Nous tenons à remercier la Fondation canadienne pour l&#39;innovation, le Fonds de développement des connaissances en Colombie-Britannique et les sciences naturelles et en génie (CRSNG) du Canada pour soutenir les études en cours sur les régions pauvres en oxygène des eaux côtières et océaniques ouverts. JJW a été soutenu par des bourses du CRSNG et DAW a été soutenu par des bourses du CRSNG, la Fondation Killam et TULA Centre a financé pour la diversité microbienne et évolution. SL a été soutenu par la Fondation du Centre TULA financé pour la diversité microbienne et évolution.

Remarque: Tous les réactifs utilisés dans le présent protocole sont aliquotées des stocks de laboratoire travaillant en petits stocks-ce qui est très important d&#39;éviter la contamination croisée de vos échantillons d&#39;ADN et la contamination des stocks de laboratoire. Aussi, lors du pipetage, assurez-vous de changer d&#39;embout de pipette pour chaque ajout afin d&#39;éviter la contamination croisée. Première partie: la lyse cellulaire et la digestion <ol><li> Commencez ce protocole par la fonte des filtres Sterivex qui contiennent de la biomasse planctonique préalablement concentré sur la glace. Pour plus de simplicité, ici, nous décrire la procédure de traitement d&#39;un filtre individuel. En pratique, nous recommandons le traitement de 16 ou moins de filtres à la fois. </li><li> Une fois le filtre a dégelé, commence la première des deux incubations: un pour lyser les cellules et de supprimer l&#39;ARN, et une pour décomposer les protéines. Pour la première incubation, ajouter 100 ul de lysozyme (125 mg en 1000 ul de TE) et 20 ml de RNase A (10 ug / ml) pour le filtre. Refermer le filtre avec du parafilm et laissez-le tourner dans le four d&#39;hybridation à 37 ° C pendant 1 heure. </li><li> Pour l&#39;incubation suivante, ajouter 100 à la protéinase K et 100 ul ul SDS 20% sur le filtre. Refermer avec Parafilm et laissez-le faire tourner une à deux heures de plus dans le four à hybridation, cette fois à 55 ° C. </li><li> En utilisant une seringue 5cc, le transfert du lysat du filtre Sterivex dans un tube Falcon de 15 ml. Rincer le filtre avec un tampon de lyse 1 ml et ajouter le liquide de rinçage au lysat dans votre tube Falcon en utilisant la seringue 5cc. Maintenant que vous avez lysées et digéré vos cellules, vous êtes prêt à extraire leur ADN. </li></ol> Deuxième partie: Extraction de l&#39;ADN <ol><li> L&#39;étape suivante consiste à utiliser la méthode au phénol-chloroforme pour extraire l&#39;ADN à partir de votre lysat. Ajouter un volume égal (environ 3ml) de phénol: chloroforme: alcool isoamylique (IAA) au tube de lysat, en s&#39;assurant de changer d&#39;embout de pipette pour chaque addition pour éviter la contamination croisée. Vortex pendant 10 secondes pour bien mélanger. </li><li> Spin le tube à 2500 g pendant 5 minutes, en veillant à la centrifugeuse est équilibré. Pendant la centrifugation, le mélange phénol-chloroforme-lysat devrait se séparer en deux couches: une couche organique contenant du phénol, du chloroforme, et des protéines à partir de votre échantillon, sur le fond, et une couche aqueuse, qui se compose de votre ADN, de l&#39;eau, et d&#39;autres molécules plus hydrophiles, sur le dessus. </li><li> Transférer la phase aqueuse (contenant votre ADN) dans un nouveau tube Falcon de 15 ml. Soyez prudent de ne pas toucher à l&#39;interface avec la pointe de la pipette (toujours laisser une petite quantité de la couche aqueuse