Wir möchten den kanadischen Stiftung für Innovation, der British Columbia Knowledge Development Fund und der National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada für die Unterstützung laufender Studien auf niedrigem Sauerstoffgehalt Regionen der Küsten-und offenen Meer zu danken. JJW wurde durch Stipendien von NSERC und DAW unterstützt durch Stipendien von NSERC, Killam und die TULA Stiftung finanziert Zentrum für Mikrobielle Diversität und Evolution unterstützt. SL wurde von der Stiftung finanziert TULA Zentrum für Mikrobielle Diversität und Evolution unterstützt.

Hinweis: Alle Reagenzien dieses Protokoll verwendet werden vom Labor Aktien in kleinere Arbeitsgruppen Aktien-das ist sehr wichtig, um eine Kreuzkontamination der DNA-Proben und Kontamination von Labor-Bestände zu vermeiden aliquotiert. Auch beim Pipettieren, stellen Sie sicher, Pipettenspitzen für jede zusätzlich um eine Kreuzkontamination zu vermeiden, ändern. Part One: Cell Lysis und Verdauung <ol><li> Beginnen Sie dieses Protokoll durch Auftauen der Sterivex Filtern, die zuvor konzentriert planktonischen Biomasse enthalten auf dem Eis. Der Einfachheit halber hier beschreiben wir das Verfahren für die Verarbeitung eines einzelnen Filters. In der Praxis empfehlen wir die Verarbeitung von 16 oder weniger Filter auf einmal. </li><li> Sobald der Filter hat aufgetaut, beginnt die erste von zwei Inkubationen: eine, um die Zellen zu lysieren und entfernen RNA, und einer zu brechen Proteine. Für die erste Inkubation mit 100 ul Lysozym (125 mg in 1000 ul TE) und 20 ml RNase A (10 pg / ml), um den Filter. Verschließen Sie die Filter mit Parafilm und lassen Sie es in der Hybridisierungsofen bei 37 ° zu drehen C für 1 Stunde. </li><li> Für die nächsten Inkubation mit 100 ul Proteinase K und 100 ul 20% SDS, um den Filter. Reseal mit Parafilm und lassen Sie es 1-2 Stunden mehr in der Hybridisierungsofen drehen, diesmal bei 55 ° C. </li><li> Mit einer Spritze 5ml, übertragen Sie die Lysat aus dem Sterivex Filter in einen 15 ml Falcon-Röhrchen. Spülen Sie den Filter mit 1 ml Lysepuffer und fügen Sie die Spülflüssigkeit zum Lysat in Ihrem Falcon-Röhrchen mit dem 5cc Spritze. Jetzt haben Sie aufgeschlossen und verdaut Ihre Zellen, sind Sie bereit, ihre DNA zu extrahieren. </li></ol> Zweiter Teil: DNA-Extraktion <ol><li> Der nächste Schritt ist es, die Phenol-Chloroform-Methode verwenden, um die DNA aus dem Lysat zu extrahieren. Fügen Sie dem gleichen Volumen (ca. 3 ml) von Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol (IAA) zum Lysat Rohr, achten Sie darauf, Pipettenspitzen für jedes zusätzlich zu ändern, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Vortex für 10 Sekunden, um gut zu mischen. </li><li> Drehen Sie das Rohr bei 2500 g für 5 Minuten, so dass Sie sicher, dass die Zentrifuge ist ausgewogen. Während des Laufs sollten die Phenol-Chloroform-Lysat Gemisch in zwei Schichten zu trennen: eine organische Schicht, die das Phenol, Chloroform und Proteine ​​aus Ihrer Probe, auf dem Boden, und eine wässrige Schicht, die aus Ihrer DNA, aus Wasser besteht, und andere mehr hydrophilen Molekülen, an der Spitze. </li><li> Übertragen Sie die wässrige Schicht (mit Ihrer DNA) in ein neues 15 ml Falcon-Röhrchen. Achten Sie darauf, die Schnittstelle mit der Pipettenspitze (immer verlassen eine kleine Menge der