עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות (1 R01 GM095384-01) הוענק ליער Rohwer. אנו מודים Epicentre, חברת Illumina למתן גישה מוקדמת לערכות Ribo-אפס לאפידמיולוגיה. אנו מודים למארק Hatay לעיצוב והייצור של בעל צינור ultracentrifugation. אנו מודים אנדריאס האס ובנימין נואלס לקריאה ודיונים של כתב היד קריטיים, ולורן פול לסיוע לתהליך הצילום.

The authors have nothing to disclose.

Metagenomics ויראלי חלקיקים נגיפיים מרוכזים באמצעות פוליאתילן גליקול ממטרים (PEG) או ריכוז נפח קטן. במקרים מסוימים, ייתכן שלא יהיה צורך בריכוז, אבל מראש סינון או צעדי צנטריפוגה במהירות נמוכים משמשים להסרת תאים האיקריוטים וחיידקים. lysates ויראלי יהיה מועשר יותר ומטוהר באמצעות ultracentrifugation צפיפות שיפוע 9,41 או מסנני גודל קטנים (למשל, 0.45 מיקרומטר) להסרת תאי חיידקים האיקריוטים וגדולים 25. ultracentrifugation שיפוע צפיפות מבוצע בדרך כלל עם פתרונות צפופים אבל אינרטי כגון כלוריד סוכרוז או צזיום לבודד ולהתרכז חלקיקים נגיפיים 41. הפרדה פיזית מבוססת על הגודל וצפיפות קלילה של חלקיקים נגיפיים. לכן, בחירה נכונה של גודל נקבובית מסנן וההכנה הקפדנית של מילויים הן חיוניים לבודד את הקהילות נגיפיות ספציפיות, כמו ההצלחה של ההתאוששות הפיסית שלVLPs קובע את הקהילה מבודדת 41 (כלומר, חלקיקים נגיפיים שאינו עוברים דרך המסנן או נפילה בתוך צפיפות החילוץ לא יזוהה בmetagenome). לאחר בידוד וריכוז נגיפיים, ייתכנו זיהום נוכחי חומר הגנומי שאינו נגיפי במדגם הן בצורה של חומצות גרעין וחופשיות של חיידקים ותאים האיקריוטים. לכן, זה קריטי כדי לוודא את טוהר של חלקיקים נגיפיים בדגימות (איורים 1 א ו -1 B). טיפול כלורופורם משמש בדרך כלל לlyse תאים הנותרים, ואחריו טיפול nuclease להשפיל חומצות גרעין חופשיות לפני מיצוי חומצות גרעין. אזהרה לעבודה שהוצגה הייתה השימוש בהפרדת שיפוע צפיפות לבודד חלקיקים נגיפיים כפי שהוא עשוי לכלול חלקיקים נגיפיים עטפו שעשויה להיות קליל מדי כדי להזין את שיפוע CsCl. חלופי &quot;לתפוס את כל-&quot; השיטה היא להשמיט separ שיפוע הצפיפותation ולבודד את ה- DNA הקהילה מ0.45 מיקרומטר - filtrates טופל בכלורופורם וDNase I. גישה זו היא גם מתאים כדי להתאים כרכי מדגם קטנים כמו אלה ממטליות או פלזמה דם. עם זאת, זה עלול לגרום לזיהום חיידקי כלורופורם עמיד וכמות גבוהה יותר של DNA תאי DNase I-עמיד. פרוטוקולי רצף הנוכחיים דורשים 1 ng עד 1 מיקרוגרם של חומצות גרעין להכנת ספריית רצף לפי תשואות DNA גבוהות יותר לספק מבחר רחב יותר של אפשרויות סידור. ריכוז ה- DNA של viromes נוצר לעתים קרובות נע בין מתחת לסף הגילוי ליותר מ -200 ng / μl. הסכום של חומצות גרעין נגיפיות התאוששו עשוי להיות מספיק להכנת ספריית רצף ישירה. במקרים כאלה, הגברה חומצות גרעין היא חיונית. ספריות הגברה רובה לינקר (LASLs) 2,42,43 והגברת הגנום כולו מבוססת על הגברה עקירה מרובה (מד&quot;א) הן שנישיטות נפוצות ביותר ליצירת DNA מספיק עבור סידור. שיטות מד&quot;א כגון אלה המבוססים על DNA פולימרז Phi29 ידועות סובלות מהטיות הגברה, ואולי מעדיפים להגביר ssDNA וDNA המעגלי, וכתוצאה מכך המיון שונה שאינו כמותיים ואפיון פונקציונלי 44,45. גרסה מותאמת של גישת LASLs הוכח להציג רק הטיות מינימליות, מקדמת רגישות גבוהה יותר (לכמויות קטנות של חומר מוצא), והוא מותאם בקלות לפלטפורמות שונות רצף 43. עם זאת, יש לו את הגישה שלבים רבים, דורשת ציוד מיוחד כדי להקטין את איבוד DNA, ומוגבל לתבניות dsDNA. במעבדה שלנו, גישה זו הותאמה בהצלחה להגברת כמות לזיהוי וגילוי של DNA שחולץ מlavage- רונכואלוואולרית, VLPs coral- וים-נגזרים המים (לא פורסם והורביץ et al. 46). יש לפתח צינורות ניתוח נתונים CLAssically היה אחד ההיבטים המאתגרים ביותר של ניתוח metagenomics הנגיפי בשל האופי המגוון מאוד וידוע ברובם של קהילות ויראלי. אמנם יש 10 8 גנוטיפים מוערכים נגיפיים בביוספרה, למאגרי מידע נגיפיים הנוכחיים תאריך להכיל ~ 4,000 הגנום נגיפי, שזה בערך 1 / 100,000 של גיוון נגיפי כולל משוער זה. לכן, חיפושים מבוססי דמיון (כגון תפציץ 47) למשימה הטקסונומי ופונקציונלית בmetagenomes הנגיפי יש אתגרים הגלומים. רצפים רבים נכשלים יש קווי דמיון משמעותיים לגנומים באתר, ולכן, מסווגים כידועים. למרות חיפושים מבוססי הומולוגיה הם היישומים החשובים ביותר לצורך קביעת טקסונומיה ולתפקד רצף נתונים, גישות חלופיות המבוססות על ניתוח של מסדי נתונים עצמאיים פותחו -48 50. Fancello et al. 51 מספקים סקירה של כלים חישוביים ואלגוריתמים המשמשים בVira מלאהmetagenomics l. החיידקים metagenomics בדרך כלל, את הסכום הכולל של ה- DNA שחולץ מקהילות hypotonic טופל תמוגה חיידקים (HL-DNA) נע בין 20 ng עד 5 מיקרוגרם. התשואה תלויה מאוד במצב בריאותו של המטופל ואת כמות מדגם ליחה שנאסף, מה שמסביר את השינויים ראו בתשואה הכוללת של HL-DNA שחולץ במחקר זה (טבלה 2). השלבים הקריטיים כדי להפיק נתונים רצף איכות טובה להסתמך על האיכות של ספריות רצף שנוצרו. איור 2 מציג מגוון גודל אופייני לספריות רצף שנוצרו מה- DNA של חיידקים שמקורם בכיח CF באמצעות הליך פיצול ה- DNA מבוסס האנזימטית. גודל הספרייה האופטימלי תלוי בבחירה של פלטפורמת רצף ויישום, ולכן, יכול להיות מותאם הליך הפיצול, במידת צורך, דרך גישות חלופיות כגון sonication ועִרפּוּל. בנוסף לתוצאות הנציג הציגו, ההצלחה של השיטה המוצגת בכיח CF שנאסף מחולים מרובים על פני נקודות זמן מרובות היא גם מאוירת באל Lim et. (2012) 9 וLim et al. (2014) 10. מחקרים קודמים 9,10 מציעים שכל