derrière). </li><li> Pour ce nouveau tube, ajouter un volume égal (environ 3 ml) de chloroforme: IAA, en s&#39;assurant de changer d&#39;embout de pipette pour chaque addition pour éviter la contamination croisée. Vortex pendant 10 secondes. Cette étape permet de retirer tout le phénol restant de votre échantillon d&#39;ADN. </li><li> Centrifuger à 2500 g pendant 5 minutes ou jusqu&#39;à ce que la couche aqueuse est claire. Transfert couche aqueuse dans un nouveau tube Falcon étiquetés et ajouter 1 ml de TE à pH 8,0, en faisant attention à ne pas toucher à l&#39;interface avec la pointe de la pipette (toujours laisser une petite quantité de la couche aqueuse derrière). Cette couche aqueuse contenant vos extraire l&#39;ADN. </li></ol> Troisième partie: Concentration d&#39;ADN et de lavage <ol><li> La prochaine étape est de se laver et de se concentrer l&#39;échantillon d&#39;ADN dans un tube de 15 ml Amicon Ultra centrifugeuse. Les tubes Amicon se composent d&#39;un filtre qui retient les molécules au niveau ou au dessus d&#39;un poids spécifié moléculaire (rétentat) et un tube pour attraper le flux continu (le filtrat). Dans ce cas, le filtre retient votre ADN (le rétentat). Transférez vos extraire l&#39;ADN de l&#39;étape de 2,5 à le compartiment du filtre d&#39;un tube de Amicon Ultra. </li><li> Centrifuger à 3500 g pendant 10 minutes. Assurez-vous qu&#39;il ya moins de 1 ml de liquide retenu dans le filtre Amicon. S&#39;il reste plus d&#39;rétentat, remplir le filtre avec TE et de spin à nouveau. Assurez-vous d&#39;utiliser une pointe de pipette propre pour chaque ajout TE afin d&#39;éviter la contamination croisée. </li><li> Retirez le flux continu, ou filtrat, à un autre tube Falcon et l&#39;enregistrer dans le réfrigérateur jusqu&#39;à ce que vous avez confirmé votre produit d&#39;ADN sur un gel de finale (quatrième partie). </li><li> Ajouter 2 ml de tampon TE au filtre Amicon et centrifuger à 3500 g pendant 6 minutes, en veillant à utiliser une pointe de pipette propre pour chaque ajout TE afin d&#39;éviter la contamination croisée. Piscine filtrat avec celle de l&#39;étape 3.3 et enregistrez-le dans le réfrigérateur. </li><li> Laver l&#39;ADN deux fois plus avec TE pour un total de trois lavages (en veillant à toujours utiliser un embout de pipette frais), et en enregistrant le filtrat à chaque fois (comme des étapes 3.3 et 3.4). Pour le dernier lavage, rotation jusqu&#39;à 200 à 500 ml de rétentat reste dans le filtre Amicon. Noter le volume final et le transfert du rétentat (contenant votre ADN) à un tube étiqueté Eppendorf de 1,5 ml. </li></ol> Quatrième partie: Détermination de la qualité de l&#39;ADN <ol><li> Vérifiez la qualité de l&#39;ADN et estimer la concentration de l&#39;ADN en exécutant vos échantillons sur un gel de 0,8% STA gel d&#39;agaroseINED avec 1ml bromure d&#39;éthidium (BET) pendant la nuit. (Soyez extrêmement prudent lorsque vous utilisez EtBr est un mutagène connu et soupçonné d&#39;être cancérogène. Assurez-vous de changer de gants souvent et évitez EtBr transfert du reste du laboratoire et à votre peau.) Charger les échantillons côté échelles d&#39;ADN, qui servent de normes de taille et d&#39;intensité (voir étape suivante). </li><li> Dans les premières voies de plusieurs, la charge d&#39;échelles avec des bandes de différents poids moléculaires et des concentrations. Nous recommandons le schéma de chargement suivantes: dans les ruelles et prénom (voies ultrapériphériques), 10 pl de la charge de la 50ng/μl 1kb + ou