wässrigen Schicht hinter) berühren. </li><li> Um dieses neue Rohr, das gleiche Volumen (ca. 3 ml) von Chloroform: IAA, achten Sie darauf, Pipettenspitzen für jedes zusätzlich zu ändern, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Vortex für 10 Sekunden. Dieser Schritt hilft, um alle verbleibenden Phenol aus Ihrer DNA-Probe zu entfernen. </li><li> Spin bei 2500 g für 5 Minuten oder bis wässrige Schicht ist klar. Transfer wässrige Schicht in eine neue, etikettiert Falcon-Röhrchen und 1 ml TE bei pH 8,0, darauf achten, daß die Schnittstelle mit der Pipettenspitze (immer verlassen eine kleine Menge der wässrigen Schicht hinter) berühren. Diese wässrige Schicht enthält Ihre DNA zu extrahieren. </li></ol> Dritter Teil: DNA-Konzentration und Waschen <ol><li> Der nächste Schritt ist sich zu waschen und konzentrieren die DNA-Probe in einer 15 ml Amicon Ultra-Zentrifugenröhrchen. Die Amicon Rohre bestehen aus einem Filter, der Moleküle bleibt bei oder über einem bestimmten Molekulargewicht (Retentat) und eine Rohrleitung in den Flow-Through-catch (das Filtrat). In diesem Fall behält der Filter Ihre DNA (Retentat). Übertragen Sie Ihre DNA-Extrakt aus Schritt 2.5, um den Filter-Fach eines Amicon Ultra Tube. </li><li> Spin bei 3500 g für 10 Minuten. Vergewissern Sie sich, es ist weniger als 1 ml Flüssigkeit in der Amicon Filter zurückgehalten. Wenn mehr Retentat bleibt, füllen Sie den Filter mit TE und wieder zu drehen. Achten Sie darauf, eine frische Pipettenspitze für jedes TE zusätzlich nutzen, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. </li><li> Entfernen Sie die Flow-Through-oder Filtrat, zum anderen Falcon-Röhrchen und speichern Sie sie im Kühlschrank bis Sie Ihr endgültiges DNA-Produkt auf einem Gel bestätigt haben (Teil IV). </li><li> 2 ml TE-Puffer auf die Amicon-Filter und Spin bei 3500 g für 6 Minuten, so dass Sie sicher, dass eine frische Pipettenspitze für jedes TE zusätzlich nutzen, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Pool Filtrat mit diesem Schritt 3,3 und in den Kühlschrank zu speichern. </li><li> Waschen Sie die DNA zweimal mit TE für insgesamt drei Waschungen (achten Sie darauf, immer eine frische Pipettenspitze) und speichern das Filtrat jedes Mal (nach Stufen 3,3 und 3,4). In den letzten waschen, schleudern, bis 200 bis 500 ml Retentat verbleibt in der Amicon-Filter. Notieren Sie sich die letzte Band und Übertragung der Retentat (mit Ihrer DNA), um ein markiertes 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. </li></ol> Vierter Teil: Bestimmung der DNA-Qualität <ol><li> Überprüfen Sie die DNA-Qualität und schätzen Sie die Konzentration der DNA, indem Sie Ihre Proben auf einem Gel 0,8% Agarosegel stainiert mit 1ml Ethidiumbromid (EtBr) über Nacht. (Seien Sie äußerst vorsichtig bei der Verwendung von EtBr-it ist ein bekanntes Mutagen und Verdacht, krebserzeugend zu. Stellen Sie sicher, Handschuhe zu oft ändern und vermeiden EtBr übertragen, um den Rest des Labors und die Haut.) Legen Sie die Proben neben DNA-Leitern, die als dienen Größe und Intensität Standards (siehe nächster Schritt). </li><li> In den ersten paar Gassen, laden Leitern mit Bands verschiedener Molekulargewichte und Konzentrationen. Wir empfehlen die folgenden Be-Muster: in der ersten und letzten Bahnen (äußerste Fahrstreifen), Last 10 ul der 50ng/μl von 1kb + oder 2log Leiter. In den Spuren 2,3 und 4, Last 2 ul, 5 ul, und 10 ul jeweils von 50ng/μl λHindIII Leiter. Schließlich Last 5 ul pro Bahn von DNA-Extrakt mit Farbstoff für jede Probe. </li><li> Führen Sie das Gel bei 15 Volt für etwa 16 Stunden (wir empfehlen Nacht läuft). </li><li> Am nächsten Tag, fotografieren das Gel mit einer UV-Gel-Dokumentations-System. Zur Bestimmung der Molekulargewichtsbereich der DNA und ihrer Konzentration, vergleichen Sie die Probe Bands Bands der Leitern. Gute Qualität DNA wird mit hohem Molekulargewicht (&gt; 36kb), und zeigen kaum Anzeichen für Scheren / Abbau. Siehe Abbildung 1. </li></ol> Fünfter Teil: Cäsiumchlorid Gradienten Zentrifugation <ol><li> Wenn die DNA-Qualität ist gut und die Menge ausreichend ist, können Sie fortfahren, um die DNA von der Durchführung einer Cäsiumchlorid (CsCl)-Gradienten-Zentrifugation gereinigt. Beachten Sie, dass diese Reinigung Schritt ist optional und ist nicht notwendig für alle Downstream-Anwendungen (zum Beispiel, wenn Sie Fosmid Bibliotheken Sie reinigen zu generieren, während, wenn Sie einfach nur PCR-Reaktionen durchzuführen, Reinigung normalerweise nicht notwendig ist wollen). Beschriften Sie zuerst ein Zentrifugenröhrchen für jede Probe. </li><li> Zu jedem Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 160 mg CsCl, 178 ul von genomischer DNA. Nach der Zugabe von CsCl und DNA, um das Rohr legen ein kleines Stück Parafilm auf dem Rohr und sanft das Röhrchen 1-20 mal, um die Komponenten zu mischen. Mischen Sie nicht durch Pipettieren, kann dazu führen, Scheren der DNA. Anschließend fügen Sie 10 ul 10 ug / ul EtBr um dieses Rohr und mischen Sie es in der gleichen Weise. (Seien Sie äußerst vorsichtig bei der Verwendung von EtBr-it ist ein bekanntes Mutagen und Verdacht, krebserzeugend zu. Stellen Sie sicher, Handschuhe zu oft ändern und vermeiden EtBr übertragen, um den Rest des Labors und die Haut.) </li><li> Stellen Sie sicher, dass das Gewicht aller Rohre vor dem Zentrifugieren, so dass das Gewicht Unterschiede zwischen den Röhren von weniger als 1 mg sind ausgewogen. </li><li> Die Röhrchen im Rotor mit hemostat, den Deckel schließen und Ort der Rotor im Inneren der Ultrazentrifuge. </li><li> Schließen Sie die Tür Ultrazentrifuge. Vacuum wird, sobald Sie die Tür zu schließen angewendet werden. Run über Nacht bei 100.000 rpm für 18 Stunden und 20 ° C. </li><li> Wenn Zentrifugation abgeschlossen ist, nehmen Sie die Rohre aus dem Rotor mit hemostat und auf ein Rohr Rack. </li><li> Visualisieren Sie die DNA mit blauem Licht Transilluminator, oder wenn nicht verfügbar, verwenden Sie langwelligen UV-Licht, in einem dunklen Raum. Tragen Sie ein Paar gelbe Filtergläser der DNA-Bande zu sehen. Siehe Abbildung 2. </li><li> Mit einem sterilen 1cc Spritze und Nadel (26G 08.05), zu entfernen DNA-Bande und legen Sie sie in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Um wieder die meisten der DNA in den toten Raum in der Spritze befindliche, spülen Spritze mit 100 ul TE und fügen Sie die abgespült Lösung für das Rohr. Bereiten Sie eine Tube mit 100 ul TE-Puffer pro Probe, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. </li><li> So entfernen Sie EtBr aus der DNA, das gleiche Volumen an Wasser-Butanol auf die Tube, drehen Sie die Röhren vorsichtig 1-20 mal, Zentrifuge bei 10000 rpm für 1 Minute