פרוטוקול זה הוא משמעותי מכיוון שהוא לא רק מדגים גישות לטיהור שלפוחית מתרבות בקני מידה שונים, פשרות, הבדלים בין מתודולוגיות וגם התחשבות בעבודה עם דוגמאות שדה. ציאנובקטריה מציגה אתגרי דגימת שלפוחית וניתוח ייחודיים. טכניקות אלה בודדו וריכזו בהצלחה שלפוחיות מתרבות ומדגימות סביבתיות.
כדי לרכז דגימות של פחות מ -500 מיליליטר, התחל עם שטיפה של 15 עד 20 מחוללי אולטרה-סינון צנטריפוגליים מסוג 1 עם מים בדרגה אולטרה-פורית מסוג 1. טען את הריכוזים לצנטריפוגה וסובב ב 4, 400 x g בארבע מעלות צלזיוס. יש להשליך את הריצה ולחזור על הצעד לפחות פעמיים.
טענו את דגימת ה-supernatant לתוך רכז שטוף מים וסובבו באותם תנאים. חזור על שלב זה עד שהדגימה מרוכזת לנפח סופי של 15 עד 30 מיליליטר. כדי לרכז נפח של יותר מ-500 מיליליטר, בצע סינון זרימה משיק על ידי הגדרת המנגנון כמתואר בכתב היד.
חברו משאבה פריסטלטית לקו הכניסה והניחו מהדקים מתכווננים על קו הכניסה החוזרת. יש לטהר את סינון הזרימה המשיק כפי שמתואר בכתב היד, ולאחר מכן לשטוף את המכשיר לליטר אחד של מים בדרגה אולטרה-פורית מסוג 1. הוסף פחות מ 0.2 מיקרון תפיח למאגר הדגימה.
הגדל באיטיות את מהירות המשאבה ואת רמות הלחץ בחזרה על קו הכניסה החוזרת כדי להגדיל את התפוקה מקווי התסיסה. המשך להפעיל את סינון הזרימה המשיק ולמלא מחדש את המאגר בתרבית סופרנאטית עם הסרת החומר. הפסיקו לרכז את הדגימה ברגע שהנפח במאגר מגיע לכמות הנמוכה ביותר האפשרית הדרושה כדי לשמור על זרימה לקו הכניסה מבלי להכניס בועות אוויר.
סגור את קו הזרימה באמצעות מהדק. הסר את הלחץ האחורי על קו הכניסה החוזרת. שחזרו את הסופרנאטנט המרוכז דרך המסנן למשך 10 דקות, והפחיתו את קצב הסירקולציה מ-20 ל-40 מיליליטר לדקה כדי למקסם את ההתאוששות.
הזז את קו הכניסה מחדש לכלי נקי, הסר את קו הצריכה מהדגימה ואסוף את החומר המרוכז. שחזרו כל חומר שנותר במאגר הדגימה באמצעות פיפטה. סנן את חומר העל המרוכז דרך מסנן מזרקים של 0.2 מיקרון.
במידת הצורך, אחסנו את התרכיז הסופי בארבע מעלות צלזיוס למשך כשלושה שבועות לפני המעבר לטיהור שלפוחית. כדי לכדור את דגימת התרבית המרוכזת מניחים אותה בצינור אולטרה-צנטריפוג' נקי ומוסיפים מדיה נקייה או חיץ כדי להבטיח שהצינור מלא. לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרנאטנט עם פיפטה.
יש לשטוף מחדש את החומר הנגוע בטכניקת תרבית טרייה או במאגר שטיפה, כגון 1X מלוחים עם תמיסת פוספטים, ולחזור על הצנטריפוגה. בצעו החייאה של הכדור הסופי בתרבות טרייה על ידי צנרת עדינה עם פיפטה של מיליליטר אחד והעבירו אותו לכלי נקי. כדי לבצע אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות, הכינו את מניות יודיקסנול כמתואר בכתב היד.
ערבבו חלק אחד של מאגר ה-4X עם שלושה חלקים של מלאי יודיקסנול של 60% כדי ליצור פתרון של 45% יודיקסנול. דילול 45% יודיקסנול עם מאגר 1X כדי ליצור מלאי של מדיה הדרגתית של 40, 35, 30, 25, 20, 15 ו-10% ריכוזי יודיקסנול סופיים. לאחר מכן, שכבו בזהירות כמויות שוות של כל מלאי השיפוע של יודיקסנול לתוך צינור ultracentrifuge, תוך ניצול כל נפח הצינור.