חולה מטפח קבוצה ייחודית של קהילת חיידקים שעוברת לאורך זמן, ובכך משקף את ההתמדה של השחקנים המרכזיים בקהילה תוך תנודות צפויות עקב הפרעות כגון טיפולים אנטיביוטיים. אם תנודות אלה מתרחשות מדי יום גם ללא הפרעות חיצוניות או בשל שיטת דגימה ועיבוד מדגם, עדיין בשאלה. בהתבסס על metagenomic HL-DNA וניתוח amplicon 16S rDNA, דגימת אורך 7 הימים מראה כי התנודות יומיות של פרופילי חיידקים ללא ההפרעות אנטיביוטיות (יום 1, 2, ו -3) היה מינימאלי (איורים 3 א ו 3 ב &#39;). על introduction של אנטיביוטיקה דרך הפה מייד לאחר דגימת יום 3, שינויים בפרופיל הקהילה התבררו ביום 4. בעוד ציפרופלוקסצין האנטיביוטיקה מיועד למגוון רחב של חיידקים פתוגנים ידועים כגון P. aeruginosa, Staphylococcus aureus, ודלקת ריאות Streptococcus, הטיפול הגדילו את השפע היחסי של P. aeruginosa תוך הפחתת spp Streptococcus. ופ melaninogenica. לפי יום 6, הקהילה התאוששה לאט למבנה קהילת המוצא הראשוני. התוצאות מצביעות על כך שתנודות של פרופילים של חיידקים בתוך מטופל אחד יש סיכוי גבוה יותר בשל הפרעות קהילה בדרכי הנשימה. בהתחשב בעקביות בין פרופילי חיידקים של ספריות 16S rDNA וmetagenomes מDNA נגזר HL, שללנו ההטיות שמקורן בפריימרים 16S rRNA שימשו במחקר זה. הסבר אפשרי אחד להבדלים לראות פני הטקסונומית 16S rDNAפרופילי אל שנוצרו מDNA הכולל וDNA נגזר HL (איור 3) עשויים להיות הנוכחות של כמויות גבוהות של spp Pseudomonas. DNA תאי לאחר הטיפול האנטיביוטי. זו נתמכת על ידי הממצאים שההבדלים אלה היו בולטים ביותר ביום 7, שלושה ימים לאחר הטיפול באנטיביוטיקה, אשר מטרות spp Pseudomonas. בנוסף לאחרים. ציפרופלוקסצין משמש בדרך כלל כטיפול הקו הראשון בחולים עם CF ופ הכרוני זיהום aeruginosa למרות שהספקטרום של פעילותה כולל את רוב פתוגנים הקשורים CF. חוקרים שערנו כי הטיפול האנטיביוטי מבטל קהילות רגישות כולל spp Streptococcus. ולכן יצירת נישה מולא על ידי פ &#39;עמיד aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa עשוי להרוויח התנגדות באמצעות הגדלת קהילות biofilm וDNA תאי הוכח להיות התמיכה המבנית העיקרית של אדריכלות biofilm 52. אפילו כtהוא מבנה הקהילה התאושש, DNA תאי אולי נשאר בכיח CF. לכן, נתונים אלה מצביעים על כך שתמוגה hypotonic ושלבי הכביסה שהוצגו בעבודה זו עשויה להיות תועלת בכך שלא להסיר את ה- DNA המופק רק בני האדם, אבל DNA תאי גם הנגזרות של חיידקים שעלולות לסלף את הפרופילים של חיידקים בפועל. Metatranscriptomics איכות גבוהה metatranscriptome צריכה להכיל רצפי מעטים יחסית RNA ריבוזומלי (rRNA) ומייצגת דגימה משוחדת של תמלילי הקהילה (mRNA). בשל זמן מחצית החיים קצרים וכמות מוגבלת של mRNA, זה קריטי, כי הפרוטוקול, כפי שהוצג כאן, ממזער טיפול מדגם כדי למקסם את המספר של תמלילים התאוששו. בשנים האחרונות, במספר גישות לדלדול rRNA פותחו והותאמו בערכות זמינות מסחרי. אלה כוללים MICROB להעשיר, Ribo-אפס, ומדגם ספציפי h תוסףybridizations 53 המבוססים על הכלאת oligonucleotide, וmRNA בלבד הערכה המבוססת על RNA מיקוד הפעילות האנזימטית exonuclease מכיל monophosphate 5 &#39;. בנוסף, מספר גישות למוספים לmRNA כגון ערכת II-החיידקים MessageAmp שמעדיף polyadenylates ומגביר RNA ליניארי זמינות גם. חלק מהשיטות הללו (למשל, mRNA בלבד, Xpress MICROB E וMessageAmp) משמש במקביל ליעילות אופטימלית. עם זאת, היעילות של כל הגישות הללו מוגבלות, במיוחד כשעובדים עם rRNA המושפל באופן חלקי, כפי שנצפה לעתים קרובות בסך RNA שחולץ מן דגימות CF. ההגברה RNA polyadenylation תלוי לא ניתן להשתמש בם כדי ליצור metatranscriptomes מורכב משני mRNA אוקריוטים ופרוקריוטים. בנוסף, פולי הזנב () הוסיף לרצפים רשאי מפחית את כמות נתוני רצף שימושיים. אזורים עם מתיחות homopolymer נוטים לקבל ציוני איכות נמוכות יותר, גausing מספר משמעותי של קורא ליסונן על ידי רצף ותוכנה שלאחר רצף-, ואורך הקריאה השימושי הממוצע לאחר זמירה מפולי זנבות () יקטנו באופן משמעותי 54. התמודדות עם קהילות מורכבות של חיידקים CF ו- RNA המושפל באופן חלקי (איורים 4 א ו4C), המחקר הקודם שלנו הראה כי שיטת הכלאה-ידי לכידת ערכת זהב Ribo-Zero הייתה יותר יעילה בהסרת שני rRNA האדם וחיידקים בהשוואה לטיפולים משלבים שימוש ב ערכות אחרות 9 (לוח 3). נתונים כתוצאה מאפשר ניתוח מקביל של שני מארח אנושי ותמלילים של חיידקים. בהתאם לתפוקה והאיכות של RNA, כמו גם בחירה אולטימטיבית של פלטפורמת רצף, רב של תהליכים אלה כוללים את צעד סינתזת cDNA יכול להיות יעיל עם דור ספריית רצף. לדוגמא, RNA טופל Ribo-אפס יכול לשמש להכנת libra רצף metatranscriptomeריס באמצעות ערכת ScriptSeq RNA-Seq ספריית הכנה. ניתוח metagenomic של הקהילות הקשורים לבעלי חיים מספק ייצוג מקיף של הישות התפקודית הכוללת הכוללת את המארח והקהילות הקשורים אליו. העבודה שהוצגה כאן היא להתאמה למגוון של דוגמאות הקשורים לבעלי חיים מורכבים, במיוחד אלה המכילים ריר סמיך, כמויות גבוהות של פסולת תא, DNA תאי, חלבון ומתחמי גליקופרוטאין, כמו גם תאי מארח בנוסף לחיידקים ויראליים והרצויים חלקיקים. למרות שחלקיקים נגיפיים וחיידקים עלולים ללכת לאיבוד בכל שלב, חלקיקי בידוד וטיהור חיוניים כדי למזער את כמות ה- DNA מארח. בעוד נתוני metagenomics מספק פוטנציאל המטבולי של הקהילות שנבדקו, metatranscriptomics להשלים זאת על ידי חושף את ביטוי ההפרש של פונקציות מקודדות 9. הערכה מקיפה של נתונים גנומיקה ותמלילים הניבה תוספות חדשותights לדינמיקה של אינטראקציה קהילתית ומקל על פיתוח טיפולים לשיפור 9,10,55.