und entsorgen Sie die obere Schicht. </li><li> Wiederholen Sie die Wäsche, bis die Farbe von Butanol ist transparent, 3 bis 4 mal. </li><li> Platz 4 ml TE in einer Amicon Ultra-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie die DNA-Lösung von oben. </li><li> Zentrifugation bei 3500 g bei Raumtemperatur, bis die DNA Volumen ca. 100-500 ul (ca. 6-7 Minuten) reduziert wird, und entsorgen Sie die Flow-Through. </li><li> Add 2ml TE zu Amicon-Filter und Zentrifuge bei 3500 g für 6 Minuten, so dass Sie sicher, dass eine frische Pipettenspitze für jedes zusätzlich nutzen, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden. Zweimal wiederholen. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf ein Endvolumen von 50-100 ul durch zusätzliche Zentrifugation wie nötig und übertragen Sie die DNA-Lösung auf dem Filter in ein neues 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen. </li><li> Zugabe von 40 ul TE zum Amicon-Filter und Pipette auf und ab entlang der beiden Filtermembranen zu waschen alle verbleibenden DNA. Fügen Sie diese Lösung, um das Rohr in 5,15. </li><li> Legen Sie eine Microcon YM-30-Filter-Einheit in eine Microcon Rohr und Vorwäsche der Microcon durch Zugabe von 200 ul autoklaviert Wasser und Zentrifugieren bei 10000 rpm für 7 Minuten. </li><li> Fügen Sie die DNA-Lösung von 5.16 bis die vorgewaschen Microcon um weiter zu konzentrieren die DNA. Zentrifuge bei 5000-10000 g für 1 bis 3 Minuten. Überprüfen Sie die Menge der Flüssigkeitauf dem Filter und wiederholen Zentrifugation bis die Menge der Flüssigkeit auf dem Filter wird auf etwa 50 ul reduziert. </li><li> Platzieren Sie die Filtereinheit kopfüber in eine neue Microcon Rohr und Zentrifuge bei 1000 g für 3 Minuten. Die optimale Menge der konzentrierten Lösung beträgt 50-60 ul. </li><li> Messen und notieren die Konzentration der DNA auf einem Nanodrop und überprüfen peak Qualität (sollte 260nm werden). </li><li> Übertragen einer kleinen Teilmenge der DNA, um eine saubere Eppendorf-Röhrchen für die Arbeit Lager und frieren bei minus 20. Den Rest der DNA zu einem zweiten sauberen eppendorf und frieren bei minus 80. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse: Wenn dieses Protokoll korrekt ausgeführt wird, sollten Sie ein Gelbild nach Schritt 4.4 in Bestimmung der DNA-Qualität ähnlich zu Abbildung 1 zu sehen. Actual DNA-Konzentration von Extrakten wird je nach Quelle der Probe. Nach dem Schritt 5.7 in CsCl-Gradienten-Zentrifugation sollte genomische DNA von blauem Licht beleuchtet ähnlich Abbildung 2. <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig1newer.png" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. 0,8% Agarosegelelektrophorese Bild von hochmolekularer DNA aus vier Tiefen in der subarktischen Pazifik (in zweifacher Ausfertigung), mit dem interkalierende Mittel Ethidiumbromid (10 mg / ml) angefärbt gesammelt. Gel wurde auf 15V für ~ 16 Stunden in 1X TBE-Gel-Laufpuffer laufen. Beispiel Bands sind von guter Qualität zeigen kaum Anzeichen für mechanische Scherung (zeigt einzelne Banden oder Schlieren auf mehrere Bänder Gegensatz), obwohl der 10m-Extrakte halten einige RNA übertragen (siehe Abstrich in der 0,5 bis 2,0 Kb-Bereich). <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Genomic DNA-Bande durch blaues Licht nach CsCl-Gradienten-Zentrifugation beleuchtet.