לאחר צנטריפוגה, אספו את השברים של 0.5 מיליליטר כל אחד עבור שיפוע של כ-4.5 מיליליטר על ידי צנרת קפדנית או שימוש במלקט שברים. קבע את הצפיפות של כל שבר, בגרמים למיליליטר, באמצעות איזון אנליטי ופיפטה מכוילת. הסר את הדגימה מהצינור, קבע את המשקל והחזיר את הדגימה לצינור.
דיללו שברים בודדים עם חיץ נקי בצינור חדש ולאחר מכן שטיפת מדיה נקייה או חיץ. בזהירות להחיל חמישה microliters של שלפוחית ולתת לו לשבת במשך חמש דקות. הסר את הדגימה על-ידי נגיעה בקצה הרשת בפיסת נייר סינון נקייה.
פיפטה הוציאה 20 עד 50 מיקרוליטרים של 2% אורניל אצטט על משטח שטוח המכוסה בסרט פלסטיק. לאחר מכן הניחו את הרשת המרחפת מעליה למשך שתי דקות. מוציאים אורניל אצטט באמצעות נייר סינון וצפים לזמן קצר על טיפת מים אולטרה-פורים לשטיפה.
מלאו את התא במים אולטרה-פוריים באמצעות מזרק נקי והבטיחו שאין בועות אוויר. לחץ על הפעל את המצלמה' ודמיין את האזור האופטימלי של החדר סביב טביעת האגודל. החלק את המחוונים של רווח המסך ורמת המצלמה לכיוון המרבי, ואז הקטן לרמה הנמוכה ביותר כדי לראות את החלקיקים העמומים ביותר.
התאם את המיקוד לפי הצורך כדי להבטיח שהחלקיקים נראים בערך באותה מידה על פני שדה הראייה והמשך לשטוף במים נקיים במיוחד עד שהתא נקי. הוסף את דגימת השלפוחית לתא באמצעות מזרק מיליליטר אחד ואישר את הגדרות הרכישה. בחר מדידה רגילה'מהתיבה הנפתחת SOP ושנה את ההגדרות כדי לאסוף לפחות שלושה שכפולים טכניים של סרטוני וידאו של 60 שניות כל אחד.
לחץ על צור והפעל סקריפט', עקוב אחר ההנחיות ודחף כ-100 מיקרוליטרים של דגימה לתוך התא בין שכפולים. קבעו את הפרמטרים של החלקיקים על ידי לחיצה על ניתוח 'וניסוי פתוח' וטענו את קובץ הדגימה. בחר תהליך קבצים נבחרים 'והמתן להשלמת הניתוח.
הבידוד והאפיון של שלפוחיות חוץ-תאיות מהציאנובקטריום Synechocystis sp. PCC6803, הראו כי הממברנה החיצונית מכילה קרוטינואידים, המעניקים צבע כתום אופייני לדגימות שלפוחית שנאספו על ידי גלולה ישירה באמצעות אולטרה-צנטריפוגציה. גלולת השלפוחית המחודשת נבדקה על ידי מיקרוסקופיית אלקטרונים של העברה על ידי צביעה שלילית של דגימות עם אורניל אצטט או על ידי תצפית על מקטעי אולטרה-טיין.
התפלגות גודל השלפוחית והריכוז הוערכו באמצעות ניתוחי פיזור אור דינמיים ומעקב אחר ננו-חלקיקים. בועיות Synechocystis sp. PCC6803 מטוהרות הופרדו על ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד והוכתמו עבור ליפופוליסכרידים.
יש לקחת דגימות לפני ואחרי דגימת השלפוחית המרוכזת כדי להבטיח שסינון הזרימה המשיק עובד והבועיות מרוכזות. אז אתה צריך למדוד את שתי הדגימות באמצעות ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים. נדרשים מאמצים עתידיים למזג שיטה זו עם גישות אחרות כגון כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל או פיצול אסימטרי של זרימת שדה כדי לשפר את האפליה והבידוד של חלקיקים קטנים מדגימות תרביות וסביבה.
טכניקה זו מסייעת לחקור את שלפוחית הציאנובקטריה ואת התפקידים התפקודיים הספציפיים של בועיות אלה בביולוגיה ציאנובקטריאלית.