<html> קהילות ויראלי וחיידקים הקשורים לגוף האדם נחקרו בהרחבה בעשור האחרון באמצעות היישום של טכנולוגיות רצף 1,2. התוצאות הובילו להכרה בחשיבות החיידקים בבריאות ומחלות של בני אדם. היוזמה העיקרית הגיעה מהפרויקט האנושי Microbiome המתאר את החיידקים (וגם כמה חיידקים קדומים) המתגורר בעור אדם, ובתוך חלל פה, דרכי הנשימה, בדרכי מין ושתן, ומערכת עיכול 3. מחקרי Microbiome נוספים של דרכי הנשימה של אדם בריא באמצעות שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL) 4,5 ומטליות אף ולוע 4 הראו כי הריאות יכולות לשמש כמכשיר דגימה סביבתי, תוצאות בקולוניזציה של חיידקים חולפים בדרך הנשימה. עם זאת, ההשפעה של קולוניזציה חיידקים במשטחים בדרכי נשימה לקויה יכולה לגרום לזיהומי ריאות חמורים וכרוניים, כגון אלה שראו בסיסטיק פיברוזיס (CF) מטופלים. t &quot;&gt; CF הוא מחלה גנטית קטלנית הנגרמת על ידי המוטציה בסיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני הרגולטור (CFTR) גן 6. מוטציות אלה להצמיח חלבוני CFTR פגומים שבתורו משפיע על הובלת יון transepithelial פני משטח הפסגה של האפיתל. המחלה פוגעת מספר רב של מערכות איברים, אבל הרוב המכריע של תמותה ותחלואה מיוחסת למחלת ריאות CF 7. CF הריאות מספקת מערכת אקולוגית ייחודית להתיישבות חיידקים. הפגם בהובלת יון גורם ריר לבנות בדרכי נשימת CF, יצירת מייקרו-הסביבות מורכבות של אירובי , Microaerophilic, ותאים אנאירוביים מעוגנים על ידי משטח הרירי עשירים בחומרים מזין סטטי. סביבה זו מאפשרת התישבות ושגשוגם של חיידקים, כולל, חיידקים, ופטריות נגיפיות. אקוטי וזיהומי חיידקי ריאה כרוניים להוביל לתגובות חיסוניים קבועות, אבל לא אפקטיביות, וכתוצאה מכך שיפוץ נרחב בדרכי נשימה, אובדן כושר ריאות, ובסופו pulmoכישלון nary. קהילות חיידקים הקשורים לריאות CF תוארו גם באמצעות שני גישות תלויות התרבות ותרבות העצמאית, הכוללים שימוש ב16S RNA ריבוזומלי (rRNA) רצף של גנים 8 וmetagenomics רובה 9,10. הגישה מבוססת-rRNA 16S היא מסוגלת לאפיין מגוון רחב של מינים של חיידקים וללכוד משמרות רחבות במגוון קהילה. עם זאת, הוא מוגבל בהחלטתה בהגדרת הקהילות (מסוכם בClaesson et al. 2010 11) והתחזיות של פוטנציאלי חילוף חומרים מוגבלות לפונקציות הכלליות אלה ידועים למינים שזוהו. לכן, שיטות לקביעת רצף גן 16S rRNA אינן מספיקות לדיוק האנליטי הטקסונומי ופונקציונלי ההכרחי של קהילות חיידקים השונות הנמצאות בריאות CF. גישת metagenomic המתוארת כאן משלימה את הגישה מבוססת-rRNA 16S, מתגברת על המגבלות שלו, ומאפשרת דרך יעילה יחסיתכדי לנתח את שתי טקסונומיה קהילת חיידקים ותוכן גנטי בריאות CF. DNA של חיידקים שבודדו מהדגימות הקשורים לבעלי חיים לעתים קרובות מכיל כמות גדולה של DNA מארח. דגימות כיח או רקמת הריאה CF מכילות בדרך כלל כמות גדולה של DNA האנושי שפורסמה על ידי נויטרופילים בתגובה החיסונית, לעתים קרובות יותר מ- 99% של ה- DNA הכולל 12 - 14. למרות שחלק מתאים אנושיים שלמים יכולים להיות נוכחים, רוב ה- DNA הזה הוא חופשי בפתרון או את הספיחה של חיידקים. בנוסף, הנוכחות של תקעים צמיגים במיוחד ריר, סלולרית פסולת ומזהמים ידועים אחרים לסבך עוד יותר את הבידוד של תאי חיידקים. כמה שיטות נבדקו למדלדלות דגימות אלה של ה- DNA האנושי, כוללים שיפועי Percoll לאדם נפרד מתאי חיידקים 15, הטיפול בDNase אני, ethidium ברומיד monoazide להשפיל DNA האנושי 16, וערכת MolYsis, כל עם הצלחה מוגבלת באופן סלקטיבי.<html> עד כה הליך טיהור DNA של חיידקים היעילים ביותר לליחת CF כבר שינוי של התהליך שתואר על ידי Breitenstein et al. (1995) 17. גישה זו, במסמך הידוע בשם שיטת hypotonic תמוגה (HL), משתמשת בשילוב של β-mercaptoethanol כדי להפחית אג&quot;ח mucin דיסולפיד, תמוגה hypotonic של תאים האיקריוטים, ואני DNase טיפול בDNA המסיס 9. למרות חוסר חלופות שיטת HL העלתה חששות בשל (i) הטיות אפשריות הנובעות מתמוגה לא רצויה של חיידקים ו( ii) אם התנודות שנצפו בהרכב קהילת 9,10 הם תוצר של תנודות הקשורות לעיבוד המדגם. בנוסף לדור של metagenomes רובה, אנו לטפל בבעיות אלה על ידי השוואת הפרופילים גנטי 16S rRNA של DNA הכולל וDNA של חיידקים שחולץ מן שיטת HL באמצעות אותה הקבוצה של דגימות כיח שנאספו ממטופל אחד על פני שבעה ימים רצופים. אף אוזן גרון &quot;&gt; בהשוואה לקהילות חיידקים, האפיון של קהילות נגיפיות הקשורים לבעלי חיים הוא מוגבל 18,19 קהילות ויראלי בדרכי נשימת CF יש רק מאופיינות מינימאלית 20 -.. 