Soutenu par la Fundação de Amparo une Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) et Conselho Nacional de Desenvolvimento Tecnológico e Científico (CNPq). Nous sommes reconnaissants aux lecteurs anonymes dont les commentaires nous ont aidés à améliorer à la fois le manuscrit et la vidéo.

Tous les produits chimiques stockés sous forme solide, comme le 6-OHDA et apomorphine, ont été dilués dans de l&#39;eau d&#39;injection stérile et filtrée dans une hotte à flux laminaire, pour éviter toute contamination. En outre, les neurotoxines et substances neuro ont été entreposés, préparés, manipulés et éliminés conformément aux règlements établis par les directives internationales 6 et le Comité de biosécurité locales. 1 - L&#39;anesthésie et la chirurgie Adulte souris mâles Swiss (25-30g) sont une prémédication par l&#39;atropine (0,2 mg / kg, sc) pour réduire le tonus vagal puis anesthésiés avec une injection intrapéritonéale de kétamine (90-120 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg) . L&#39;animal est placé sur un coussin chauffant à commande électronique (Insight) pour assurer la température du corps est maintenue à 37 ° C, que l&#39;induction de la sédation prend quelques minutes. Le niveau d&#39;anesthésie est vérifiée tout au long de la procédure en testant l&#39;absence de réflexe de retrait. Dosage anesthésique devrait être ajusté pour chaque souche / colonie. Selon l&#39;animal et la durée de l&#39;intervention chirurgicale, des doses supplémentaires de la kétamine peut être nécessaire. Après cela, une solution saline (NaCl 0,9%) est appliqué sur les deux yeux afin de protéger les cornées de s&#39;assécher et de tester l&#39;absence de réflexe de clignement dans ce premier moment. La fourrure sur la tête entière est rasée avec une tondeuse à assurer le minimum de contact avec les zones non stériles. L&#39;anesthésie locale (xylocaïne) est appliquée aux barres d&#39;oreille pour éviter la gêne. Une seule fois de retrait et de réflexe de clignement ont disparu, indiquant le niveau d&#39;anesthésie est assez profond pour la chirurgie (phase 3), l&#39;animal est placé sur le cadre stéréotaxique utilisant embouchure et de barres d&#39;oreilles spécialement conçu pour cette espèce (Insight). Une fois positionated, d&#39;une pommade ophtalmologique (Marca) est appliqué pour protéger les yeux des animaux à travers toute la chirurgie. C&#39;est seulement après être sûr que les yeux sont correctement protégés, la procédure continuera avec la désinfection de la peau de la région chirurgicale en répétant trois applications de l&#39;iode povidone suivie par 70% d&#39;éthanol, en utilisant des tampons stériles cotons Après, bon positionnement des barres oreille est assurée par des tests pour les mouvements latéraux de la tête (la tête ne doit pas bouger afin de s&#39;assurer que les barres sont solidement fixées). Une bonne inclinaison de la tête dorsoventral sera vérifiée ultérieurement où les repères du crâne sont révélés. Une incision sagittale (1,5 cm) est fait avec un scalpel stérile (# 15 lames). Le périoste sur la zone d&#39;intérêt est légèrement gratté avec une lame neuve, et l&#39;os est essuyée avec le regard stérile et tampons de coton, de découvrir repères du crâne: bregma est défini comme le point d&#39;intersection des sutures sagittale et coronale, tandis lambda est le point d&#39;intersection de la suture sagittale et la ligne de meilleur ajustement passant par les parties gauche et droite de la suture lambdoïde. La pointe d&#39;une aiguille de référence alignés verticalement est d&#39;abord remis à zéro à la bregma, à l&#39;examen au microscope chirurgical, puis déplacé à toucher le point lambda. Si la tête est correctement positionnée, lambda devrait être au même niveau dorso-ventrale que bregma, et les deux points de repère doivent être éloignés de 4,2 mm sur l&#39;axe rostro-caudal. Sinon, les barres oreilles et nez devrait être desserrer et la tête inclinée délicatement autour de l&#39;axe interaural, afin d&#39;atteindre la position désirée, qui définit le «crâne plat» de référence pour les mesures stereotaxical. La pointe de l&#39;aiguille de référence est alors positionné aux