échelle 2log. Dans voies 2,3 et 4, la charge 2 pl, 5 pl, et 10 pl, respectivement, de 50ng/μl λHindIII échelle. Enfin, la charge 5 pl par voie d&#39;extrait d&#39;ADN avec un colorant pour chaque échantillon. </li><li> Exécutez le gel à 15 volts pendant environ 16 heures (nous vous recommandons d&#39;exécuter la nuit). </li><li> Le jour suivant, une photographie du gel en utilisant un système de gel UV de la documentation. Pour déterminer la gamme de poids moléculaire de votre ADN et de sa concentration, de comparer les bandes de l&#39;échantillon à des bandes de l&#39;échelle. L&#39;ADN de bonne qualité aura de haut poids moléculaire (&gt; 36kb), et montrent peu de signes de cisaillement / dégradation. Voir Figure 1. </li></ol> Cinquième partie: Césium Centrifugation gradient de chlorure de <ol><li> Si la qualité de l&#39;ADN est bon et la quantité est suffisante, vous pouvez procéder à purifier l&#39;ADN en effectuant un chlorure de césium (CsCl) centrifugation en gradient. Notez que cette étape de purification est facultatif et n&#39;est pas nécessaire pour toutes les applications en aval (par exemple, si vous voulez générer des bibliothèques fosmide vous DEVEZ purifier, alors si vous voulez simplement de réaliser des réactions de PCR, la purification n&#39;est généralement pas nécessaire). D&#39;abord, l&#39;étiquette d&#39;un tube à centrifuger pour chaque échantillon. </li><li> Pour chaque tube à centrifuger, ajouter 160 mg de CsCl, 178 ul d&#39;ADN génomique. Après l&#39;ajout de CsCl et de l&#39;ADN dans le tube, placer un petit morceau de parafilm sur le haut du tube et retourner doucement le tube dix à vingt fois afin de mélanger les composants. Ne pas mélanger par pipetage, qui peut causer de cisaillement de l&#39;ADN. Ensuite, ajoutez 10 ul de 10 ug / ul EtBr à ce tube et mélanger de la même manière. (Soyez extrêmement prudent lorsque vous utilisez EtBr est un mutagène connu et soupçonné d&#39;être cancérogène. Assurez-vous de changer de gants souvent et évitez EtBr transfert du reste du laboratoire et à votre peau.) </li><li> Assurez-vous que le poids de tous les tubes sont équilibrés avant centrifugation tels que les différences de poids entre les tubes sont inférieures à 1 mg. </li><li> Placer les tubes dans le rotor en utilisant hémostatique, fermer le couvercle et placer le rotor à l&#39;intérieur du ultracentrifugation. </li><li> Fermez la porte d&#39;ultracentrifugation. Vide sera appliquée dès que vous fermez la porte. Exécuter nuit à 100 000 tours par minute pendant 18 heures et de 20 ° C. </li><li> Lorsque la centrifugation est terminée, sortez les tubes du rotor à l&#39;aide hémostatique et le placer sur un portoir. </li><li> Visualisez l&#39;ADN avec transilluminateur lumière bleue, ou à défaut, utiliser la lumière UV à long longueur d&#39;onde, dans une pièce sombre. Porter une paire de lunettes filtre ambre pour voir la bande d&#39;ADN. Voir Figure 2. </li><li> Utiliser une seringue stérile et une aiguille 1cc (26G 5 / 8), retirer la bande d&#39;ADN et de le placer dans un tube de 1,5 ml Eppendorf. </li><li> Pour aider à récupérer la plupart de l&#39;ADN piégé dans l&#39;espace vide dans la seringue, rincer la seringue avec 100 pi de TE et ajouter la solution rincé pour le tube. Préparer un tube avec 100 pi de tampon TE par échantillon afin d&#39;éviter toute contamination croisée. </li><li> Pour supprimer EtBr partir de l&#39;ADN, ajouter un volume égal d&#39;eau saturée de butanol dans le tube, inverser les tubes doucement