נתמך על ידי Fundação דה Amparo Pesquisa לעשות Estado לעשות בריו דה ז&#39;נרו (FAPERJ) ו Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico דואר Tecnológico (CNPq). אנו אסירי תודה לשופטים אלמוניים שהערותיו עזרו לנו לשפר את כתב היד ווידאו.

כימיקלים כל מאוחסנים בצורת מוצק, כגון 6-OHDA ו הידרוכלורידי, היו מדולל במים מסוננים הזרקה סטרילי בתוך מכסה המנוע זרימה למינרית, כדי למנוע זיהום. בנוסף, neurotoxins וחומרים neuroactive אוחסנו, מוכן, טיפל להיפטר פי התקנות שנקבעו על ידי הנחיות בינלאומיות 6 ו biosafety הוועדה המקומית. 1 - הרדמה וניתוח למבוגרים עכברים השוויצרי גבר (25-30G) הם premedicated עם אטרופין (0.2 מ&quot;ג / ק&quot;ג, sc) כדי להפחית את הטון ואת מחנק הרדים אז עם זריקה intraperitoneal של קטמין (90-120 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו Xylazine (10 מ&quot;ג / ק&quot;ג) . חיה ממוקמת על משטח חימום מבוקר אלקטרונית (Insight) כדי להבטיח טמפרטורת הגוף נשמר 37 ° C, כמו אינדוקציה של הרגעה לוקח כמה דקות. רמת הרדמה נבדק לאורך ההליך על ידי בדיקת העדר רפלקס נסיגה. מינון ההרדמה צריך להיות ajusted עבור כל זן / המושבה. בהתאם החיה ומשך הניתוח, מינונים נוספים של קטמין עשוי להיות נחוץ. אחרי זה, מי מלח (NaCl 0,9%) מוחל על שתי העיניים כדי להגן על קרניות מהתייבשות ולבדוק את העדר רפלקס למצמץ ברגע זה הראשון. הפרווה על הראש כולו מגולח עם גוזם כדי להבטיח את מגע מינימלי עם אזורים unsterile. הרדמה מקומית (Xylocaine) על הסורגים האוזן כדי למנוע סבל. רק פעם אחת נסיגה רפלקס למצמץ נעלמו, המציין את רמת ההרדמה היא עמוקה מספיק לניתוח (שלב 3), החיה ממוקם על מסגרת stereotaxic באמצעות הפה חתיכת וברים האוזן תוכנן במיוחד עבור מין זה (Insight). Positionated פעם, משחה ophthalmologic (Marca) מוחל על מנת להגן על העיניים חיה לאורך כל הניתוח. רק לאחר להיות בטוח כי בעיני מוגנים כראוי, ההליך להמשיך עם החיטוי של העור באזור הניתוח על ידי חזרה על שלושה יישומים של יוד povidone ואחריו אתנול 70%, באמצעות ספוגיות כותנה סטרילי אחרי, מיקום נכון של הסורגים האוזן מובטחת על ידי בדיקת תנועות הצידה של הראש (הראש לא צריך לזוז כדי להבטיח את הסורגים הם קבועים היטב). הנטייה dorsoventral נכונה של הראש יאומת מאוחר יותר, כאשר מתגלים סימני דרך הגולגולת. חתך sagittal (1.5 ס&quot;מ) הוא עשה עם אזמל סטרילי (# 15 להב). Periosteum על פני שטח של עניין הוא שרט בעדינות עם להב חדש, העצם נמחק במבט סטרילי ספוגיות כותנה, כדי לחשוף ציוני דרך הגולגולת: גבחת מוגדרת כנקודת החיתוך של התפרים sagittal ו העטרה, בעוד למבדה היא נקודת החיתוך של תפר sagittal וקו בכושר הטוב ביותר עובר דרך חלקים על ימין ועל שמאל של תפר lambdoid. קצה של מחט התייחסות בציר אנכי הוא התביית הראשון גבחת, תחת בדיקה באמצעות מיקרוסקופ כירורגי, ולאחר מכן עבר כמו לגעת בנקודה למבדה. אם הראש ממוקם כראוי, למבדה צריכה להיות ברמה dorso-הגחון כמו גבחת, וציוני דרך שניהם צריכים להיות רחוקים ידי מ&quot;מ 4.2 לאורך ציר rostro-הזנב. אם לא, האוזניים ברים nosepiece יש לשחרר ואת הראש מוטה בעדינות סביב ציר interaural, על מנת להשיג את המיקום הרצוי, המגדיר את &quot;גולגולת שטוחה&quot; התייחסות אמצעים stereotaxical. קצה