coordonnées souhaitées: antéro-postérieure (AP 0.5 mm) et latérales (L -2,0 mm, gauche). L&#39;emplacement est marqué sur le crâne et une petite taille (1,2 mm de diamètre) le trou est ouvert avec un foret stérilisés, en utilisant l&#39;action intermittente pour empêcher la chaleur de la région. Des fragments osseux sont soigneusement enlevés avec une curette dentaires et lavé avec de stériles chaude de NaCl 0,9%. Le stérilisée 5 pl seringue Hamilton (26s jauge; 0,47 mm de diamètre extérieur) est chargé avec la solution de 6-OHDA (ou d&#39;un véhicule pour les animaux de contrôle) et alignés verticalement dans l&#39;appareil de stéréotaxie. La pointe de l&#39;aiguille (de type 2 ou 12 coniques °) est alors insérée dans le trou ouvert, jusqu&#39;à toucher la surface piales, pour déterminer la référence de la coordonnée dorso-ventrale. Une fois déterminée cette coordonnée, l&#39;aiguille est descendu lentement pour atteindre les coordonnées du striatum (AP: 0,5; L: -2,0 et DV: -3,0 mm, en dessous de la surface piales 7). La solution de 6-OHDA (10 ug 6-OHDA dans NaCl 0,9% avec de l&#39;acide ascorbique 0,02%), qui a été préparée et filtrée dans une hotte à flux laminaire, et doit être protégé de la lumière par des feuilles d&#39;aluminium pendant toute la procédure, est ensuite injecté à un débit de 0.1μL/min. Pour les animaux de contrôle, un volume égal de véhicule (0,02% d&#39;acide ascorbique et 0,9% de NaCl dans l&#39;eau stérile) est injecté. Une fois l&#39;ensemble de 2,0 uL a été injecté, la seringue est maintenu en place pendant 5 min avant d&#39;être très lentement rétracté par le cerveau, dans pas moins que dans les 5 minutes. Le crâne est nettoyé et l&#39;incision est refermée à l&#39;aide d&#39;une suture # Nylon 6-0 (Shalon). Pour prendre un supplémentairesoins contre l&#39;infection, un onguent antibiotique local, comme la néomycine, peut être appliqué sur la peau suturée. Les animaux sont retirés de la trame, étant donné 0,5 ml de solution saline (sc.) pour prévenir la déshydratation, et gardé au chaud et sous surveillance étroite jusqu&#39;à la guérison complète. Ils sont alors logés avec nourriture et eau ad libitum. Analgésique est ajouté à la bouteille d&#39;eau potable pour les deux premiers jours après la chirurgie (donné une consommation d&#39;eau moyenne quotidienne de 5,5 ml, et une dose recommandée de 0,03 mg d&#39;ibuprofène / g de poids corporel / jour, ajouter 0,82 ml de 20 mg / ml Ibuprofène-Abbott suspension à 100 ml d&#39;eau potable). Souris guérissent habituellement sans délai de la procédure, l&#39;errance et d&#39;atteindre des boulettes de nourriture de l&#39;eau facilement. Dans tous les cas de malaise apparent, ou tout signe d&#39;infection, les animaux doivent être euthanasiés conformément aux directives locales. 2 - test comportemental Bien déficience motrice peut être observée après une semaine, un intervalle post-lésionnelle d&#39;un mois est autorisée avant quantification fiable avec le test de rotation. L&#39;animal reçoit une injection sous-cutanée d&#39;apomorphine agoniste DA (0,5 mg / kg), et est placé dans un cylindre opaque de 30 cm de diamètre, placé à 45 cm en dessous de la caméra d&#39;enregistrement. Il est important d&#39;enlever tous les résidus et les odeurs des animaux préalablement testés avant chaque test. Après une période d&#39;habituation 5 min, ses mouvements sont enregistrés sur une période de 5 min. Les deux contre-ipsilatérale et du corps entier de rotation sont mesurés et comparés au groupe témoin (véhicule injectés). Si la procédure a été correctement effectuée, les animaux de contrôle ne présentent aucune rotation, tandis que la 6-OHDA animaux lésés commence à tourner sur le côté controlatéral, puisque l&#39;agoniste active principalement dans le striatum dénervé supersensibles sur le côté lésé. Animaux score de plus de 7 tours (affichant au moins 7 rotations du corps entier controlatéral par minute) sont considérés comme des succès lésé. L&#39;animal peut être renvoyés en toute sécurité à leur logement 30 min après le test, qui peut être répété chaque semaine. Dans nos mains, à moins de 5% des souris lésées affiché des taux de rotation optimales.

