ברצוננו להודות לקרן קנדית עבור חדשנות, פיתוח קולומביה הבריטית קרן ידע מדעי הלאומי וההנדסה מועצת המחקר (NSERC) של קנדה לתמיכה מחקרים מתמשכים על אזורים חמצן נמוכה של מים חופי האוקיינוס ​​הפתוח. JJW נתמכה על ידי מלגות של NSERC ו דאו נתמכה על ידי מלגות של NSERC, Killam ויסוד טולה מרכז מימנה עבור גיוון התפתחות חיידקים. SL נתמכה על ידי המרכז טולה היסוד במימון עבור גיוון התפתחות חיידקים.

הערה: כל ריאגנטים להשתמש בפרוטוקול זה aliquoted ממניות מעבדה לתוך קטן יותר במניות, עובד זה מאוד חשוב כדי למנוע זיהום לחצות של דגימות DNA שלך וזיהום של מניות מעבדה. כמו כן, כאשר pipetting, הקפד לשנות טיפים פיפטה עבור כל תוספת כדי למנוע זיהום לחצות. חלק ראשון: תמוגה תא עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין בפרוטוקול זה על ידי הפשרת מסננים Sterivex המכילים ביומסה planktonic מרוכז בעבר על הקרח. לשם הפשטות, כאן אנו מתארים את הליך עיבוד מסנן הפרט. בפועל, אנו ממליצים עיבוד 16 או מסננים פחות בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסינון יש להפשיר, להתחיל את הראשון מבין שני incubations: אחד lyse התאים ולהסיר RNA, ואחד לשבור חלבונים. במשך הדגירה הראשונה, להוסיף 100 ליזוזים μl (125 מ&quot;ג בשנת 1000 TE μl) ו 20 מ&quot;ל RNase (10 מיקרוגרם / מ&quot;ל) לסינון. Reseal את המסנן עם Parafilm ולהשאיר אותה לסובב בתנור הכלאה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך הדגירה הבאה, להוסיף 100 K proteinase μl 100 SDS ו 20% μl לסינון. Reseal באמצעות Parafilm ולהשאיר אותה לסובב 1-2 שעות בתנור הכלאה, הפעם על 55 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 5cc, העברת lysate מן לסנן Sterivex לתוך צינור פלקון 15 מ&quot;ל. יש לשטוף את המסנן עם חיץ 1 תמוגה מ&quot;ל ולהוסיף את נוזל lysate לשטוף בצינור שלך פלקון באמצעות מזרק 5cc. עכשיו שיש לך lysed ו מתעכל התאים שלך, אתה מוכן לחלץ DNA שלהם. </li></ol> חלק שני: הפקת DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלב הבא הוא להשתמש בשיטת פנול, כלורופורם כדי לחלץ את ה-DNA מן lysate שלך. הוסף נפח שווה (כ 3ml) של פנול: כלורופורם: אלכוהול Isoamyl (רש&quot;ת) על הצינור lysate, והקפד לשנות טיפים פיפטה עבור כל תוספת כדי למנוע זיהום לחצות. וורטקס למשך 10 שניות כדי ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין התחתית גרם 2500 במשך 5 דקות, כדי לוודא צנטריפוגה היא מאוזנת. במהלך צנטריפוגה, את התערובת פנול, כלורופורם, lysate צריך להפריד לשתי שכבות: שכבה אורגנית המכילה את כלורופורם פנול, וחלבונים מן המדגם שלך, על הקרקעית, שכבה מימית, אשר מורכב של הדנ&quot;א שלכם, מים אחרים מולקולות הידרופיליות יותר, על העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את השכבה המימית (המכילים DNA שלך) לתוך צינור חדש פלקון 15 מ&quot;ל. היזהר שלא לגעת בממשק עם קצה הפיפטה (תמיד להשאיר כמות קטנה של השכבה המימית מאחור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי צינור חדש זה, להוסיף נפח שווה (כ 3mL) של כלורופורם: רשות העתיקות, והקפד לשנות טיפים פיפטה