22 המחקר metagenomic הראשון המאפיין את ה- DNA של קהילות ויראלי בדרכי נשימת CF הראה כי רוב הווירוסים הקשורים לריאות CF הם פאגים 20. הפוטנציאל המטבולי של הפאג בCF ויחידים שאינם CF היה שונה באופן משמעותי. באופן ספציפי, קהילות הפאג באנשי CF נשאו גנים רעיוני של עיבודי מארח חיידקים לפיסיולוגיה של דרכי הנשימה CF, ומחקרי חיידקי ארסיות 20. לאחר metagenomic של וירוסים ברקמת הריאה CF הפגינו ההטרוגניות המרחבית שונה של קהילות נגיפיות בין אזורים אנטומיים 22. בנוסף, רקמת הריאה CF טיפחה את המגוון הנגיפי הנמוך ביותר שנצפה עד כה בכל מערכת אקולוגית 22. רוב הווירוסים שזוהו היו פאגיםעם הפוטנציאל להדביק פתוגנים CF. עם זאת, וירוסים האיקריוטים כגון herpesviruses, אדנו-וירוסים, ווירוסי הפפילומה אנושיים (HPV) היו גם זוהו. באירוע אחד, שבו ציסטות ברקמת הריאה נצפו במהלך נתיחה, יותר מ 99% מהגנום וירוס הפפילומה אנושי היה התאושש, למרות שהמטופל מעולם לא אובחן עם הפפילומה או קרצינומה של ריאות. זה מצביע על כך הווה הגיוון הנגיפי משקף לא רק את חומרת נזק לרקמות, אלא גם עלול לחשוף ולהסביר מחלה uncharacterized בסיסית. הפרוטוקולים שתוארו כאן מספקים דרך פשוטה, אך רבת עוצמה לבודד את חלקיקים נגיפיים דמוי (VLPs) מדגימות שמורכבות מכמויות גדולות של ריר סמיך, מארח ותאי חיידקים, DNA החופשי, כמו גם פסולת תא. משלים metagenomics, metatranscriptomics משמש כדי לפקח על הדינמיקה בביטוי גנים ברחבי קהילת החיידקים והמארח 9,23. במקרה זה, שני חיידקים והוזt mRNA צריך להיבחר באופן מועדף. מאז mRNAs חיידקים אינם polyadenylated, לא ניתן לנצל שיטה נפתחת mRNA מבוסס אוליגו-DT. ההגברה RNA polyadenylation תלוי לא ניתן להשתמש בדגימות הקשורים מארח אם הדגימות ידועות מכילות כמויות גדולות של mRNA אוקריוטים. דוגמאות רבות הקשורים בבעלי חיים, כוללים ליחה CF, מכילות צפיפות גבוהה של תאים בנוסף לסכומים גבוהים של פסולת הסלולר וnucleases הכוללים RNases. לכן, עוד משימה מאתגרת היא למנוע השפלה RNA נרחבת במהלך metatranscriptome עיבוד. ברוב המקרים, רנ&quot;א הכל חולץ מליחת CF הוא מושפל באופן חלקי, המגביל את היישומים ושירות במורד הזרם של RNA נגזר. בשנים האחרונות, במספר גישות לדלדול rRNA פותחו והותאמו בערכות זמינות מסחרי. היעילות של גישות אלה עם זאת מוגבל, במיוחד כשעובדים עם אופן חלקי מושפל 9,24 rRNA. השיטות המועסקות כאן לאפשרed לאחזור של רנ&quot;א הכל המושפל באופן חלקי המתאים להסרה מוחלטת rRNA במורד הזרם יעיל. השוואה ישירה של היעילות בהסרת rRNA מרנ&quot;א הכל המושפל באופן חלקי השוואת שתי ערכות שונות שהומחש על ידי אל Lim et. (2012) 9. בסך הכל, המטרה של כתב היד הזה היא לספק סט שלם של פרוטוקולים (איור 1) כדי ליצור metagenomes רובה נגיפי וחיידקים, וmetatranscriptome, ממדגם הקשורים לבעלי חיים יחיד, תוך שימוש במדגם ליחה נגרם כדוגמא. עבודה מעבדה מולקולרית צריכה לכלול אזורים נפרדים הגברה לפני ואחרי כדי למזער את הזיהום צולב. השיטות להתאמה בקלות לסוגי מדגם אחרים, כגון רקמה 22, אף ולוע ומטליות לוע תחתונים 25, שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL) ואלמוגים (נתונים שלא פורסמו). כל דגימה צריכה להיות מעובד מייד עם אוסף במיוחד כאשר metagenomics חיידקים ונפגשהמחקרי atranscriptomics הם רצויים. אם הדגימות הוקפאו, הוא מגביל את הבידוד של תאי חיידקים שלמים לmetagenomes חיידקים כהקפאת פוטנציאל לשבש את שלמות התא. עם זאת, הקפאה אינה מונעת metatranscriptomics ובידוד נגיפי, אבל איכות של RNA וכמות חלקיקים נגיפיים התאוששו עשויה להיות מושפע בתהליך ההפשרה הקפאה. חשוב לציין כי ליחה מושרה שימשה כמקור העיקרי של דגימות במחקרים רבים הקשורים לחולי CF מבוגרים ומחלות ריאה כרוניות אחרות 26,27 כBAL יכול להיות פולשני מדי. במחקרים שלנו, דגימות כיח נאספו עם שיטה זהירה ועקבית דגימה, כלומר, מי פה הבא ושטיפה של חלל הפה באמצעות תמיסת מלח סטרילית כדי לשמור על זיהום חיידקים אוראליים בתוך דגימות הליחה למינימום.