<ol>
	<li>Ungerstedt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=6-hydroxy-dopamine+induced+degeneration+of+central+monoamine+neurons.">6-hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons.</a> Eur. J. Pharmacol. 5, 107-110 (1968).</li><li>Akerud, P., Canals, J. M., Snyder, E. Y., Arenas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+through+delivery+of+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+by+neural+stem+cells+in+a+mouse+model+of+Parkinson's+Disease.">Neuroprotection through delivery of glial cell line-derived neurotrophic factor by neural stem cells in a mouse model of Parkinson's Disease.</a> J. Neurosci. 21, 8108-8118 (2001).</li><li>Ghosh, A., Roy, A., Liu, X., Kordower, J. H., Mufson, E. J., Hartley, D. M., Ghosh, S., Mosley, R. L., Gendelman, H. E., Pahan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+NF-kappaB+activation+prevents+dopaminergic+neuronal+loss+in+a+mouse+model+of+Parkinson's+Disease.">Selective inhibition of NF-kappaB activation prevents dopaminergic neuronal loss in a mouse model of Parkinson's Disease.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 18754-18759 (2007).</li><li>Alvarez-Fischer, D., Henze, C., Strenzke, C., Westrich, J., Ferger, B., H&#246;glinger, G. U., Oertel, W. H., Hartmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+striatal+6-OHDA+model+of+Parkinson's+disease+in+wild+type+and+a-synuclein-deleted+mice.">Characterization of the striatal 6-OHDA model of Parkinson's disease in wild type and a-synuclein-deleted mice.</a> Exp. Neurol. 210, 182-193 (2008).</li><li>Ungerstedt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=6-Hydroxydopamine-induced+degeneration+of+the+nigrostriatal+dopamine+pathway:+The+turning+syndrome.">6-Hydroxydopamine-induced degeneration of the nigrostriatal dopamine pathway: The turning syndrome.</a> Pharmacology and Therapeutics Part B: General and Systematic Pharmacology. 2, 37-40 (1976).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines for the Care and Use of Mammals in Neuroscience and Behaviour Research. , 209 (2003).</li><li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1997).</li><li>Hudson, J. L., Horne, C. G. v. a. n., Str&#246;mberg, I., Brock, S., Clayton, J., Masserano, J., Hoffer, B. J., Gerhardt, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+apomorphine-+and+amphetamine-induced+turning+with+nigrostriatal+dopamine+content+in+unilateral+6-hydroxydopamine+lesioned+rats.+Brain+Res.">Correlation of apomorphine- and amphetamine-induced turning with nigrostriatal dopamine content in unilateral 6-hydroxydopamine lesioned rats. Brain Res.</a> , 626-6167 (1993).</li><li>Truong, L., Allbutt, H., Kassiou, M., Henderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+a+preclinical+model+of+Parkinson's+disease:+A+study+of+behaviour+in+rats+with+graded+6-OHDA+lesions.">Developing a preclinical model of Parkinson's disease: A study of behaviour in rats with graded 6-OHDA lesions.</a> Behav. Brain Res. 169, 1-9 (2006).</li><li>Harvey, B. K., Wang, Y., Hoffer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+rodent+models+of+Parkinson's+disease.">Transgenic rodent models of Parkinson's disease.</a> Acta Neurochir. (Wien.). 101, 89-92 (2008).</li><li>Isacson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ole+Isacson:+Development+of+New+Therapies+for+Parkinson's+Disease.">Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease.</a> JoVE. 3, (2007).</li></ol>