dix à vingt fois, centrifuger à 10000 rpm pendant 1 minute et jetez la couche supérieure. </li><li> Répéter le lavage jusqu&#39;à ce que la couleur de butanol est transparent, 3 - 4 fois plus. </li><li> Place 4 ml de TE dans un tube à centrifuger Amicon Ultra et ajouter la solution d&#39;ADN de haut. </li><li> Centrifuger à 3500 g à température ambiante, jusqu&#39;à ce que le volume ADN est réduite à environ 100 à 500 ul (environ 6-7 minutes) et jeter le accréditives. </li><li> Ajouter 2 ml de TE Amicon filtre et centrifuger à 3500 g pendant 6 minutes, en veillant à utiliser une pointe de pipette propre pour chaque ajout afin d&#39;éviter la contamination croisée. Répéter deux fois. </li><li> Concentré à un volume final de 50-100 ul par centrifugation supplémentaires si nécessaire et le transfert de la solution d&#39;ADN sur le filtre dans un nouveau tube Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Ajouter 40 ul de TE au filtre Amicon pipette et de haut en bas le long des deux membranes de filtration pour laver tout ADN restants. Ajouter cette solution dans le tube de 5,15. </li><li> Placer un Microcon YM-30 unité de filtre dans un tube Microcon et prélaver le Microcon en ajoutant 200 ul d&#39;eau à l&#39;autoclave et centrifugation à 10000 rpm pendant 7 minutes. </li><li> Ajouter la solution d&#39;ADN de 5,16 à l&#39;Microcon prélavée afin de concentrer davantage l&#39;ADN. Centrifuger à 5000 à 10000 g pendant 1 - 3 minutes. Vérifiez la quantité de liquidesur le filtre de centrifugation et de répéter jusqu&#39;à ce que la quantité de liquide sur le filtre est réduite à environ 50 pi. </li><li> Placez l&#39;unité de filtre à l&#39;envers dans un tube et centrifuger Microcon nouvelles à 1000 g pendant 3 minutes. La quantité idéale de la solution concentrée est de 50-60 pi. </li><li> Mesurer et enregistrer la concentration de l&#39;ADN sur un Nanodrop de vérifier la qualité de pointe (260 nm devrait être). </li><li> Transférer une petite aliquote de l&#39;ADN dans un tube propre eppendorf pour travailler stocks et de geler à moins 20. Transférer le reste de l&#39;ADN à un deuxième eppendorf propre et geler à moins 80. </li></ol> Les résultats représentatifs: Lorsque ce protocole est fait correctement, vous devriez voir une image du gel après l&#39;étape 4.4 dans la détermination de la qualité de l&#39;ADN similaire à la figure 1. Concentration d&#39;ADN réels des extraits varie en fonction de la source de l&#39;échantillon. Après l&#39;étape de 5,7 dans la centrifugation en gradient de CsCl, l&#39;ADN génomique éclairé par la lumière bleue devrait ressembler à la figure 2. <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig1newer.png" alt="Figure 1" /> Figure 1. Agarose 0,8% l&#39;image électrophorèse sur gel d&#39;ADN de poids moléculaire élevé recueillies auprès de quatre profondeurs dans l&#39;océan Pacifique subarctique (en double), colorées avec l&#39;agent de intercalant bromure d&#39;éthidium (10 mg / ml). Gel a été exécuté à 15V pour ~ 16hrs au 1X tampon de gel TBE cours d&#39;exécution. Des bandes d&#39;échantillon sont de bonne qualité montrant peu de signes de cisaillement mécanique (montre des bandes simples ou frottis, par opposition à bandes multiples) bien que les extraits 10m conserver certains ARN reporté (voir frottis dans l&#39;intervalle de 0,5 à 2,0 kb). <img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Bande de l&#39;ADN génomique éclairé par une lumière bleue après centrifugation en gradient de CsCl.