המחט התייחסות ממוקם אז קואורדינטות הרצוי: קדמית, אחורית (AP 0.5 מ&quot;מ) לרוחב (L -2.0 מ&quot;מ, משמאל). המקום מסומן על הגולגולת חור קטן (בקוטר 1.2 מ&quot;מ) נפתח עם קצת לקדוח מעוקרים, באמצעות פעולה לסירוגין, כדי למנוע החום באזור. שברי עצם מוסרים בזהירות עם מגרד שיניים ושטפה עם סטרילי NaCl 0.9% חם. מעוקר 5 μl המילטון מזרק (26s מד; בקוטר 0.47 מ&quot;מ החיצוני) הוא טעון עם פתרון 6-OHDA (או ברכב לבעלי חיים שליטה) ו בציר אנכי המנגנון stereotaxic. קצה המחט (סוג 2 או 12 שפוע °) מוכנס לתוך החור ואז נפתחה, עד לגעת במשטח pial, כדי דטרמיניסטיות נקודת ההתייחסות של לתאם dorso-הגחון. לאחר דטרמיניסטיות זה לתאם, המחט יורדת לאט להגיע הקואורדינטות של בסטריאטום (AP: 0.5; L: -2.0 ו DV: מ&quot;מ -3.0, מתחת לפני השטח pial 7). הפתרון 6-OHDA (10 מיקרוגרם 6-OHDA ב NaCl 0.9% עם חומצה אסקורבית 0.02%), אשר הוכנה מסוננים בתוך מכסה המנוע זרימה למינרית, והוא חייב להיות מוגן מפני אור על ידי רדיד אלומיניום לאורך ההליך, מוזרק אז קצב הזרימה של 0.1μL/min. עבור בעלי חיים שליטה, נפח שווה של כלי רכב (0.02% חומצה אסקורבית ו -0.9% NaCl במים סטריליים) מוזרק. לאחר μL כולו 2.0 כבר הזריק, המזרק נשמר מקום 5 דקות לפני שהם מאוד לאט חזר בו מן המוח, לא פחות מאשר 5 דקות. הגולגולת היא לנקות את החתך נסגר באמצעות תפרים # 6-0 ניילון (שלון). כדי לקחת תוספתטיפול נגד זיהום, משחה אנטיביוטית מקומית, כמו neomycin, ניתן להחיל על העור sutured. בעלי חיים יוסרו מן המסגרת, בהתחשב 0.5 מ&quot;ל של תמיסת מלח (sc.) על מנת למנוע התייבשות, והמשיך חמים תחת השגחה צמודה עד להחלמה מלאה. הם שוכנו אז עם מזון כרצונך מים. משככי כאבים מתווסף בקבוק שתייה עבור היומיים הראשונים לאחר הניתוח (נתון ממוצע צריכת המים היומית של 5.5 מ&quot;ל, ואת המינון המומלץ של איבופרופן 0.03 מ&quot;ג / גרם של משקל גוף / יום; להוסיף 0,82 מ&quot;ל של 20 מ&quot;ג / mL איבופרופן-אבוט ההשעיה למים לשתייה 100 מ&quot;ל). עכברים בדרך כלל להתאושש במהירות מן ההליך, נדודים והגעה עבור כדורי מזון, מים בקלות. בכל מקרה של אי נוחות נראית לעין, או כל סימן לזיהום, בעלי חיים צריכים להיות מורדמים בהתאם להנחיות המקומיות. 2 - מבחן ההתנהגות למרות פגיעה מוטורית ניתן לראות אחרי שבוע, מרווח שלאחר הנגע של חודש אחד מותר לפני כימות אמין במבחן הסיבוב. חיים מקבל זריקה תת עורית של הידרוכלורידי אגוניסט התובע (0.5 מ&quot;ג / ק&quot;ג), והוא ממוקם אטום של גליל בקוטר 30 ס&quot;מ, 45 ס&quot;מ מתחת להציב מצלמה ההקלטה. חשוב להסיר שאריות וריחות מחיות נבדק קודם לכן לפני כל בדיקה. לאחר תקופת התרגלות 5 דקות, התנועות נרשמות על פרק זמן 5 דקות. קונטרה ו סיבוב שני ipsilateral גוף מלא נמדדים בהשוואה לקבוצת הביקורת (הרכב מוזרק). אם ההליך בוצע כהלכה, חיות בקרת לא יציגו כל סיבוב, ואילו 6-OHDA חיות lesioned יתחיל להפוך לצד הנגדי, שכן אגוניסט בעיקר מפעיל את הסטריאטום denervated רגיש בצד lesioned. בעלי חיים ניקוד מעל 7 סל&quot;ד (הצגת לפחות 7 גוף מלא הנגדי סיבובים לדקה) נחשבים lesioned בהצלחה. בעלי חיים ניתן חזרו בשלום שלהם 30 דקות דיור לאחר הבדיקה, אשר ניתן לחזור לשבוע. בידיים שלנו, פחות מ -5% של עכברים lesioned מוצגים שיעורי הסיבוב הכי מוצלח.