עבור כל תוספת כדי למנוע זיהום לחצות. וורטקס למשך 10 שניות. פעולה זו מסייעת להסיר כל פנול שנותרו דגימת DNA שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין על 2500 גרם במשך 5 דקות או עד שכבה מימית ברור. העברת שכבה מימית לתוך צינור חדש, Falcon שכותרתו ולהוסיף 1 מ&quot;ל של TE ב-pH 8.0, נזהר שלא לגעת בממשק עם קצה הפיפטה (תמיד להשאיר כמות קטנה של השכבה המימית מאחור). זו שכבה מימית המכילה תמצית ה-DNA שלך. </li></ol> חלק שלישי: ריכוז דנ&quot;א כביסה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלב הבא הוא לשטוף ולרכז את דגימת DNA בתוך שפופרת 15 מ&quot;ל Amicon צנטריפוגות אולטרה. צינורות Amicon מורכב מסנן אשר שומרים על מולקולות או מעל משקל מולקולארי שצוין (retentate) ו צינור לתפוס את flow-through (תסנין). במקרה זה, מסנן שומר ה-DNA שלך (retentate). העברת תמצית ה-DNA שלך צעד 2.5 לתא מסנן צינור Amicon Ultra. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספין על 3500 גרם במשך 10 דקות. ודא שיש פחות מ 1 מ&quot;ל של נוזל שמר במסנן Amicon. אם נשאר יותר retentate, למלא את המסנן עם TE ספין שוב. הקפד להשתמש טיפ פיפטה טרי בנוסף כל TE כדי למנוע זיהום לחצות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הזרימה דרך, או תסנין, אל צינור אחר פלקון ולשמור אותו במקרר עד שתאשר המוצר הסופי שלך על ה-DNA ג&#39;ל (חלק רביעי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ 2 מ&quot;ל TE את מסנן Amicon ספין על 3500 גרם במשך 6 דקות, כדי לוודא להשתמש קצה פיפטה טריים עבור כל TE בנוסף, כדי למנוע זיהום לחצות. בריכת תסנין עם זה משלב 3.3 ולשמור במקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את ה-DNA עוד פעמיים עם TE עבור סכום כולל של שלושה שוטף (מוודא תמיד להשתמש טיפ פיפטה טרי), ושמירת תסנין בכל פעם (כמו צעדים לכל 3.3 ו -3.4). בשביל לשטוף האחרון, ספין מ&quot;ל עד 200-500 של שרידים retentate במסנן Amicon. הקלט את נפח סופי ולהעביר את retentate (המכילים DNA שלך) כדי צינור שכותרתו Eppendorf 1.5 מ&quot;ל. </li></ol> חלק רביעי: קביעת איכות DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את איכות דנ&quot;א להעריך את ריכוז ה-DNA על ידי ואוזל דגימות שלך על 0.8% ג&#39;ל agarose ג&#39;ל staעומד לבחינה עם 1ml ethidium ברומיד (EtBr) לילה. (היה זהיר מאוד בעת שימוש EtBr-זהו mutagen ידוע כמסרטן חשוד. הקפד להחליף כפפות לעתים קרובות למנוע העברת EtBr לשאר במעבדה על העור שלך.) טען את דגימות ה-DNA ליד סולמות, המהווים גודל ועוצמת סטנדרטים (ראה שלב הבא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסמטאות מספר הראשון, עומס סולמות עם להקות של משקולות מולקולרית בריכוזים שונים. אנו ממליצים על דפוס הטעינה הבאה: בסמטאות הראשונה והאחרונה (נתיבי החיצונית), עומס 10 μl של 50ng/μl של 1kb + או סולם 2log. ב נתיבים 2,3 ו - 4, 2 μl לטעון, μl 5 ו -10 μl, בהתאמה, הסולם λHindIII 50ng/μl. לבסוף, עומס 5 μl לכל נתיב של תמצית ה-DNA עם צבע עבור כל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרץ את הג&#39;ל על 15 וולט למשך