מטרת פרוטוקול וידאו זה היא הקמת פרוטוקול מקור ויעיל עבור עכבר עוברי עצבי גזע תא בידוד ותרבות. שלום, אני מרים סדגי-זאדה. אני סטודנטית לתואר שני בביולוגיה תאית ומולקולרית במכון רויאן.
היום אני ועמיתי רוצים להראות לכם איך לקצור תאי גזע עצביים מ-13 גנגליונים של עכבר עוברים. שלום, אני בחרה עליזאדה-שורז'יסטאן. אני סטודנטית לתואר שני לביולוגיה תאית ומולקולרית במחלקה לתאי גזע במכון רויאן לביוטכנולוגיה.
שלום, אני רזא דהגאני-ורנמקהסטי. כמו כן אני לומד ביולוגיה תאית ומולקולרית במכון רויאן. ניתוחים כוללים קצירת כל 13 עוברי עכבר מרחם.
חיתוך החלק הקדמי של fontanel של העובר עם קצה מחט כפוף חילוץ המוח מהגולגולת. ניתוח מיקרו של מוח מבודד כדי לקצור את ההגמליוני. דיסוציאציה של הרקמה שנקטפו במדיום תאי גזע עצביים כדי להשיג השעיה של תא יחיד.
ולבסוף, ציפוי תאים בתרבות השעיה כדי ליצור תאי עצב. לנקות ולחטא את העור של אזור הבטן על ידי ריסוס עם 70% אתנול. לשלוט על הבטן כלפי מעלה ולאחר מכן לחתוך את העור ואת הפנים עם מספריים כדי לחשוף חלל הבטן וקרני הרחם.
הסר את קרני הרחם המכילות את העוברים על ידי מספריים ולהעביר אותם לתוך צינור חרוט 50 מ"ל המכיל 25 מ"ל קר HEPES MEM חיץ. מניחים את הצינור חרוט מתחת למכסה המנוע זרימה למינלית. פתח את הכובע מתחת למכסה המנוע.
מוציאים את קרני הרחם מהצינור, ושטיפת שלוש פעמים עם נפח מספיק של חיץ HEPES MEM קר טרי כדי לחסל פסולת ודם. מעבירים את רקמת הרחם לצלחת פטרי באורך 10 ס"מ המכילה חיץ HEPES MEM קר של 7 עד 10 מ"ל. פתח את קרני הרחם באמצעות מספריים עדין ולהעביר עוברים לצלחת חדשה המכילה 7 עד 10 מ"ל של חיץ HEPES MEM קר.
עכשיו לשים את צלחת 10 ס"מ עם עוברים מתחת למיקרוסקופ ניתוח לפעולת ניתוח מיקרו. לכופף את קצה מחט מזרק על ידי דחיפת הקצה שלה על ידית להב אזמל פלדה. לכופף את קצה המחט עד הקצה הוא כפוף בזווית של 70 עד 90 מעלות.
בדוק את קצה המחט מתחת למיקרוסקופ לנתח כדי לראות את העיקול בקצה המחט. באופן טבעי לעוברים יש תנוחה צברית בזה. מבלי לשנות את עמדתם, החזיק את הצוואר והגוף של העובר עם מטלפים עדין ולאחר מכן להכניס את החלק הכפוף של המחט עמוק לתוך החלק הקדמי של fontanel של ראש העובר.
יהיה שם דימום קטן או קריש דם. להזיז את קצה המחט באופן שטחי בעוד החלק הכפוף הוא בתוך הבליטה לכיוון המצח ולאחר מכן לכיוון החלק האחורי של הראש. הקפד לחתוך דרך העור והגולגולת, ולא לפגוע במוח הבסיסי.
לדחוף את העור עם קצה המחט באופן מאוחר יותר כדי לחשוף את המוח. הכנס את המחט מהצד הצדדי של העור אל מתחת למסגרת מהצד הצדדי של העור לאזור שמתחת למוח. ואז להסיר את המוח מהקרקפת הזאת על ידי דוחף אותו לצאת מהגולגולת נותבה.