<ol>
	<li>Beja, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+BAC+or+not+to+BAC:+marine+ecogenomics.">To BAC or not to BAC: marine ecogenomics.</a> Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).</li><li>Beja, O., Suzuki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage.">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).</li><li>DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+oceans+interior.">Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li><li>Stein, J. L., Marsh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+uncultivated+prokaryotes:+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon.">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).</li><li>Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+rapid+method+for+the+direct+isolation+of+nucleic+acids+from+aquatic+environments.">A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).</li></ol>

Selon le nombre d&#39;échantillons doivent être traitées, ce peut être une procédure prend beaucoup de temps à cause des deux étapes d&#39;incubation d&#39;une heure, et les lavages répétés et les étapes de centrifugation. Il est préférable de prévoir deux jours entiers pour cette procédure de laisser suffisamment de temps. S&#39;il ya des problèmes pour obtenir le volume extrait final dans le tube de Amicon de réduire jusqu&#39;à 200-500μl lors de la concentration de l&#39;ADN et à laver, lave suppl...

A correction was made to "<a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 ml RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 &#956;l RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.

A correction was made to <a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>. A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.

Erratum: DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>1 cc syringe (26G5/8 needle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309597</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1 ml syringe (26G5/8 needle)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309597</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5ml eppendorf tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>0030 125.150</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>15ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>CLS430791</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5cc syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>309603</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amicon&reg; Ultra-4 Centrifugal Filter Devices</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC801096</td>
<td>10,000 Nominal molecular weight limit</td>
</tr>
<tr>
<td>Butanol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>A383-1</td>
<td>Make it water saturated (butanol:water = 1:1)</td>
</tr>
<tr>
<td>Centrifuge rotor, JA5.3 </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>368690</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge, Avanti&reg; J-E</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>369003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cesium chloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>C4036</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chloroform:IAA (24:1)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>25666-500ML</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethidium Bromide (EtBr)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E1510-10ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>E5134</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybridization oven</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-247-10</td>
<td>37&deg;C & 55&deg;C</td>
</tr>
<tr>
<td>Lysis Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.75 M sucrose, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8.3)</td>
</tr>
<tr>
<td>Lysozyme</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L6876-5G</td>
<td>125 mg in 1000 &mu;l TE</td>
</tr>
<tr>
<td>Microcon&reg; Ultracel YM-30 Centrifugal Filter Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>42410</td>
<td>50 bp cut off</td>
</tr>
<tr>
<td>Parafilm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>13-374-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>77617-500ML</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Proteinase K</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>19133</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase A</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>BP2539-100</td>
<td>10 &mu;g/ml</td>
</tr>
<tr>
<td>Safe Imager&trade; Blue light transilluminator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S37102</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>L4509</td>
<td>20% SDS</td>
</tr>
<tr>
<td>Sterivex filters</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher</td>
<td>SVG010RS</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S0389</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Table top centrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5415D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TE buffer, pH 8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma&reg; base</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge rotor, TLA 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>343847</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge tube (7X20mm, PC)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>343775</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge tube rack</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman</td>
<td>348302</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultracentrifuge, Optima&reg; Max</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Beckman Coulter</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dna extraction from 0.22 &mu;m sterivex filters and cesium chloride density gradient centrifugation

Cette méthode est utilisée pour extraire l&#39;ADN de haute moléculaire génomique du poids de la biomasse planctonique concentrés sur des filtres de 0,22 uM Sterivex qui ont été traités avec de stockage / tampon de lyse et archivée à -80 ° C, et à purifier cet ADN en utilisant un gradient de densité de chlorure de césium. Le protocole débute par deux étapes d&#39;incubation d&#39;une heure pour libérer l&#39;ADN de cellules et de supprimer l&#39;ARN. Ensuite, une série de phénol: chloroforme chloroforme et extractions sont effectuées suivie par une centrifugation pour éliminer les protéines et les composants de la membrane cellulaire, la collecte de l&#39;ADN extrait aqueux, et plusieurs étapes d&#39;échange de tampon à laver et à concentrer l&#39;extrait. Cinquième partie décrit la purification en option via gradient de chlorure de césium de densité. Il est recommandé de travailler avec moins de 15 échantillons en une seule fois pour éviter la confusion et de réduire le temps de protocole. Le temps total requis pour ce protocole dépend du nombre d&#39;échantillons à extraire. Pour 10-15 échantillons et en supposant que l&#39;équipement de centrifugation adéquate est disponible, ce protocole devrait prendre toute les 3 jours. Assurez vous d&#39;avoir les fours hybridation réglé à la température au début du processus.