כ 16 שעות (מומלץ לרוץ בין לילה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, לצלם את הג&#39;ל באמצעות מערכת UV תיעוד ג&#39;ל. כדי לקבוע את טווח המשקל המולקולרי של הדנ&quot;א שלכם הריכוז שלה, השווה את להקות להקות מדגם של הסולמות. DNA באיכות טובה יהיה משקל מולקולרי גבוה (&gt; 36kb), ולהראות מעט עדויות של גז / השפלה. ראה איור 1. </li></ol> פרק חמישי: צנטריפוגה צזיום כלוריד Gradient <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם איכות ה-DNA הוא טוב כמות מספיקה, אתה יכול להמשיך לטהר את ה-DNA על ידי ביצוע צזיום כלוריד (CsCl) צנטריפוגה הדרגתי. שים לב, שלב זה הוא אופציונלי טיהור אינו הכרחי עבור כל היישומים במורד הזרם (לדוגמה, אם אתה רוצה ליצור ספריות fosmid אתה צריך לטהר, ואילו אם אתה פשוט רוצה לבצע ריאקציות PCR, טיהור אין צורך בדרך כלל). ראשית, התווית שפופרת אחת עבור צנטריפוגות מדגם זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי צינור כל צנטריפוגה, להוסיף 160 מ&quot;ג CsCl, 178 μl של הדנ&quot;א הגנומי. לאחר הוספת CsCl ו-DNA אל הצינור, מקום פיסה קטנה של parafilm על גבי הצינור בעדינות להפוך את צינור 1-20 פעמים על מנת לערבב את המרכיבים. אל תערבב ידי pipetting, אשר עלול לגרום הגז של ה-DNA. לאחר מכן, הוסף 10 μl של 10 מיקרוגרם / EtBr μl אל הצינור הזה לערבב אותו באותה דרך. (היה זהיר מאוד בעת שימוש EtBr-זהו mutagen ידוע כמסרטן חשוד. הקפד להחליף כפפות לעתים קרובות למנוע העברת EtBr לשאר במעבדה על העור שלך.) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי המשקל של כל הצינורות מאוזנים לפני צנטריפוגה כזה כי ההבדלים במשקל בין הצינורות הם פחות מ 1 מ&quot;ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינורות hemostat באמצעות הרוטור, לסגור את המכסה ומניחים את הרוטור בתוך ultracentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סגור את הדלת ultracentrifuge. אבק תחול ברגע שאתה סוגר את הדלת. הפעל לילה בסל&quot;ד 100,000 עבור 18 שעות ו 20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר צנטריפוגה היא מוחלטת, להוציא את הצינורות מן הרוטור באמצעות hemostat מקום על מדף צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיינו את ה-DNA transilluminator עם אור כחול, או אם זמין, להשתמש באור UV אורך גל ארוך, בחדר חשוך. לבשי זוג משקפיים ענבר מסנן כדי לראות את להקת ה-DNA. ראה תרשים 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מזרק 1cc מחט סטרילית (26G 5 / 8), להסיר את הלהקה DNA ולמקם אותו צינור Eppendorf 1.5ml. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעזור לשחזר את רוב הדנ&quot;א לכוד בתוך החלל מת המזרק, לשטוף את המזרק עם TE 100 μl ולהוסיף הפתרון שטפה את הצינור. הכן קנה אחד עם חיץ TE 100 μl לפי המדגם, כדי למנוע זיהום לחצות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסיר EtBr מ-DNA, מוסיפים נפח שווה של מים רוויים butanol אל הצינור, להפוך את צינורות בעדינות 10-20 פעמים, צנטריפוגה בסל&quot;ד 10000 דקה 1 ולסלק את השכבה העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור כביסה עד לצבע שקוף butanol, 3 - 4 פעמים יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 4 מ&quot;ל TE בצינור Amicon אולטרה צנטריפוגה ולהוסיף את פתרון ה-DNA מלמעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב g 3500 בטמפרטורת החדר, עד נפח DNA מצטמצם μl כ 100-500 (בערך 6-7 דקות) וזורקים את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2ml TE כדי Amicon לסנן צנטריפוגות ב 3500 גרם במשך 6 דקות, כדי לוודא להשתמש קצה פיפטה טרי בנוסף לכל, כדי למנוע זיהום לחצות. חזור פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תתרכז לנפח סופי של μl 50-100 על ידי צנטריפוגה נוספות במידת הצורך, ולהעביר את פתרון ה-DNA על מנת לסנן את צינור חדש Eppendorf 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 μl TE את מסנן Amicon ו פיפטה למעלה ולמטה לאורך שני הקרומים לסנן לשטוף את כל הדנ&quot;א הנותרים. הוספת פתרון זה הצינור ב 5.15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים YM-30 Microcon יחידת המסנן לתוך צינור Microcon ו prewash Microcon ידי הוספת מים autoclaved 200 μl ו centrifuging בסל&quot;ד 10000 במשך 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את פתרון ה-DNA מ 5.16 ל Microcon prewashed מנת להמשיך לרכז את ה-DNA. צנטריפוגה ב g 5000-10000 עבור 1-3 דקות. בדוק את כמות הנוזלעל צנטריפוגה מסנן וחזור עד לסכום של נוזל על המסנן מצטמצם μl כ 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את יחידת המסנן הפוך בצינור Microcon חדשים צנטריפוגות ב 1000 גרם במשך 3 דקות. הכמות האידיאלית של פתרון מרוכז הוא 50-60 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד ורשום את ריכוז ה-DNA על Nanodrop ולבדוק את איכות שיא (יש 260nm). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת aliquot קטן של ה-DNA לצינור Eppendorf נקי לעבודה מניות להקפיא בטמפרטורה של מינוס 20. מעבירים את שאר ה-DNA כדי לנקות שנייה Eppendorf להקפיא בטמפרטורה של מינוס 80. </li></ol> נציג תוצאות: כאשר פרוטוקול זה הוא נעשה בצורה נכונה, אתה אמור לראות תמונה ג&#39;ל אחרי צעד 4.4 בקביעת איכות DNA דומה באיור 1. ריכוז ה-DNA של תמציות בפועל ישתנו בהתאם למקור של המדגם. לאחר שלב 5.7 ב צנטריפוגה שיפוע CsCl, הדנ&quot;א הגנומי מואר באור כחול צריך להיראות דומה איור 2. <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig1newer.png" alt="איור 1" /> באיור 1. 0.8% agarose תמונה ג&#39;ל אלקטרופורזה של דנ&quot;א משקל מולקולרי גבוה שנאספו מארבע במעמקי ב subarctic האוקיינוס ​​השקט (בשני עותקים), מוכתם הסוכן intercalating ethidium ברומיד (10 מ&quot;ג / מ&quot;ל). הג&#39;ל היה לרוץ 15V עבור ~ 16hrs במאגר TBE 1X הג&#39;ל פועל. להקות לדוגמה הם באיכות טובה מראה מעט עדויות של הגז מכני (מראה להקות בודדות או מריחות בניגוד להקות מרובות) למרות תמציות 10m לשמור RNA כמה לשאת מעל (ראה למרוח בטווח Kb 0.5-2.0). <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. הלהקה הדנ&quot;א הגנומי מואר באור כחול לאחר צנטריפוגה שיפוע CsCl.

