, E. M., Keane-Myers, A., Wang, E. C., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TNF-family+receptor+DR3+is+essential+for+diverse+T+cell-mediated+inflammatory+diseases.">The TNF-family receptor DR3 is essential for diverse T cell-mediated inflammatory diseases.</a> Immunity. 29, 79-89 (2008).</li><li>Skog, J., W&#252;rdinger, T., van Rijn, S., Meijer, D. H., Gainche, L., Sena-Esteves, M., Curry, W. T., Carter, B. S., Krichevsky, A. M., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers.">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).</li></ol>

הכותבים הם עובדי Miltenyi BIOTEC GmbH, גרמניה.

Dissociator gentleMACS מאפשר הכנה סטנדרטית של תא בודד השעיות מרקמות עצביים במערכת סגורה. רקמה עצבית ערכות דיסוציאציה מותאמים לשמר epitopes אנטיגן הדרושים יישומים נוספים כמו immunostainings והפרדה תא immunomagnetic 1-5. בפרוטוקול זה אנו מראים ניתוק האנזימטית עדין של המוח באמצעות העכבר Dissociator gentleMACS ואת הרקמה העצבית דיסוציאציה Kit (P), מניב בתאים קיימא 97%. 100 מ&quot;ג של רקמה עצבית התשואות בין 6 5x10 ו 1x10 7 תאים, בהתאם לגיל של רקמות המאכסן. ממוקד Prominin-1 + תאים בודדו באמצעות אנטי Prominin-1 microbeads ונלקח לאחר מכן לתוך התרבות. הפרוטוקול מוצג להיות אפילו יותר יעילה עם שימוש נוסף של חרוזים המיאלין הסרת כשעובדים עם רקמה עצבית נגזר P7&gt; עכברים.

<table><tbody><tr><td>C Tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Order no. 130-093-237</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; Starting Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Order no. 130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACSmix&amp;#8482; Tube Rotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Order no. 130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociation Kit (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Order no. 130-092-628</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Pre-Separation Filters</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Order no. 130-041-407</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Anti-Prominin-1 MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Order no. 130-092-333</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Anti-Prominin-1-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Order no. 130-092-335</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Myelin Removal Beads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Order no. 130-094-544</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Art 1000 Reach Pipet Tips </td><td>Molecular BioProducts</td><td>Order no. 2079</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href=&quot;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociation Kit (T)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Order no. 130-093-231</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Propidium Iodide Solution</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Order no. 130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

generation of single-cell suspensions from mouse neural tissue

בתוך מערכת העצבים, מאות סוגי תאים עצביים ועל גליה תוארו. כל סוג תא מסוים במוח או בחוט השדרה יש רפרטואר של פני השטח מולקולות התא, או גורמים המולקולרית, שבאמצעותה ניתן זוהו ואופיינו. נכון לעכשיו, זיהוי תאים חזקים טכנולוגיות הפרדה דורשים תא בודד ההכנות להיות שנוצר ובמקביל הגבלת מוות של תאים והרס של חלבון משטח אופייני. Dissociator gentleMACS, כאשר בשילוב עם טריפסין או papain מבוססי ערכות דיסוציאציה, יכול ביעילות ובעדינות לנתק את רקמת המוח תוך שמירה epitopes אנטיגן והגבלת אובדן התא. הכנה סטנדרטית של תא בודד השעיות מושגת באמצעות צינורות C, אופטימיזציה, תוכניות מראש gentleMACS. לאחר שנוצר, תא בודד השעיות יכולים להיות מטופלים עם conjugates חד שבטיים כמו אנטי Prominin microbeads-1, אשר לזהות אבות עצביים, או מטוהרים נוסף באמצעות חרוזים המיאלין הסרת.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue at JoVE.com

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Dissociating תאים סוגי רקמות ספציפיות דורש פרמטרים ספציפיים aggitation רקמות לקבל כמות גדולה של תאים קיימא culturable. GentleMACS Miltenyi Dissociator מייעל את המשימה עם פרוטוקול, פשוט מעשית. בפרסום זה השימוש במנגנון הזה על רקמת nerual הוא הסביר.