Watch this Scientific Journal Video about DNA Extraction from 0.22 Î¼M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation at JoVE.com

DNA Extraction from 0.22 &amp;mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Nous décrivons une méthode pour l&#39;extraction d&#39;ADN de haut poids moléculaire, génomique de la biomasse planctonique concentrés sur des filtres de 0,22 um Sterivex, suivie d&#39;une centrifugation en gradient de chlorure de césium de densité pour la purification.

Extraction de l&#39;ADN à partir de 0,22 Filtres Sterivex uM et le césium Centrifugation gradient de chlorure de densité

This method is used to extract high molecular weight genomic DNA from planktonic biomass concentrated on 0.22 &mu;M Sterivex filters that have been ...

dna-extraction-from-022-m-sterivex-filters-cesium-chloride-density

Research

JoVE Journal

Biology

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

29.0K vues.  University of British Columbia - UBC. Nous décrivons une méthode pour l'extraction d'ADN de haut poids moléculaire, génomique de la biomasse planctonique concentrés sur des filtres de 0,22 um Sterivex, suivie d'une centrifugation en gradient de chlorure de césium de densité pour la purification.

Vidéo: DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Extraction of High Molecular Weight Genomic DNA from Soils and Sediments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with nutrient and energy flow within terrestrial ecosystems. Cultivation-independent environmental genomic, also known as metagenomic, approaches promise unprecedented access to this genetic information with respect to pathway reconstruction and functional screening for high value therapeutic and biomass conversion processes. However, the soil microbiome still remains a challenge largely due to the difficulty in obtaining high molecular weight DNA of sufficient quality for large insert library production. Here we introduce a protocol for extracting high molecular weight, microbial community genomic DNA from soils and sediments. The quality of isolated genomic DNA is ideal for constructing large insert environmental genomic libraries for downstream sequencing and screening applications. 
The procedure starts with cell lysis. Cell walls and membranes of microbes are lysed by both mechanical (grinding) and chemical forces (&beta;-mercaptoethanol). Genomic DNA is then isolated using extraction buffer, chloroform-isoamyl alcohol and isopropyl alcohol. The buffers employed for the lysis and extraction steps include guanidine isothiocyanate and hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to preserve the integrity of the high molecular weight genomic DNA. Depending on your downstream application, the isolated genomic DNA can be further purified using cesium chloride (CsCl) gradient ultracentrifugation, which reduces impurities including humic acids. The first procedure, extraction, takes approximately 8 hours, excluding DNA quantification step. The CsCl gradient ultracentrifugation, is a two days process. During the entire procedure, genomic DNA should be treated gently to prevent shearing, avoid severe vortexing, and repetitive harsh pipetting.

A methodology to isolate high molecular weight and high quality genomic DNA from soil microbial community is described.

Extraction d&#39;ADN de haut poids moléculaire génomique par les sols et sédiments

The soil microbiome is a vast and relatively unexplored reservoir of genomic diversity and metabolic innovation that is intimately associated with ...

Recherche

Biologie

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

Extraction d&#39;ADN de matériel inclus en paraffine pour les analyses génétiques et épigénétiques