Des expériences ont été effectuées en conformité avec les Lignes directrices internationales pour les soins et l&#39;utilisation des mammifères dans les neurosciences et la recherche sur le comportement<sup&gt; 6</sup&gt;, Après approbation par le soin des animaux et du Comité institutionnel d&#39;utilisation (Comissão de Avaliação de uso de Pesquisa em Animais: UFRJ / CAUAP Protocole # DAHEICB 027). Des mesures adéquates ont été prises pour minimiser la douleur et l&#39;inconfort des animaux de laboratoire.

Vaste lésion unilatérale de la voie nigro-striatale peut être réalisé de manière fiable chez la souris par une seule injection stéréotaxique de 6-OHDA dans le striatum. L&#39;étendue de la lésion peut être vérifiée post-mortem par immunohistochimie de la tyrosine hydroxylase (qui catalyse la limitation du débit stade de la synthèse de DA, à savoir la conversion de la L-tyrosine en dihydroxyphénylalanine), comme illustré dans la vidéo. In vivo, les rotations controlatérale...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ketamine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>K&ouml;nig</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>90-120 mg/Kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylazine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>K&ouml;nig</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>10 mg/Kg</td>
</tr>
<tr>
<td>Atropine Sulfate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Isofarma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Isofarma</td>
</tr>
<tr>
<td>6 &#x2013; Hydroxydopamine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5 &mu;g/&mu;L</td>
</tr>
<tr>
<td>L - Ascorbic Acid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB Corporation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.2%</td>
</tr>
<tr>
<td>Xylocaine (Lidocaine Chloridrate)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ASTRA Chemistry</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5% 50 mg</td>
</tr>
<tr>
<td>Nebacetin (Neomycin Sulfate + Bacitracin)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Altana Pharma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5 mg/g + 250 Ul/g</td>
</tr>
<tr>
<td>R-(-)-Apomorphine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.5 mg/Kg</td>
</tr>
<tr>
<td>GenTeal lOphthalmic ointment Hypromellose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>NOVARTIS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td> 0.33%</td>
</tr>
<tr>
<td>Ibuprofen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Abbott</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>4 mg/ 100 ml drinking water</td>
</tr>
<tr>
<td>Povidine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>JohnsonDiversey</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>R-(-)-Apomorphine hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>0.5 mg/Kg</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

murine model for parkinson's disease: from 6-oh dopamine lesion to behavioral test