<ol>
	<li>Beja, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+BAC+or+not+to+BAC:+marine+ecogenomics.">To BAC or not to BAC: marine ecogenomics.</a> Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).</li><li>Beja, O., Suzuki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage.">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).</li><li>DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+oceans+interior.">Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li><li>Stein, J. L., Marsh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+uncultivated+prokaryotes:+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon.">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).</li><li>Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+rapid+method+for+the+direct+isolation+of+nucleic+acids+from+aquatic+environments.">A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).</li></ol>

Je nachdem, wie viele Proben verarbeitet werden sollen, kann dies eine zeitintensive Prozedur aufgrund der zwei einstündigen Inkubation Schritte, und die wiederholten Waschungen und Zentrifugationsschritte werden. Am besten ist es, zwei ganze Tage für dieses Verfahren zu planen, um genügend Zeit zu lassen. Wenn es Probleme gibt immer die endgültige Extrakt Volumen in der Amicon Rohr zu reduzieren bis zu 200-500μl während der DNA-Konzentration und Waschen, versuchen Sie zusätzliche TE Waschungen und Zentrifugation...

A correction was made to "<a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 ml RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 &#956;l RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.

A correction was made to <a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>. A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.

Erratum: DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1 cc syringe (26G5/8 needle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309597</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 ml syringe (26G5/8 needle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309597</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5ml eppendorf tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>0030 125.150</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CLS430791</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5cc syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amicon&reg; Ultra-4 Centrifugal Filter Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC801096</td>
<td>10,000 Nominal molecular weight limit</td>
</tr>
<tr>
<td>Butanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A383-1</td>
<td>Make it water saturated (butanol:water = 1:1)</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge rotor, JA5.3 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>368690</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge, Avanti&reg; J-E</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>369003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cesium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C4036</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chloroform:IAA (24:1)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>25666-500ML</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethidium Bromide (EtBr)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E1510-10ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E5134</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybridization oven</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-247-10</td>
<td>37&deg;C & 55&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Lysis Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)</td>
</tr>
<tr>
<td>Lysozyme</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L6876-5G</td>
<td>125 mg in 1000 &mu;l TE</td>
</tr>
<tr>
<td>Microcon&reg; Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>42410</td>
<td>50 bp cut off</td>
</tr>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>13-374-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>77617-500ML</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>19133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP2539-100</td>
<td>10 &mu;g/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Safe Imager&trade; Blue light transilluminator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S37102</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L4509</td>
<td>20% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Sterivex filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SVG010RS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0389</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Table top centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5415D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TE buffer, pH 8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma&reg; base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge rotor, TLA 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>343847</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>343775</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge tube rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>348302</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge, Optima&reg; Max</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dna extraction from 0.22 &mu;m sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation

Diese Methode wird verwendet, um hochmolekulare genomische DNA aus planktonischen Biomasse auf 0,22 &amp;mgr; M Sterivex Filter, die mit Lagerung / Lysepuffer behandelt worden sind und archiviert werden bei -80 ° C konzentrierten Extrakt, und diese DNA mit einem Cäsiumchlorid-Dichtegradienten zu reinigen. Das Protokoll beginnt mit zwei einstündigen Inkubation Schritte, um DNA aus den Zellen zu befreien und zu entfernen RNA. Als nächstes wurde eine Reihe von Phenol: sind Chloroform und Chloroform-Extraktionen durch Zentrifugation durchgeführt, gefolgt von Proteinen und Zellmembran Komponenten, Sammlung der wässrigen DNA-Extrakt, und mehrere Puffer Austausch Schritte zu waschen und zu konzentrieren, den Extrakt zu entfernen. Fünfter Teil beschreibt die optionale Reinigung über Cäsiumchlorid-Dichtegradienten. Es wird empfohlen, mit weniger als 15 Proben auf einmal arbeiten, um Verwechslungen zu vermeiden und hieb-Protokoll Zeit. Die Gesamtzeit für dieses Protokoll benötigt wird, hängt von der Anzahl der Proben extrahiert werden. Für 10-15 Proben und unter der Annahme der richtigen Zentrifugation Ausrüstung zur Verfügung steht, sollte dieses gesamte Protokoll zu 3 Tage. Vergewissern Sie sich, die Hybridisierung Öfen gesetzt, um Temperatur zu Beginn des Prozesses.

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DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Wir beschreiben ein Verfahren zur Gewinnung von hohem Molekulargewicht von genomischer DNA aus planktonischen Biomasse auf 0,22 um Sterivex Filter, durch Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation zur Reinigung folgte konzentriert.