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

Extraction of High Molecular Weight DNA from Microbial Mats

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction of high-quality, high molecular weight (HMW) community DNA. However, environmental mat samples often pose difficulties to obtaining large concentrations of high-quality, HMW DNA. Hypersaline microbial mats contain high amounts of extracellular polymeric substances (EPS)1 and salts that may inhibit downstream applications of extracted DNA. Direct and harsh methods are often used in DNA extraction from refractory samples. These methods are typically used because the EPS in mats, an adhesive matrix, binds DNA2,3 during direct lysis. As a result of harsher extraction methods, DNA becomes fragmented into small sizes4,5,6.
The DNA thus becomes inappropriate for large-insert vector cloning. In order to circumvent these limitations, we report an improved methodology to extract HMW DNA of good quality and quantity from hypersaline microbial mats. We employed an indirect method involving the separation of microbial cells from the background mat matrix through blending and differential centrifugation. A combination of mechanical and chemical procedures was used to extract and purify DNA from the extracted microbial cells. Our protocol yields approximately 2 &mu;g of HMW DNA (35-50 kb) per gram of mat sample, with an A260/280 ratio of 1.6. Furthermore, amplification of 16S rRNA genes7 suggests that the protocol is able to minimize or eliminate any inhibitory effects of contaminants. Our results provide an appropriate methodology for the extraction of HMW DNA from microbial mats for functional metagenomic studies and may be applicable to other environmental samples from which DNA extraction is challenging.

We provide an improved protocol for extracting high molecular weight DNA from hypersaline microbial mats. Microbial cells are separated from the mat matrix prior to DNA extraction and purification. This enhances the concentrations, quality, and size of the DNA. The protocol may be used for other refractory samples.

Extraction d&#39;ADN de haut poids moléculaire de tapis microbiens

Successful and accurate analysis and interpretation of metagenomic data is dependent upon the efficient extraction  of high-quality, high molecular weight ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves is the site of several important biological processes, including cell wall formation, cellular nutrient and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses to pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique for the analysis of the soluble apoplast composition of various plant species. The fluid obtained by this method is commonly known as apoplast washing fluid (AWF). The following protocol describes an optimized vacuum infiltration and centrifugation method for AWF extraction from Phaseolus vulgaris (French bean) cv. Tendergreen leaves. The limitations of this method and the optimization of the protocol for other plant species are discussed. Recovered AWF can be used in a wide range of downstream experiments that seek to characterize the composition of the apoplast and how it varies in response to plant species and genotype, plant development and environmental conditions, or to determine how microorganisms grow in apoplast fluid and respond to changes in its composition.

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

La technique d&#39;infiltration-centrifugation pour l&#39;extraction de apoplastique Fluid feuilles des plantes Utilisation<em&gt; Phaseolus vulgaris</em&gt;, Un exemple

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

A Hybrid DNA Extraction Method for the Qualitative and Quantitative Assessment of Bacterial Communities from Poultry Production Samples

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses performed. Considering that the use of new bacterial community analysis techniques (e.g., microbiomics, metagenomics) is becoming more prevalent in the agricultural and environmental sciences and many environmental samples within these disciplines can be physiochemically and microbiologically unique (e.g., fecal and litter/bedding samples from the poultry production spectrum), appropriate and effective DNA extraction methods need to be carefully chosen. Therefore, a novel semi-automated hybrid DNA extraction method was developed specifically for use with environmental poultry production samples. This method is a combination of the two major types of DNA extraction: mechanical and enzymatic. A two-step intense mechanical homogenization step (using bead-beating specifically formulated for environmental samples) was added to the beginning of the &#8220;gold standard&#8221; enzymatic DNA extraction method for fecal samples to enhance the removal of bacteria and DNA from the sample matrix and improve the recovery of Gram-positive bacterial community members. Once the enzymatic extraction portion of the hybrid method was initiated, the remaining purification process was automated using a robotic workstation to increase sample throughput and decrease sample processing error. In comparison to the strict mechanical and enzymatic DNA extraction methods, this novel hybrid method provided the best overall combined performance when considering quantitative (using 16S rRNA qPCR) and qualitative (using microbiomics) estimates of the total bacterial communities when processing poultry feces and litter samples.

A novel semi-automated hybrid DNA extraction method for use with environmental poultry production samples was developed and demonstrated improvements over a common mechanical and enzymatic extraction method in terms of the quantitative and qualitative estimates of the total bacterial communities.