La maladie de Parkinson (MP) affecte au moins 6,5 millions de personnes dans le monde entier, indépendamment du sexe, les frontières sociales, ethniques, économiques ou géographiques. Les symptômes principaux, tels que tremblements, rigidité et bradikinesia, développer lorsque environ 3 / 4 des cellules dopaminergiques sont perdus dans la substantia nigra, et ne parviennent pas à fournir pour la douceur, la régulation coordonnée des circuits moteurs du striatum. La dépression et les hallucinations sont fréquentes, et la démence survient finalement dans 20% des patients. À ce moment, il n&#39;existe aucun traitement pour retarder ou arrêter la progression du Parkinson. Plutôt, les médicaments actuellement disponibles visent plus vers la réduction de ces symptômes. De nouvelles stratégies chirurgicales peuvent passer réversiblement sur les circuits fonctionnellement endommagé par la stimulation électrique des structures cérébrales profondes, mais bien que la stimulation cérébrale profonde est une avancée majeure, il ne convient pas à tous les patients. Il reste donc nécessaire de tester de nouvelles approches de thérapie cellulaire dans des modèles précliniques. Sélective des perturbations des voies dopaminergiques neurotoxiques peuvent être reproduites par l&#39;injection de 6-hydroxydopamine (6-OHDA) ou MPTP (1-méthyl-4-phényl-1 ,2,3,6-tertahydropyridine) alors appauvrissant la drogue et l&#39;oxydation qui endommagent les produits chimiques peuvent également reproduire les caractéristiques spécifiques de PD chez les rongeurs. Contrairement à la MPTP, 6-OHDA, provoquent des lésions massives perte irréversible des neurones, et peut être uni-ou bilatérale. Le modèle lésion 6-OHDA est fiable, conduit à des déficits moteurs robustes, et est la plus largement utilisée après 40 années de recherche dans rats1. Comme les interactions entre les cellules greffées et l&#39;hôte peut désormais être étudié plus à fond dans des souris plutôt que chez le rat, le modèle a été transposé à des souris 2,3, où il a été récemment caractérisée 4. Dans cette vidéo, nous démontrons comment une lésion gauche nigro-striatale voie de souris anesthésiées par lentement livrer 2,0 uL de 6-OHDA par un stéréotaxique inséré micro-seringue aiguille. La perte de l&#39;apport dopaminergique survient en quelques jours, et les déficiences fonctionnelles peuvent être surveillés au cours post-opératoire des semaines et des mois par des rotations d&#39;animaux notation induite par les agents dopaminergiques 5. Ici, nous montrons tout le corps rotations controlatérales survenant 10 minutes après une administration unique sous-cutanée d&#39;apomorphine, mesurée un mois après la lésion. Les résultats et les inconvénients sont discutés ci-dessous.

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Murine Model for Parkinson&#039;s Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

La maladie de Parkinson est causée par la perte de l&#39;innervation dopaminergique dans le striatum, qui peut être induite expérimentalement par la 6-OH-dopamine. Nous décrivons comment effectuer une lésion stéréotaxique et de surveiller l&#39;apomorphine induit un comportement de rotation chez la souris. Ce modèle est utile et fiable pour les tests de nouvelles thérapies pour la maladie de Parkinson.

Modèle murin de la maladie de Parkinson: de lésion dopamine 6-OH au test comportemental

Parkinson's disease (PD) affects at least 6.5 million people worldwide, irrespective of gender, social, ethnic, economic, or geographic boundaries. Key ...

murine-model-for-parkinson-s-disease-from-6-oh-dopamine-lesion-to

Research

JoVE Journal

Biology

Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

31.4K vues.  Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil. La maladie de Parkinson est causée par la perte de l'innervation dopaminergique dans le striatum, qui peut être induite expérimentalement par la 6-OH-dopamine. Nous décrivons comment effectuer une lésion stéréotaxique et de surveiller l'apomorphine induit un comportement de rotation chez la souris. Ce modèle est utile et fiable pour les tests de nouvelles thérapies pour la maladie de Parkinson.

Vidéo: Murine Model for Parkinson's Disease: from 6-OH Dopamine Lesion to Behavioral Test

Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson's Disease

Ole Isacson: Development of New Therapies for Parkinson&#039;s Disease

Ole Isacson gives a concise overview of Parkinsons's disease, its causes, therapeutic strategies, and advances in Parkinson's research.

Ole Isacson: développement de nouvelles thérapies pour la maladie de Parkinson

Recherche

Biologie

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

Primaire Dissocié cultures Mésencéphale dopamine cellulaire du nouveau-né contre les rongeurs