<ol>
	<li>Ungerstedt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=6-hydroxy-dopamine+induced+degeneration+of+central+monoamine+neurons.">6-hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons.</a> Eur. J. Pharmacol. 5, 107-110 (1968).</li><li>Akerud, P., Canals, J. M., Snyder, E. Y., Arenas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+through+delivery+of+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+by+neural+stem+cells+in+a+mouse+model+of+Parkinson's+Disease.">Neuroprotection through delivery of glial cell line-derived neurotrophic factor by neural stem cells in a mouse model of Parkinson's Disease.</a> J. Neurosci. 21, 8108-8118 (2001).</li><li>Ghosh, A., Roy, A., Liu, X., Kordower, J. H., Mufson, E. J., Hartley, D. M., Ghosh, S., Mosley, R. L., Gendelman, H. E., Pahan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+NF-kappaB+activation+prevents+dopaminergic+neuronal+loss+in+a+mouse+model+of+Parkinson's+Disease.">Selective inhibition of NF-kappaB activation prevents dopaminergic neuronal loss in a mouse model of Parkinson's Disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 18754-18759 (2007).</li><li>Alvarez-Fischer, D., Henze, C., Strenzke, C., Westrich, J., Ferger, B., H&#246;glinger, G. U., Oertel, W. H., Hartmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+striatal+6-OHDA+model+of+Parkinson's+disease+in+wild+type+and+a-synuclein-deleted+mice.">Characterization of the striatal 6-OHDA model of Parkinson's disease in wild type and a-synuclein-deleted mice.</a> Exp. Neurol. 210, 182-193 (2008).</li><li>Ungerstedt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=6-Hydroxydopamine-induced+degeneration+of+the+nigrostriatal+dopamine+pathway:+The+turning+syndrome.">6-Hydroxydopamine-induced degeneration of the nigrostriatal dopamine pathway: The turning syndrome.</a> Pharmacology and Therapeutics Part B: General and Systematic Pharmacology. 2, 37-40 (1976).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines for the Care and Use of Mammals in Neuroscience and Behaviour Research. , 209 (2003).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).</li><li>Hudson, J. L., Horne, C. G. v. a. n., Str&#246;mberg, I., Brock, S., Clayton, J., Masserano, J., Hoffer, B. J., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+apomorphine-+and+amphetamine-induced+turning+with+nigrostriatal+dopamine+content+in+unilateral+6-hydroxydopamine+lesioned+rats.+Brain+Res.">Correlation of apomorphine- and amphetamine-induced turning with nigrostriatal dopamine content in unilateral 6-hydroxydopamine lesioned rats. Brain Res.</a> , 626-6167 (1993).</li><li>Truong, L., Allbutt, H., Kassiou, M., Henderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+preclinical+model+of+Parkinson's+disease:+A+study+of+behaviour+in+rats+with+graded+6-OHDA+lesions.">Developing a preclinical model of Parkinson's disease: A study of behaviour in rats with graded 6-OHDA lesions.</a> Behav. Brain Res. 169, 1-9 (2006).</li><li>Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+rodent+models+of+Parkinson's+disease.">Transgenic rodent models of Parkinson's disease.</a> Acta Neurochir. (Wien.). 101, 89-92 (2008).</li><li>Isacson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ole+Isacson:+Development+of+New+Therapies+for+Parkinson's+Disease.">Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease.</a> JoVE. 3, (2007).</li></ol>

הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות בינלאומי לטיפול ושימוש יונקים Neuroscience ומחקר התנהגות<sup&gt; 6</sup&gt;, לאחר אישור על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדת שימוש (Comissão Avaliação דה דה דה מועדון חיילים Animais אותם Pesquisa: UFRJ / CAUAP פרוטוקול DAHEICB # 027). אמצעים הולמים ננקטו כדי לצמצם את כאב ואי נוחות של חיות הניסוי.