<table><tbody><tr><td>Guanidine isothiocyanate-based RNA lysis buffer</td><td>Life Technologies</td><td>10296-028</td><td>TRIzol LS Reagent was used in this study</td></tr><tr><td>Silica beads; 0.1 to 0.15 mm</td><td>Cole-Parmer</td><td>YO-36270-62</td><td>Zirconia-silicate beads were used in this study</td></tr><tr><td>Dithiothreitol, molecular grade (dry powder)</td><td>Promega</td><td>V3155</td><td>Can be purchased from any other company</td></tr><tr><td>Sterile syringe filter; 0.45 &amp;micro;m pore size hydrophilic PVDF membrane</td><td>Millipore</td><td>SLHV033RS</td><td></td></tr><tr><td>DNase I enzyme&amp;nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>260913</td><td></td></tr><tr><td>Sterile syringe filter; 0.02 &amp;micro;m pore size</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-13</td><td>Diameter: 25 mm</td></tr><tr><td>Ultra-clear centrifuge tubes</td><td>Beckman</td><td>344059</td><td>9/16 x 3 &amp;frac12; in. (14 x 90 mm), suitable for SW41 Ti Rotor and VLPs density gradient ultracentrifugation</td></tr><tr><td>SW41 Ti Rotor</td><td>Beckman</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>SS-34 fixed angle rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 DNA polymerase</td><td>Monserate Biotech</td><td>4001</td><td>10 U/&amp;micro;l</td></tr><tr><td>Phi29 Random Hexamer</td><td>Thermo Scientific</td><td>S0181</td><td>Previously bought from Fidelity Systems</td></tr><tr><td>Alumina matrix filter with annular polypropylene support ring; 0.02 &amp;micro;m pore size</td><td>FisherScientific</td><td>09-926-34</td><td>Whatman Anodisc filter membranes were used in this study; diameter 25 mm</td></tr><tr><td>SYBR Gold nucleic acid gel stain</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free DNase I&amp;nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td>Can be purchased from any other company</td></tr><tr><td>Glycogen, RNA grade</td><td>FisherScientific</td><td>FERR0551</td><td>Can be purchased from any other company</td></tr><tr><td>Oak Ridge high-speed centrifuge tubes</td><td>FisherScientific</td><td>05-562-16B</td><td>For large volume DNA extraction procedure, suitable for SS-34 fixed-angle rotor</td></tr><tr><td>Total rRNA removal kit</td><td>Epicentre</td><td>MRZE724</td><td>ScriptSeq Complete Gold Kit (Epidemiology) can be used to couple rRNA removal with sequencing library preparation</td></tr><tr><td>Cesium chloride&amp;nbsp;</td><td>FisherScientific</td><td>BP1595-500</td><td></td></tr><tr><td>Hexadecytrimethyl-ammonium bromide (CTAB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5882-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