הדור של תא בודד מרקמת השעיות עכבר עצבית

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

generation-of-single-cell-suspensions-from-mouse-neural-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

22.5K Views.  Miltenyi Biotec,GmbH.  中文 日本語 

Video: Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Culture of Mouse Neural Stem Cell Precursors

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase our understanding of the nervous system and may allow us to develop treatments for currently incurable brain diseases and injuries. In addition, stem cells should be used for stem cell research aimed at the detailed study of mechanisms of neural differentiation and transdifferentiation and the genetic and environmental signals that direct the specialization of the cells into particular cell types.  This video demonstrates a technique used to disaggregate cells from the embryonic day 12.5 mouse dorsal forebrain. The dissection procedure includes harvesting E12.5 mouse embryos from the uterus, removing the "skin" with fine dissecting forceps and finally isolating pieces of cerebral cortex. Following the dissection, the tissue is digested and mechanically dissociated. The resuspended dissociated cells are then cultured in "stem cell" media that favors growth of neural stem cells.

This video describes the method used for isolation of neuroprecursors from the developing cortex of embryonic mice. The procedure for removing embryos from the uterus, dissecting the cortical tissue, and digesting the isolated cerebral cortex is shown.

תרבות עצבית עכבר מקדימים לתאי גזע

Primary neural stem cell cultures are useful for studying the mechanisms underlying central nervous system development. Stem cell research will increase ...

Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות Assay Neurosphere

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

Neuroscience

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation into three types of cells: neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. Identifying aNSC-derived regions and characterizing the aNSC properties are critical for the potential use of aNSCs and for the elucidation of their role in neural regeneration. The subcallosal zone (SCZ), located between white matter and the hippocampus, has recently been reported to contain aNSCs and continuously give rise to neuroblasts. A low percentage of aNSCs from the SCZ is differentiated into neurons; most cells are differentiated into glial cells, such as oligodendrocytes and astrocytes. These cells are suggested to have a therapeutic potential for traumatic cortical injury. This protocol describes in detail the process to generate SCZ-aNSCs from an adult mouse brain. A brain matrix with intervals of 1 mm is used to obtain the SCZ-containing coronal slices and to precisely dissect the SCZ from the whole brain. The SCZ sections are initially subjected to a neurosphere culture. A well-developed culture system allows for the verification of their characteristics and can increase research on NSCs. A neurosphere culture system provides a useful tool for determining proliferation and collecting the genuine NSCs. A monolayer culture is also an in vitro system to assay proliferation and differentiation. Significantly, this culture system provides a more homogenous environment for NSCs than the neurosphere culture system. Thus, using a discrete brain region, these culture systems will be helpful for expanding our knowledge about aNSCs and their applications for therapeutic uses.

Establishing culture systems for the expansion of adult neural stem cells (aNSCs) allows for the examination and application of aNSCs for therapy. The subcallosal zone (SCZ) has recently been recognized as a novel neuroblast-forming region in adult mice. Here, methods for the isolation, expansion, and differentiation of SCZ-aNSCs are described.

בידוד והתרבות של תאי גזע בוגרים עצביים מאזור העכבר Subcallosal

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

Isolation and Culture of Embryonic Mouse Neural Stem Cells

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and expansion of NSCs provide a suitable source of cells for neuroscientists to study the function of neurons and glial cells along with their interactions. There are several reported techniques for the isolation of neural stem cells from adult or embryo mammalian brains. During the microsurgical operation to isolate NSCs from different regions of the embryonic CNS, it is very important to reduce the damage to the brain cells to obtain the highest ratio of live and expandable stem cells. A possible technique for stress reduction during isolation of these cells from the mouse embryo brain is the reduction of surgical time. Here, we demonstrate a developed technique for rapid isolation of these cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence. Surgical procedures include harvesting E13 mouse embryos from the uterus, cutting the frontal fontanelle of the embryo with a bent needle tip, extracting the brain from the skull, microdissection of the isolated brain to harvest the ganglionic eminence, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in suspension culture to generate neurospheres.

Here, we introduce a novel microsurgical technique for the isolation of neural stem cells from the E13 mouse embryo ganglionic eminence.

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

Neural stem cells (NSCs) are multipotent and can give rise to the three major cell types of the central nervous system (CNS). In vitro culture and ...