הנגע חד צדדית נרחבת של מסלול הכושי-striatal יכולה להיות מושגת על ידי הזרקת אמין stereotaxic יחיד של 6-OHDA לתוך בסטריאטום בעכברים. היקף הפגיעה ניתן לאמת שלאחר המוות ע&quot;י אימונוהיסטוכימיה עבור hydroxylase טירוזין (אשר catalyses שיעור הגבלת שלב של הסינתזה של התובע, כלומר המרה של L-tyrosine כדי di...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ketamine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>K&ouml;nig</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>90-120 mg/Kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylazine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>K&ouml;nig</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10 mg/Kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Atropine Sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Isofarma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Isofarma</td>
</tr>
<tr>
<td>6 &#x2013; Hydroxydopamine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5 &mu;g/&mu;L</td>
</tr>
<tr>
<td>L - Ascorbic Acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB Corporation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.2%</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylocaine (Lidocaine Chloridrate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ASTRA Chemistry</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5% 50 mg</td>
</tr>
<tr>
<td>Nebacetin (Neomycin Sulfate + Bacitracin)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Altana Pharma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5 mg/g + 250 Ul/g</td>
</tr>
<tr>
<td>R-(-)-Apomorphine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.5 mg/Kg</td>
</tr>
<tr>
<td>GenTeal lOphthalmic ointment Hypromellose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NOVARTIS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> 0.33%</td>
</tr>
<tr>
<td>Ibuprofen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abbott</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>4 mg/ 100 ml drinking water</td>
</tr>
<tr>
<td>Povidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>JohnsonDiversey</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>R-(-)-Apomorphine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.5 mg/Kg</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

murine model for parkinson's disease: from 6-oh dopamine lesion to behavioral test

מחלת הפרקינסון (PD) משפיע על לפחות 6,500,000 בני אדם ברחבי העולם, ללא הבדל מין, גבולות חברתיים, כלכליים או גיאוגרפיים. תסמינים עיקריים, כגון קשיחות רעד, ו bradikinesia, לפתח כאשר כ 3 / 4 של תאים דופאמינרגיים יאבדו את nigra substantia, ולא מצליחים לספק להסדרת חלקה ומתואמת של מעגלים מנוע striatal. דיכאון הזיות נפוצים, ודמנציה בסופו של דבר מתרחשת אצל 20% מהחולים. בשלב זה, אין טיפול לעכב או לעצור את ההתקדמות של מחלת הפרקינסון. במקום זאת, תרופות המטרה זמין כרגע יותר לכיוון להקל על תסמינים אלו. אסטרטגיות כירורגית ניו הפיך עשוי לעבור על מעגלים פגום מבחינה תפקודית באמצעות גירוי חשמלי של מבנים מוחיים עמוקים, אך למרות גירוי מוחי עמוק הוא התקדמות גדולה, זה לא מתאים לכל החולים. נותר אפוא צורך לבחון גישות חדשות בטיפול תא במודלים פרה. שיבוש neurotoxic סלקטיבי של מסלולים דופאמין ניתן לשחזר על ידי הזרקה של hydroxydopamine-6 ​​(6 OHDA) או MPTP (1-methyl-4-פניל-1-,2,3,6 tertahydropyridine) ואילו depleting סמים חמצוני מזיק כימיקלים עשויה גם להתרבות תכונות ספציפיות של פ&quot;ד במכרסמים. בניגוד MPTP, 6-OHDA נגעים לגרום לאובדן מסיבי עצבי בלתי הפיך, והוא יכול להיות חד או דו צדדי. המודל 6-OHDA הנגע הוא אמין, מוביל גירעונות מנוע חזק, והיא הנפוצה ביותר rats1 לאחר 40 שנים של מחקר. כמו יחסי הגומלין בין תאים מורכבים מארח כעת ניתן ללמוד באופן יסודי יותר בעכברים מאשר בחולדות, המודל כבר משורבב ל 2,3 עכברים, בו התאפיינה לאחרונה 4. בסרטון זה אנו מדגימים כיצד הנגע מסלול שמאל הכושי-striatal של עכברים הרדים ידי לאט ומספק 2.0 μL של 6-OHDA באמצעות מחט המזרק מוכנס מיקרו stereotaxically. ההפסד של דופאמין קלט מתרחשת בתוך ימים, ליקויי פונקציונלי יכול להיות פיקוח על שלאחר הניתוח שבועות וחודשים על ידי בעלי חיים סיבובים דירוג המושרה על ידי סוכני דופאמין 5. כאן, אנו מציגים גוף מלא סיבובים הנגדי המתרחשים 10 דקות לאחר מתן תת עורית אחת של הידרוכלורידי, נמדד כחודש לאחר הפגיעה. התוצאות והחסרונות נדונים להלן.