purifying the impure: sequencing metagenomes and metatranscriptomes from complex animal-associated samples

הנגישות של רצף תפוקה גבוהה יש מהפכה בתחומים רבים של ביולוגיה. על מנת להבין טוב יותר קהילות נגיפיות וחיידקים הקשורים מארח, עבודה מקיפה להפקת DNA ו- RNA פותחה. העבודה במקביל יוצרת metagenomes נגיפי וחיידקים, כמו גם metatranscriptomes, ממדגם יחיד עבור סידור הדור הבא. הצימוד של גישות אלה מספק סקירה של שני מאפייני המיון השונים ופונקציות הקהילה מקודדת. שיטות שהוצגו להשתמש סיסטיק פיברוזיס ליחה (CF), סוג מדגם בעייתי, משום שהוא צמיג במיוחד ומכיל כמות גבוהה של mucins, DNA נויטרופילים חופשי, ומזהמים אחרים לא ידועים. הפרוטוקולים שתוארו כאן למקד את הבעיות הללו והצלחה לשחזר DNA הנגיפי וחיידקים עם זיהום הדנ&quot;א אנושי מינימאלי. כדי להשלים את לימודי metagenomics, פרוטוקול metatranscriptomics היה מותאם להתאושש שני החיידקיםוmRNA מארח המכיל רצפי מעטים יחסית RNA ריבוזומלי (rRNA). סקירה של מאפייני הנתונים מוצגת ללשמש כנקודת התייחסות להערכת ההצלחה של השיטות. דגימות כיח CF נוספות גם נאספו ל( i) להעריך את העקביות של פרופילי Microbiome על פני שבעה ימים רצופים בתוך מטופל בודד, וכן (ii) להשוות את העקביות של גישת metagenomic לסידור המבוסס על גן 16S RNA ריבוזומלי. התוצאות הראו כי תנודות יומיות של פרופילי חיידקים ללא ההפרעות אנטיביוטיקה היו מינימליות ופרופילי טקסונומיה של החיידקים הקשורים CF הנפוצים היו דומים מאוד בין ספריות 16S rDNA וmetagenomes שנוצרו מDNA תמוגה hypotonic (HL) -derived. עם זאת, ההבדלים בין פרופילי מיון שונים 16S rDNA שנוצרו מDNA הכולל וDNA נגזר HL מציעים שתמוגה hypotonic והצעדים הכביסה ליהנות בלא הסרת DNA האדם נגזר בלבד, אלא גם של חיידקים שמקורם בextracellulDNA ar שעלול לסלף את הפרופילים של חיידקים בפועל.