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson&#039;s Disease Genes

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

Application d&#39;une Assay C. elegans dégénérescence des neurones dopaminergiques pour la validation du potentiel de la maladie de Parkinson gènes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The initiation step, which involves the assembly of the ribosomal subunits at the mRNA initiation codon, involved initiation factor including eIF4G1. Defects in this rate limiting step of translation are linked to diverse disorders. To study the potential consequences of such deregulations, Xenopus laevis oocytes constitute an attractive model with high degrees of conservation of essential cellular and molecular mechanisms with human. In addition, during meiotic maturation, oocytes are transcriptionally repressed and all necessary proteins are translated from preexisting, maternally derived mRNAs. This inexpensive model enables exogenous mRNA to become perfectly integrated with an effective translation. Here is described a protocol for assessing translation with a factor of interest (here eIF4G1) using stored maternal mRNA that are the first to be polyadenylated and translated during oocyte maturation as a physiological readout. At first, mRNA synthetized by in vitro transcription of plasmids of interest (here eIF4G1) are injected in oocytes and kinetics of oocyte maturation by Germinal Vesicle Breakdown detection is determined. The studied maternal mRNA target is the serine/threonine-protein-kinase mos. Its polyadenylation and its subsequent translation are investigated together with the expression and phosphorylation of proteins of the mos signaling cascade involved in oocyte maturation. Variations of the current protocol to put forward translational defects are also proposed to emphasize its general applicability. In light of emerging evidence that aberrant protein synthesis may be involved in the pathogenesis of neurological disorders, such a model provides the opportunity to easily assess this impairment and identify new targets.

Xenopus laevis as a Model to Identify Translation Impairment

Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.

Xenopus laevis comme un modèle pour identifier traduction Dépréciation

Protein synthesis is a fundamental process to gene expression impacting diverse biological processes notably adaptation to environmental conditions. The ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Cellule magnétique activé tri des stratégies visant à isoler et purifier Synovial fluide mésenchymateuses cellules souches dérivées d’un modèle de lapin

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Noninvasive Monitoring of Lesion Size in a Heterologous Mouse Model of Endometriosis

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time through noninvasive monitoring of fluorescence emitted by implanted ectopic human endometrial tissue. For this purpose, biopsies of human endometrium are obtained from donor women ongoing oocyte donation. Human endometrial fragments are cultured in the presence of adenoviruses engineered to express cDNA for the reporter fluorescent protein mCherry. Upon visualization, labeled tissues with an optimal rate of fluorescence after infection are subsequently chosen for the implantation in recipient mice. One week prior to the implantation surgery, recipient mice are oophorectomized, and estradiol pellets are placed subcutaneously to sustain the survival and growth of lesions. On the day of surgery mice are anesthetized, and peritoneal cavity accessed through a small (1.5 cm) incision by the linea-alba. Fluorescently labeled implants are tweezed, briefly soaked in glue and attached to the peritoneal layer. Incisions are sutured, and animals left to recover for a couple of days. Fluorescence emitted by endometriotic implants is usually non-invasively monitored every 3 days for 4 weeks with an in vivo imaging system. Variations in the size of endometriotic implants can be estimated in real time by quantification of the mCherry signal and normalization against the initial time-point showing maximal fluorescence intensity.
Traditional preclinical rodents of models of endometriosis do not allow non-invasive monitoring of lesion in real time but rather allow evaluation of the effects of drugs assayed at the end point. This protocol allows one to track lesions in real time and is more useful to explore the therapeutic potential of drugs in preclinical models of endometriosis. The main limitation of the model thus generated is that non-invasive monitoring is not possible over long periods of time due to the episomal expression of Ad-virus.

Here, we present a protocol for live-imaging of fluorescently labeled human endometrial fragments grafted in mice. The method allows studying the effects of drugs of choice on endometriotic lesion size through monitoring and quantification of fluorescence emitted by the fluorescent reporter on real time

Surveillance non invasive de la taille de la lésion dans un modèle murin hétérologues d’endométriose

Here, we describe a protocol for the implementation of a heterologous mouse model in which progression of endometriosis can be assessed in real time ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer progression. How the chromosomal location and function of a centromere (i.e., centromere identity) are determined and participate in accurate chromosome segregation is a fundamental question. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-CENP-A K124R mutant suggesting that ubiquitylation at a different lysine is induced because of the EYFP tagging in the CENP-A K124R mutant protein. Lysine 306 (K306) ubiquitylation in EYFP-CENP-A K124R was successfully identified, which corresponds to lysine 56 (K56) in CENP-A through mass spectrometry analysis. A caveat is discussed in the use of GFP/EYFP or the tagging of high molecular weight protein as a tool to analyze the function of a protein. Current technical limit is also discussed for the detection of ubiquitylated bands, identification of site-specific ubiquitylation(s), and visualization of ubiquitylation in living cells or a specific single cell during the whole cell cycle.
The method of mass spectrometry analysis presented here can be applied to human CENP-A protein with different tags and other centromere-kinetochore proteins. These combinatory methods consisting of several assays/analyses could be recommended for researchers who are interested in identifying functional roles of ubiquitylation.