Watch this Scientific Journal Video about Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test at JoVE.com

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

מחלת פרקינסון נגרמת על ידי אובדן של העצבוב דופאמין אל הסטריאטום, אשר יכול להיגרם בניסוי על ידי 6 דופמין-OH. אנו מתארים כיצד לבצע הנגע stereotaxic כדי לפקח הידרוכלורידי-Induced התנהגות הסיבוב בעכברים. מודל זה שימושי ואמין לבדיקה טיפולים חדשים למחלת פרקינסון.

דגם Murine עבור מחלת פרקינסון: מן הנגע 6-OH דופמין מבחן ההתנהגות

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

murine-model-for-parkinson-s-disease-from-6-oh-dopamine-lesion-to

Research

JoVE Journal

Biology

31.5K Views.  Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil. מחלת פרקינסון נגרמת על ידי אובדן של העצבוב דופאמין אל הסטריאטום, אשר יכול להיגרם בניסוי על ידי 6 דופמין-OH. אנו מתארים כיצד לבצע הנגע stereotaxic כדי לפקח הידרוכלורידי-Induced התנהגות הסיבוב בעכברים. מודל זה שימושי ואמין לבדיקה טיפולים חדשים למחלת פרקינסון.

Video: Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain quality. F. graminearum also causes stalk and ear rots of maize and is a producer of mycotoxins such as the trichothecenes that contaminate grain and are harmful to humans and livestock (Goswami and Kistler, 2004).

The fungus produces two types of spores. Ascospores, the propagules resulting from sexual reproduction, are the main source of primary infection.  These spores are forcibly discharged from mature perithecia and dispersed by wind (Francl et al 1999). Secondary infections are mainly caused by macroconidia which are produced by asexual means on the plant surface. To study the developmental processes of ascospores in this fungus, a procedure for their collection in large quantity under sterile conditions was required. Our protocol was filmed in order to generate the highest level of information for understanding and reproducibility; crucial aspects when full genome gene expression profiles are generated and interpreted. In particular, the variability of ascospore germination and biological activity are dependent on the prior manipulation of the material. The use of video for documenting every step in ascospore production is proposed in order to increase standardization, complying with the increasingly stringent requirements for microarray analysis. The procedure requires only standard laboratory equipment. Steps are shown to prevent contamination and favor time synchronization of ascospores.

To study the developmental processes of ascospores in Gibberella zeae, a procedure for collection under sterile conditions is filmed in order to generate the highest level of information for protocol description. This should facilitate the reproducibility of the experiment, a crucial aspect when full genome expression profile tests are implemented.

Gibberella zeae Ascospore ייצור אוסף לניסויים microarray.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease

Ole Isacson gives a concise overview of Parkinsons's disease, its causes, therapeutic strategies, and advances in Parkinson's research.

אולה Isacson: פיתוח טיפולים חדשים עבור מחלת פרקינסון

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

ראשי ניתק דופמין במוח התיכון Cell תרבויות מן ילודים מכרסמים

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

יישום של C. elegans Assay ניוון Neuron דופמין עבור אימות של מחלת פרקינסון גנים אפשריים

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Murine Model of Hindlimb Ischemia 

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide. Medical therapies for symptomatic relief are limited. Surgical or endovascular interventions are useful for some individuals, but long-term results are often disappointing. As a result, there is a need for developing new therapies to treat PAD. The murine hindlimb ischemia preparation is a model of PAD, and is useful for testing new therapies. When compared to other models of tissue ischemia such as coronary or cerebral artery ligation, femoral artery ligation provides for a simpler model of ischemic tissue. Other advantages of this model are the ease of access to the femoral artery and low mortality rate. 
In this video, we demonstrate the methodology for the murine model of unilateral hindimb ischemia. The specific materials and procedures for creating and evaluating the model will be described, including the assessment of limb perfusion by laser Doppler imaging. This protocol can also be utilized for the transplantation and non-invasive tracking of cells, which is demonstrated by Huang et al.1.