Watch this Scientific Journal Video about Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples at JoVE.com

Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

שימוש בדרכי נשימת סיסטיק פיברוזיס כדוגמא, את כתב היד מציגה עבודה מקיפה הכוללת שילוב של גישות metagenomic וmetatranscriptomic לאפיין את החיידקים וקהילות נגיפיות בדגימות הקשורים לבעלי חיים.

טיהור הלא טהור: Metagenomes הרצף וMetatranscriptomes מדוגמאות הקשורים בבעלי חיים מורכבות

The accessibility of high-throughput sequencing has revolutionized many fields of biology. In order to better understand host-associated viral and ...

purifying-impure-sequencing-metagenomes-metatranscriptomes-from

Research

JoVE Journal

Biology

37.2K Views.  San Diego State University.  שימוש בדרכי נשימת סיסטיק פיברוזיס כדוגמא, את כתב היד מציגה עבודה מקיפה הכוללת שילוב של גישות metagenomic וmetatranscriptomic לאפיין את החיידקים וקהילות נגיפיות בדגימות הקשורים לבעלי חיים. 

Video: Purifying the Impure: Sequencing Metagenomes and Metatranscriptomes from Complex Animal-associated Samples

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Metagenomic ניתוח של תחמיץ

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Genetics

An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Metaproteomics זרימת עבודה Aquatic מיקרוביאלית: מתאים לtryptic פפטידים מתאימים לניתוח מבוסס ספקטרומטריית מסת טנדם

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

Environment

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

לחקור את השורש Microbiome: שליפת נתונים הקהילה חיידקי מן האדמה, Rhizosphere, Endosphere שורש

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a larger genomic context. Subtractive genomics enables a researcher to isolate a target sequence of interest (T) by comprehensive sequencing and subtracting out known genetic elements (reference, R). The method can be used to identify novel sequences such as mitochondria, chloroplasts, viruses, or germline restricted chromosomes, and is particularly useful when T cannot be easily isolated from R. Beginning with the comprehensive genomic data (R + T), the method uses Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) against a reference sequence, or sequences, to remove the matching known sequences (R), leaving behind the target (T). For subtraction to work best, R should be a relatively complete draft that is missing T. Since sequences remaining after subtraction are tested through quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR), R does not need to be complete for the method to work. Here we link computational steps with experimental steps into a cycle that can be iterated as needed, sequentially removing multiple reference sequences and refining the search for T. The advantage of subtractive genomics is that a completely novel target sequence can be identified even in cases in which physical purification is difficult, impossible, or expensive. A drawback of the method is finding a suitable reference for subtraction and obtaining T-positive and negative samples for qPCR testing. We describe our implementation of the method in the identification of the first gene from the germline-restricted chromosome of zebra finch. In that case computational filtering involved three references (R), sequentially removed over three cycles: an incomplete genomic assembly, raw genomic data, and transcriptomic data.