<ol>
	<li>Beja, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+BAC+or+not+to+BAC:+marine+ecogenomics.">To BAC or not to BAC: marine ecogenomics.</a> Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).</li><li>Beja, O., Suzuki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage.">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).</li><li>DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+oceans+interior.">Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li><li>Stein, J. L., Marsh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+uncultivated+prokaryotes:+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon.">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).</li><li>Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+rapid+method+for+the+direct+isolation+of+nucleic+acids+from+aquatic+environments.">A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).</li></ol>

תלוי כמה דוגמאות רבות להיות מעובד, זה יכול להיות הליך הזמן אינטנסיבית בשל שני צעדים הדגירה של שעה אחת, ואת שוטף חוזרות צעדים צנטריפוגה. עדיף לתכנן יומיים שלמים לצורך הליך זה להשאיר הרבה זמן. אם יש בעיות מקבל את נפח לחלץ הסופי בצינור Amicon להפחית עד 200 500μl במהלך ריכוז דנ&quo...

A correction was made to "<a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 ml RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 &#956;l RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.

A correction was made to <a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>. A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.

Erratum: DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1 cc syringe (26G5/8 needle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309597</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 ml syringe (26G5/8 needle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309597</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5ml eppendorf tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>0030 125.150</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CLS430791</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5cc syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amicon&reg; Ultra-4 Centrifugal Filter Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC801096</td>
<td>10,000 Nominal molecular weight limit</td>
</tr>
<tr>
<td>Butanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A383-1</td>
<td>Make it water saturated (butanol:water = 1:1)</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge rotor, JA5.3 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>368690</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge, Avanti&reg; J-E</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>369003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cesium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C4036</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chloroform:IAA (24:1)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>25666-500ML</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethidium Bromide (EtBr)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E1510-10ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E5134</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybridization oven</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-247-10</td>
<td>37&deg;C & 55&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Lysis Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)</td>
</tr>
<tr>
<td>Lysozyme</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L6876-5G</td>
<td>125 mg in 1000 &mu;l TE</td>
</tr>
<tr>
<td>Microcon&reg; Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>42410</td>
<td>50 bp cut off</td>
</tr>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>13-374-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>77617-500ML</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>19133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP2539-100</td>
<td>10 &mu;g/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Safe Imager&trade; Blue light transilluminator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S37102</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L4509</td>
<td>20% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Sterivex filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SVG010RS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0389</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Table top centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5415D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TE buffer, pH 8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma&reg; base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge rotor, TLA 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>343847</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>343775</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge tube rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>348302</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge, Optima&reg; Max</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dna extraction from 0.22 &mu;m sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation

שיטה זו משמשת כדי לחלץ DNA גנומי מולקולרי גבוה משקל מביומסה planktonic התרכז 0.22 מסננים מיקרומטר Sterivex כי טופלו למאגר אחסון / תמוגה לארכיון ב -80 ° C, כדי לטהר את ה-DNA באמצעות שיפוע צפיפות צזיום כלוריד. פרוטוקול מתחיל עם שני שעה צעדים הדגירה לשחרר את ה-DNA מתאי ולהסיר RNA. בשלב הבא, בסדרה של פנול: כלורופורם ו כלורופורם עקירות מבוצעות ואחריו צנטריפוגה להסיר חלבונים בממברנה מרכיבי התא, אוסף של תמצית ה-DNA מימית, וכמה חילופי חיץ צעדים כדי לרחוץ לרכז את תמצית. חלק חמישי מתאר את טיהור אופציונלי באמצעות שיפוע צזיום כלוריד צפיפות. מומלץ לעבוד עם פחות מ 15 דגימות בעת ובעונה אחת, כדי למנוע בלבול ולכרות זמן פרוטוקול. סך כל הזמן הנדרש פרוטוקול זה תלוי במספר דגימות להיעקר. במשך 10-15 דגימות בהנחה צנטריפוגה ציוד מתאים זמין, בפרוטוקול זה כולה צריכה לקחת 3 ימים. ודא שיש לך את התנורים הכלאה מוגדר הטמפרטורה בתחילת התהליך.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Extraction from 0.22 Î¼M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation at JoVE.com

DNA Extraction from 0.22 &amp;mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

אנו מתארים שיטה להפקת גבוה הדנ&quot;א הגנומי משקל מולקולרי מביומסה planktonic התרכז 0.22 מסננים מיקרומטר Sterivex, ואחריו צפיפות צזיום כלוריד צנטריפוגה שיפוע לטיהור.

הפקת DNA של 0.22 מיקרומטר מסננים Sterivex ו כלוריד צסיום צפיפות צנטריפוגה Gradient

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

dna-extraction-from-022-m-sterivex-filters-cesium-chloride-density

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

29.0K Views.  University of British Columbia - UBC. אנו מתארים שיטה להפקת גבוה הדנ"א הגנומי משקל מולקולרי מביומסה planktonic התרכז 0.22 מסננים מיקרומטר Sterivex, ואחריו צפיפות צזיום כלוריד צנטריפוגה שיפוע לטיהור.