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Here we describe mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.

Analyse de spectrométrie de masse pour identifier l’ubiquité de cenp-A marqué par EYFP (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Isolement de myocytes auriculaires et ventriculaires murins de haute qualité pour des mesures simultanées des transitoires Ca2+ et du courant calcique de type L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease

L-DOPA-induced dyskinesias (LIDs) refer to motor complications that arise from prolonged L-DOPA administration to patients with Parkinson's disease (PD). The most common pattern observed in the clinic is the peak-dose dyskinesia which consists of clinical manifestations of choreiform, dystonic, and ballistic movements. The 6-hydroxydopamine (6-OHDA) rat model of PD mimics several characteristics of LIDs. After repeated L-DOPA administration, 6-OHDA-lesioned rats exhibit dyskinetic-like movements (e.g., abnormal involuntary movements, AIMs). This protocol demonstrates how to induce and analyze AIMs in 6-OHDA-lesioned rats with 90%-95% dopaminergic depletion in the nigrostriatal pathway. Repeated administration (3 weeks) of L-DOPA (5 mg/kg, combined with 12.5 mg/kg of benserazide) can induce the development of AIMs. The time course analysis reveals a significant increase in AIMs at 30-90 min (peak-dose dyskinesia). Rodent models of LIDs are an important preclinical tool to identify effective antidyskinetic interventions.

Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson&#039;s Disease

Rodent models of L-DOPA-induced dyskinesias are invaluable tools to identify therapeutic interventions to attenuate the development or alleviate the manifestations that emerge due to the repeated administration of L-DOPA. This protocol demonstrates how to induce and analyze dyskinetic-like movements in the unilaterally 6-OHDA-lesioned rat model of Parkinson's disease.

Évaluation des dyskinésies induites par la L-DOPA dans le modèle unilatéral de la maladie de Parkinson chez le rat à 6-OHDA

L-DOPA-induced dyskinesias (LIDs) refer to motor complications that arise from prolonged L-DOPA administration to patients with Parkinson's disease (PD). ...

Culture 3D d’organoïdes à partir de cryptes intestinales murines et de cellules souches uniques

The 3D Culturing of Organoids from Murine Intestinal Crypts and a Single Stem Cell for Organoid Research

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine small intestinal crypts can form organoids that mimic the intestinal epithelium when cultured in a 3D extracellular matrix. The organoids are composed of all cell types that fulfill various intestinal homeostatic functions. These include Paneth cells, enteroendocrine cells, enterocytes, goblet cells, and tuft cells. Well-characterized molecules are added into the culture medium to enrich the intestinal stem cells (ISCs) labeled with leucine-rich repeats containing G protein-coupled receptor 5 and are used to drive differentiation down specific lineages; these molecules include epidermal growth factor, Noggin (a bone morphogenetic protein), and R-spondin 1. Additionally, a protocol to generate organoids from a single erythropoietin-producing hepatocellular receptor B2 (EphB2)-positive ISC is also detailed. In this methods article, techniques to isolate small intestinal crypts and a single ISC from tissues and ensure the efficient establishment of organoids are described.

Pleins feux sur l’auteur : La culture 3D d’organoïdes à partir de cryptes intestinales murines et d’une seule cellule souche pour la recherche sur les organoïdes  

We describe a protocol to isolate murine small intestinal crypts and culture intestinal 3D organoids from the crypts. Additionally, we describe a method to generate organoids from a single intestinal stem cell in the absence of a sub-epithelial cellular niche.

La culture 3D d’organoïdes à partir de cryptes intestinales murines et d’une seule cellule souche pour la recherche organoïde

At present, organoid culture represents an important tool for in vitro studies of different biological aspects and diseases in different organs. Murine ...