ההגמוניה הגנגליונית מוצגת בבירור בוידאו עם החלקים המדיאליים והצלביים שלה. החזיק את המוח יציב באמצעות מטסות הטיפול ולאחר מכן באמצעות microscissors לחתוך את קליפת המוח של כל חצי כדור כדי לחשוף את ההגנגלי. החזיק את המוח ואת המקום ניתחו את ההגנגליות לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל מדיה תאי גזע עצביים.
חזור על הליך זה עד שכל המוח עבר ניתוח מיקרו. חותכים את עליונות גנגליונית ניתוק על ידי הצבת קצה פיפטה על החלק התחתון של הצינור פיפטה ההשעיה למעלה ולמטה במשך 2 5 פעמים כדי לשבור את הרקמה כדי לקבל השעיה תא יחיד. צנטריפוגה ההשעיה ב 110 גרם במשך 5 דקות.
הסר את העל-טבעי ולחץ מחדש על התאים ב- 1 מ"ל של צינור 0.05% ב- EDTA. דגירה ההשעיה התא ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. ולאחר מכן להוסיף נפח שווה ערך של מעכבי טריפסין סויה להפסיק פעילות טריפסין.
פיפטה ההשעיה התא למעלה ולמטה כדי לוודא כי טריפסין כבר מושבת לחלוטין. צנטריפוגה ההשעיה התא ב 110 גרם במשך 5 דקות. הסר את supernatant ו resuspend התאים 1 מ"ל של תא גזע עצבי מלא בינוני לספור את מספר התאים.
צלחת התאים בתאי גזע עצביים בינוני לתוך בקבוק תרבות רקמת גודל מתאים. מעבירים 5 מ"ל של 2T25, 20 מ"ל ל-T75 ו-40 מ"ל לבקבוקי T175. נוירוספרות יופיעו לאחר 3 ימים תרבות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח עם 5%CO2.
כדי למצוץ את התרבות את הנוירוספרות, להעביר את המדיום עם נוירוספרות מושעה לצנטריפוגה לצנטריפוגה ב 110 גרם במשך 5 דקות, ולאחר מכן להשליך את העל טבעי. ב 1 מ"ל של 0.05% טריפסין EDTA ודגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. ואז להשבית את טריפסין באמצעות מעכבי טירפין סויה פיפטה הנוירוספרות בעדינות למעלה ולמטה כדי להפוך אותם תאים בודדים.
צנטריפוגה ההשעיה התא ב 110 גרם במשך 5 דקות. השליכו את העל-טבעי והשקיעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של תאי גזע עצביים בינוניים. תאים אלה מוכנים לשלב הבא תרבות או תרבות על משטח למינציה מצופה מלא לניסויים מתקדמים.
על ידי טיפוח מיליון תאי גזע עצביים ראשוניים לאחר שבעה ימים מספר התאים יגדל לשלושה עד ארבעה מיליון. לאחר שישה עד שבעה ימים הספירות צריכות למדוד בין 150 ל -200 מיקרומטר קוטר ויהיו מוכנות לתת תרבות על מנות מצופות למינציה פולי אורניתן בהיעדר bFGF ו- EGF להבחנה עצבית. תוצאות הבדיקה של ציטומטריית זרימה מראות כי קרוב ל-95% מהתאים המהווים את הנוירוספרות היו חיוביים של נסטין, שהוא סמן ידוע לתאי גזע עצביים.
בדיקות באמצעות בטא טובולין III ונוגדני חלבון סיבי גנגליו מגלים כי על ידי טיפוח תאי גזע עצביים על פני השטח מצופים סביב 94% הראו פנוטיפ עצבי סביב 5% להראות פנוטיפ גליה. רק בסרטון הקצר הזה טכניקת מעבדה לבידוד מהיר של תאי גזע עצביים מ-13 עוברי עכברים גנגליוניים. אני מקווה שתהצליח בתרבות תאי הגזע העצביים שלך.