Video: DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל הגנום מקרקעות ו משקעים

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

הפקת DNA מחומר פרפין Embedded עבור ניתוח גנטי epigenetic

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

הפקת DNA גבוהה מולקולרית משקל של מאטס מיקרוביאלית

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves is the site of several important biological processes, including cell wall formation, cellular nutrient and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses to pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique for the analysis of the soluble apoplast composition of various plant species. The fluid obtained by this method is commonly known as apoplast washing fluid (AWF). The following protocol describes an optimized vacuum infiltration and centrifugation method for AWF extraction from Phaseolus vulgaris (French bean) cv. Tendergreen leaves. The limitations of this method and the optimization of the protocol for other plant species are discussed. Recovered AWF can be used in a wide range of downstream experiments that seek to characterize the composition of the apoplast and how it varies in response to plant species and genotype, plant development and environmental conditions, or to determine how microorganisms grow in apoplast fluid and respond to changes in its composition.

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

טכניקת ההסתננות-צנטריפוגה להפקת Apoplastic נוזלים מצמח עלים שימוש<em&gt; Vulgaris Phaseolus</em&gt; כדוגמה

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

הפקת DNA שיטה היברידית להערכה איכותית וכמותית של הקהילות בקטריאלי מדוגמאות ייצור עופות

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

אוסף זרע באיכות דיפרנציאלית בעזרת צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and sequencing. The traditional proteinase K-based methods for genomic DNA extraction from C. elegans take several hours. Commercial extraction kits that effectively break open the C. elegans cuticle and extract genomic DNA are limited. An easy, faster (~15 min), and cost-efficient method of extracting C. elegans genomic DNA that works well for classroom and research applications is reported here. This DNA extraction method is optimized to use single or a few late-larval (L4) or adult nematodes as starting material for obtaining a reliable template to perform PCR. The results indicate that the DNA quality is suitable for amplifying gene targets of different sizes by PCR, permitting genotyping of single or a few animals even at dilutions to one-fiftieth of the genomic DNA from a single adult per reaction. The reported protocols can be reliably used to quickly produce DNA template from a single or a small sample of C. elegans for PCR-based applications.

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Presented here is a description of the straightforward and relatively rapid isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA from one or a few animals using a commercially available tissue kit. The resulting gDNA preparation is a suitable template for PCR.

מיצוי בקנה מידה קטן של Caenorhabditis elegans דנ"א גנומי

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...

בידוד משופר של בועיות חוץ-תאיות חיידקיות עבור מיקרוביוטה רב-אומית

Isolation and Purification of Bacterial Extracellular Vesicles from Human Feces Using Density Gradient Centrifugation

Bacterial extracellular vesicles (BEVs) are nanovesicles derived from bacteria that play an active role in bacteria-bacteria and bacteria-host communication, transferring bioactive molecules such as proteins, lipids, and nucleic acids inherited from the parent bacteria. BEVs derived from the gut microbiota have effects within the gastrointestinal tract and can reach distant organs, resulting in significant implications for physiology and pathology. Theoretical investigations that explore the types, quantities, and roles of BEVs derived from human feces are crucial for understanding the secretion and function of BEVs from the gut microbiota. These investigations also necessitate an improvement in the current strategy for isolating and purifying BEVs.
This study optimized the isolation and purification process of BEVs by establishing two density gradient centrifugation (DGC) modes: Top-down and Bottom-up. The enriched distribution of BEVs was determined in fractions 6 to 8 (F6-F8). The effectiveness of the approach was evaluated based on particle morphology, size, concentration, and protein content. The particle and protein recovery rates were calculated, and the presence of specific markers was analyzed to compare the recovery and purity of the two DGC modes. The results indicated that the Top-down centrifugation mode had lower contamination levels and achieved a recovery rate and purity similar to that of the Bottom-up mode. A centrifugation time of 7 h was sufficient to achieve a fecal BEV concentration of 108/mg.
Apart from feces, this method could be applied to other body fluid types with proper modification according to the differences in components and viscosity. In conclusion, this detailed and reliable protocol would facilitate the standardized isolation and purification of BEVs and thus, lay a foundation for subsequent multi-omics analysis and functional experiments.

מחבר זרקור: האצת המחקר על הפרדת שלפוחיות חוץ-תאיות חיידקיות והטרוגניות 

This study describes a method to isolate and purify bacterial extracellular vesicles (BEVs) enriched from human feces via density gradient centrifugation (DGC), identifies the physical characteristics of BEVs from morphology, particle size, and concentration, and discusses the potential applications of the DGC approach in clinical and scientific research.