The purpose of this protocol is to use a combination of computational and bench research to find novel sequences that cannot be easily separated from a co-purifying sequence, which may be only partially known.

גילוי רצף הרומן מאת גנומיקה מופחתים

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

רצף של mRNA מתוך דם שלם באמצעות רצפי Nanopore

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

מרבב תא יחיד mRNA ניתוח הרצף של העכבר תאים עובריים

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Developmental Biology

Single Cell Multiplex Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction After Patch-clamp

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers easy identification and characterization of these cell types, prerequisites to study their specific functions. This article describes the multiplex single cell reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) protocol, which allows, after patch-clamp recording in slices, to detect simultaneously the expression of tens of genes in a single cell. This simple method can be implemented with morphological characterization and is widely applicable to determine the phenotypic traits of various cell types and their particular cellular environment, such as in the vicinity of blood vessels. The principle of this protocol is to record a cell with the patch-clamp technique, to harvest and reverse transcribe its cytoplasmic content, and to detect qualitatively the expression of a predefined set of genes by multiplex PCR. It requires a careful design of PCR primers and intracellular patch-clamp solution compatible with RT-PCR. To ensure a selective and reliable transcript detection, this technique also requires appropriate controls from cytoplasm harvesting to amplification steps. Although precautions discussed here must be strictly followed, virtually any electrophysiological laboratory can use the multiplex single cell RT-PCR technique.

This protocol describes the critical steps and precautions required to perform single cell multiplex reverse transcription polymerase chain reaction after patch-clamp. This technique is a simple and effective method to analyze the expression profile of a predetermined set of genes from a single cell characterized by patch-clamp recordings.

תגובת שרשרת של פולימראז מולטיפלקס שעתוק במהופך תא בודד לאחר תיקון-קלאמפ

The cerebral cortex is composed of numerous cell types exhibiting various morphological, physiological, and molecular features. This diversity hampers ...

Neuroscience

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the long-lasting gold standards is to sequence 16S ribosomal RNA (rRNA) gene amplicons generated by domain-level PCR reactions amplifying from genomic DNA. Traditionally, this was performed by cloning and Sanger (capillary electrophoresis) sequencing of PCR amplicons. The advent of next-generation sequencing has tremendously simplified and increased the sequencing depth for 16S rRNA gene sequencing. The introduction of benchtop sequencers now allows small labs to perform their 16S rRNA sequencing in-house in a matter of days. Here, an approach for 16S rRNA gene amplicon sequencing using a benchtop next-generation sequencer is detailed. The environmental DNA is first amplified by PCR using primers that contain sequencing adapters and barcodes. They are then coupled to spherical particles via emulsion PCR. The particles are loaded on a disposable chip and the chip is inserted in the sequencing machine after which the sequencing is performed. The sequences are retrieved in fastq format, filtered and the barcodes are used to establish the sample membership of the reads. The filtered and binned reads are then further analyzed using publically available tools. An example analysis where the reads were classified with a taxonomy-finding algorithm within the software package Mothur is given. The method outlined here is simple, inexpensive and straightforward and should help smaller labs to take advantage from the ongoing genomic revolution.

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.

מבחני כתב מקבילים מסיבי בתאי יונקים בתרבית

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective and widely available vaccines are lacking for a majority of these diseases, necessitating the development of novel disease mitigation strategies. To this end, a promising avenue of disease control involves targeting the vector microbiome, the community of microbes inhabiting the vector. The vector microbiome plays a pivotal role in pathogen dynamics, and manipulations of the microbiome have led to reduced vector abundance or pathogen transmission for a handful of vector-borne diseases. However, translating these findings into disease control applications requires a thorough understanding of vector microbial ecology, historically limited by insufficient technology in this field. The advent of next-generation sequencing approaches has enabled rapid, highly parallel sequencing of diverse microbial communities. Targeting the highly-conserved 16S rRNA gene has facilitated characterizations of microbes present within vectors under varying ecological and experimental conditions. This technique involves amplification of the 16S rRNA gene, sample barcoding via PCR, loading samples onto a flow cell for sequencing, and bioinformatics approaches to match sequence data with phylogenetic information. Species or genus-level identification for a high number of replicates can typically be achieved through this approach, thus circumventing challenges of low detection, resolution, and output from traditional culturing, microscopy, or histological staining techniques. Therefore, this method is well-suited for characterizing vector microbes under diverse conditions but cannot currently provide information on microbial function, location within the vector, or response to antibiotic treatment. Overall, 16S next-generation sequencing is a powerful technique for better understanding the identity and role of vector microbes in disease dynamics.

Here we present a next-generation sequencing protocol for 16S rRNA sequencing which enables identification and characterization of microbial communities within vectors. This method involves DNA extraction, amplification and barcoding of samples through PCR, sequencing on a flow-cell, and bioinformatics to match sequence data to phylogenetic information.

אפיון Microbiome שנתות על-ידי מטוסי אף-16 הדור הבא rRNA אמפליקון רצף

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...