Une méthode hybride d&#39;extraction d&#39;ADN pour l&#39;évaluation qualitative et quantitative des communautés bactériennes de la volaille Échantillons de production

The efficacy of DNA extraction protocols can be highly dependent upon both the type of sample being investigated and the types of downstream analyses ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Filtration Isolement des acides nucléiques: Une méthode d&#39;extraction de l&#39;ADN simple et rapide

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

Prélèvement du sperme de qualité différentielle en utilisant la Centrifugation en Gradient de densité

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and sequencing. The traditional proteinase K-based methods for genomic DNA extraction from C. elegans take several hours. Commercial extraction kits that effectively break open the C. elegans cuticle and extract genomic DNA are limited. An easy, faster (~15 min), and cost-efficient method of extracting C. elegans genomic DNA that works well for classroom and research applications is reported here. This DNA extraction method is optimized to use single or a few late-larval (L4) or adult nematodes as starting material for obtaining a reliable template to perform PCR. The results indicate that the DNA quality is suitable for amplifying gene targets of different sizes by PCR, permitting genotyping of single or a few animals even at dilutions to one-fiftieth of the genomic DNA from a single adult per reaction. The reported protocols can be reliably used to quickly produce DNA template from a single or a small sample of C. elegans for PCR-based applications.

Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA

Presented here is a description of the straightforward and relatively rapid isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA from one or a few animals using a commercially available tissue kit. The resulting gDNA preparation is a suitable template for PCR.

Extraction à petite échelle de l’ADN génomique de Caenorhabditis elegans

Genomic DNA extraction from single or a few Caenorhabditis elegans has many downstream applications, including PCR for genotyping lines, cloning, and ...

Amélioration de l’isolement des vésicules extracellulaires bactériennes pour la multi-omique du microbiote

Isolation and Purification of Bacterial Extracellular Vesicles from Human Feces Using Density Gradient Centrifugation

Bacterial extracellular vesicles (BEVs) are nanovesicles derived from bacteria that play an active role in bacteria-bacteria and bacteria-host communication, transferring bioactive molecules such as proteins, lipids, and nucleic acids inherited from the parent bacteria. BEVs derived from the gut microbiota have effects within the gastrointestinal tract and can reach distant organs, resulting in significant implications for physiology and pathology. Theoretical investigations that explore the types, quantities, and roles of BEVs derived from human feces are crucial for understanding the secretion and function of BEVs from the gut microbiota. These investigations also necessitate an improvement in the current strategy for isolating and purifying BEVs.
This study optimized the isolation and purification process of BEVs by establishing two density gradient centrifugation (DGC) modes: Top-down and Bottom-up. The enriched distribution of BEVs was determined in fractions 6 to 8 (F6-F8). The effectiveness of the approach was evaluated based on particle morphology, size, concentration, and protein content. The particle and protein recovery rates were calculated, and the presence of specific markers was analyzed to compare the recovery and purity of the two DGC modes. The results indicated that the Top-down centrifugation mode had lower contamination levels and achieved a recovery rate and purity similar to that of the Bottom-up mode. A centrifugation time of 7 h was sufficient to achieve a fecal BEV concentration of 108/mg.
Apart from feces, this method could be applied to other body fluid types with proper modification according to the differences in components and viscosity. In conclusion, this detailed and reliable protocol would facilitate the standardized isolation and purification of BEVs and thus, lay a foundation for subsequent multi-omics analysis and functional experiments.

Pleins feux sur l’auteur : Accélérer la recherche sur la séparation et l’hétérogénéité des vésicules extracellulaires bactériennes 

This study describes a method to isolate and purify bacterial extracellular vesicles (BEVs) enriched from human feces via density gradient centrifugation (DGC), identifies the physical characteristics of BEVs from morphology, particle size, and concentration, and discusses the potential applications of the DGC approach in clinical and scientific research.

Isolement et purification de vésicules extracellulaires bactériennes à partir de matières fécales humaines à l’aide d’une centrifugation à gradient de densité