<meta charset="utf8"></head><body>נוקלאופקציה יעילה של NSCs מבודדים מהאזור התת-חדרי של מורין

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) as mitogens, producing clonal aggregates known as neurospheres. This in vitro system is a valuable tool for studying NSC potential. Transfection of siRNAs or genes carried in plasmids can be used to induce perturbations to gene expression and study NSC biology. However, the exogenous nucleic acid delivery to NSC cultures is challenging due to the low efficiency of central nervous system (CNS) cells transfection. Here, we present an improved nucleofection system that achieves high efficiency of gene delivery in expanded NSCs from adult murine SVZ. We demonstrate that this relatively simple method enhances gene perturbation in adult NSCs, surpassing traditional transfection protocols with survival rates exceeding 80%. Moreover, this method can also be applied in primary isolated NSCs, providing a crucial advancement in gene function studies through gene expression manipulation via knockdown or overexpression in neurosphere cultures.

<meta charset="utf8"></head><body>זרקור המחבר: נוקלאופקציה משופרת להעברת גנים ביעילות גבוהה בתרביות תאי גזע עצביים שמקורם באזור תת-חדרי של מורין

Here, we describe a nucleofection system designed to enhance gene delivery efficiency in expanded neural stem cells (NSCs) isolated from the adult murine subventricular zone. The findings demonstrate that this method significantly improves gene perturbation in NSCs, surpassing the effectiveness of traditional transfection protocols and enhancing cell survival rate.

בידוד, התרחבות ונוקלאופקציה של תאי גזע עצביים מאזור תת-חדרי מורין בוגרים

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented ...

השגת תרחיפים חד-תאיים ממוח מורין ומח עצם הגולגולת

Isolating Immune Cells from Mouse Brain and Skull

Mounting evidence indicates that the immune response triggered by brain disorders (e.g., brain ischemia and autoimmune encephalomyelitis) occurs not only in the brain, but also in the skull. A key step toward analyzing changes in immune cell populations in both the brain and skull bone marrow after brain damage (e.g., stroke) is to obtain sufficient numbers of high-quality immune cells for downstream analyses. Here, two optimized protocols are provided for isolating immune cells from the brain and skull bone marrow. The advantages of both protocols are reflected in their simplicity, speed, and efficacy in yielding a large quantity of viable immune cells. These cells may be suitable for a range of downstream applications, such as cell sorting, flow cytometry, and transcriptomic analysis. To demonstrate the effectiveness of the protocols, immunophenotyping experiments were performed on stroke brains and normal brain skull bone marrow using flow cytometry analysis, and the results aligned with findings from published studies.

מחבר זרקור: חקירת התגובה החיסונית המורכבת בעקבות איסכמיה מוחית

To investigate the immune response to brain disorders, one common approach is to analyze changes in immune cells. Here, two simple and effective protocols are provided for isolating immune cells from murine brain tissue and skull bone marrow.

בידוד תאי מערכת החיסון מהמוח והגולגולת של עכבר

Mounting evidence indicates that the immune response triggered by brain disorders (e.g., brain ischemia and autoimmune encephalomyelitis) occurs not only ...

הדור של תא בודד מרקמת השעיות עכבר עצבית

Transcript

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

תרבות עצבית עכבר מקדימים לתאי גזע

הקמת עכבר עובריים גזע עצביים תרבית תאים באמצעות Assay Neurosphere

הדור של בתאי גזע עצביים מן רקמה אנושית זרוקות קליפתיים עוברית

עכבר אחד, שתי תרבויות: בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים למבוגרים משני האזורים העצביים של עכברים בודדים

בידוד והתרבות של תאי גזע בוגרים עצביים מאזור העכבר Subcallosal

בידוד והתרבות של תאי גזע עצביים עובריים בעכבר

בידוד, התרחבות ונוקלאופקציה של תאי גזע עצביים מאזור תת-חדרי מורין בוגרים

בידוד, התרחבות ונוקלאופקציה של תאי גזע עצביים מאזור תת-חדרי מורין בוגרים

בידוד, התרחבות ונוקלאופקציה של תאי גזע עצביים מאזור תת-חדרי מורין בוגרים

בידוד תאי מערכת החיסון מהמוח והגולגולת של עכבר