Murine Model of Hindlimb Ischemia

The surgical procedure for induction of unilateral hindlimb ischemia is demonstrated, with confirmation of ischemia by laser Doppler perfusion imaging.

דגם Murine של איסכמיה Hindlimb

In the United States, peripheral arterial disease (PAD) affects about 10 million individuals, and is also prevalent worldwide.  Medical therapies for ...

Blastomere Explants to Test for Cell Fate Commitment During Embryonic Development

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal which tissues descend from each cell of the embryo. Although fate maps are very useful for identifying the precursors of an organ and for elucidating the developmental path by which the descendant cells populate that organ in the normal embryo, they do not illustrate the full developmental potential of a precursor cell or identify the mechanisms by which its fate is determined. To test for cell fate commitment, one compares a cell's normal repertoire of descendants in the intact embryo (the fate map) with those expressed after an experimental manipulation. Is the cell's fate fixed (committed) regardless of the surrounding cellular environment, or is it influenced by external factors provided by its neighbors? Using the comprehensive fate maps of the Xenopus embryo, we describe how to identify, isolate and culture single cleavage stage precursors, called blastomeres. This approach allows one to assess whether these early cells are committed to the fate they acquire in their normal environment in the intact embryo, require interactions with their neighboring cells, or can be influenced to express alternate fates if exposed to other types of signals.

The fate of an individual embryonic cell can be influenced by inherited molecules and/or by signals from neighboring cells. Utilizing fate maps of the cleavage stage Xenopus embryo, single blastomeres can be identified for culture in isolation to assess the contributions of inherited molecules versus cell-cell interactions.

Explants Blastomere לבדיקת מחויבות גורל תא במהלך התפתחות עוברית

Fate maps, constructed from lineage tracing all of the cells of an embryo, reveal  which tissues descend from each cell of the embryo.  Although fate maps ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis כמודל לזיהוי תרגום ירידת ערך

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

מגנטי תא לפעיל על-מיון אסטרטגיות כדי לבודד ולטהר Synovial נגזר הנוזלים בתאי גזע Mesenchymal ממודל ארנב

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

פרוטוקולים לבדיקת הרעילות של הרומן בדיקות, חרקים הביוכימיה על היתושים

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time through noninvasive monitoring of fluorescence emitted by implanted ectopic human endometrial tissue. For this purpose, biopsies of human endometrium are obtained from donor women ongoing oocyte donation. Human endometrial fragments are cultured in the presence of adenoviruses engineered to express cDNA for the reporter fluorescent protein mCherry. Upon visualization, labeled tissues with an optimal rate of fluorescence after infection are subsequently chosen for the implantation in recipient mice. One week prior to the implantation surgery, recipient mice are oophorectomized, and estradiol pellets are placed subcutaneously to sustain the survival and growth of lesions. On the day of surgery mice are anesthetized, and peritoneal cavity accessed through a small (1.5 cm) incision by the linea-alba. Fluorescently labeled implants are tweezed, briefly soaked in glue and attached to the peritoneal layer. Incisions are sutured, and animals left to recover for a couple of days. Fluorescence emitted by endometriotic implants is usually non-invasively monitored every 3 days for 4 weeks with an in vivo imaging system. Variations in the size of endometriotic implants can be estimated in real time by quantification of the mCherry signal and normalization against the initial time-point showing maximal fluorescence intensity.
Traditional preclinical rodents of models of endometriosis do not allow non-invasive monitoring of lesion in real time but rather allow evaluation of the effects of drugs assayed at the end point. This protocol allows one to track lesions in real time and is more useful to explore the therapeutic potential of drugs in preclinical models of endometriosis. The main limitation of the model thus generated is that non-invasive monitoring is not possible over long periods of time due to the episomal expression of Ad-virus.

Here, we present a protocol for live-imaging of fluorescently labeled human endometrial fragments grafted in mice. The method allows studying the effects of drugs of choice on endometriotic lesion size through monitoring and quantification of fluorescence emitted by the fluorescent reporter on real time

ניטור לא פולשנית של גודל הנגע במודל של עכברים Heterologous ' של אנדומטריוזיס

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...