DNA-Extraktion von 0,22 pM Sterivex Filter und Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

dna-extraction-from-022-m-sterivex-filters-cesium-chloride-density

Research

JoVE Journal

Biology

29.0K Aufrufe.  University of British Columbia - UBC. Wir beschreiben ein Verfahren zur Gewinnung von hohem Molekulargewicht von genomischer DNA aus planktonischen Biomasse auf 0,22 um Sterivex Filter, durch Cäsiumchlorid-Dichtegradientenzentrifugation zur Reinigung folgte konzentriert.

Serie: DNA Extraction from 0.22 μM Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Extraktion von High Molecular Weight genomischer DNA aus Böden und Sedimenten

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Forschung

Biologie

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

DNA-Extraktion aus in Paraffin eingebettete Material für genetische und epigenetische Analysen

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

Extraktion von DNA mit hohem Molekulargewicht von mikrobiellen Matten

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

Extraction and Analysis of Cortisol from Human and Monkey Hair

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and validated a method for CORT extraction and analysis from rhesus monkey hair and subsequently adapted this method for use with human scalp hair. In contrast to CORT &#34;point samples&#34; obtained from plasma or saliva, hair CORT provides an integrated measure of hypothalamic-pituitary-adrenocortical (HPA) system activity, and thus physiological stress, during the period of hormone incorporation. Because human scalp hair grows at an average rate of 1 cm/month, CORT levels obtained from hair segments several cm in length can potentially serve as a biomarker of stress experienced over a number of months.
In our method, each hair sample is first washed twice in isopropanol to remove any CORT from the outside of the hair shaft that has been deposited from sweat or sebum. After drying, the sample is ground to a fine powder to break up the hair&#39;s protein matrix and increase the surface area for extraction. CORT from the interior of the hair shaft is extracted into methanol, the methanol is evaporated, and the extract is reconstituted in assay buffer. Extracted CORT, along with standards and quality controls, is then analyzed by means of a sensitive and specific commercially available enzyme immunoassay (EIA) kit. Readout from the EIA is converted to pg CORT per mg powdered hair weight. This method has been used in our laboratory to analyze hair CORT in humans, several species of macaque monkeys, marmosets, dogs, and polar bears. Many studies both from our lab and from other research groups have demonstrated the broad applicability of hair CORT for assessing chronic stress exposure in natural as well as laboratory settings.

Cortisol (CORT) accumulates in the growing hair shaft of humans and nonhuman primates. We describe methods for extracting and analyzing hair CORT with high precision and sensitivity. Measurement of hair CORT is particularly well-suited for assessing chronic stress over periods of weeks to months.

Extraktion und Analyse von Cortisol aus Menschen-und Affen-Haar

The stress hormone cortisol (CORT) is slowly incorporated into the growing hair shaft of humans, nonhuman primates, and other mammals. We developed and ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves is the site of several important biological processes, including cell wall formation, cellular nutrient and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses to pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique for the analysis of the soluble apoplast composition of various plant species. The fluid obtained by this method is commonly known as apoplast washing fluid (AWF). The following protocol describes an optimized vacuum infiltration and centrifugation method for AWF extraction from Phaseolus vulgaris (French bean) cv. Tendergreen leaves. The limitations of this method and the optimization of the protocol for other plant species are discussed. Recovered AWF can be used in a wide range of downstream experiments that seek to characterize the composition of the apoplast and how it varies in response to plant species and genotype, plant development and environmental conditions, or to determine how microorganisms grow in apoplast fluid and respond to changes in its composition.

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

Die Infiltration-Zentrifugation Technik zur Gewinnung von apoplastischen Flüssigkeit aus Pflanzenblättern verwenden<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt; Als Beispiel

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Ein Hybrid-DNA-Extraktionsmethode für die qualitative und quantitative Bewertung der bakteriellen Gemeinschaften aus Zucht Proben

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

Herstellung von Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebe Cores sowohl für RNA und DNA-Extraktion

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

Spermiengewinnung differenzielle Qualität mit Dichte-Gradienten-Zentrifugierung

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...