הפרוטוקול הוא משמעותי בהדגמת פגיעה מוטורית דגי זברה והתאוששות לאחר מכן, בעקבות הזרקה תוך חדרית-שרירית של neurotoxin 6-hydroxydopamine בדיאנספלון הגחון. טכניקה זו מדגימה שינויים בהשפעות התפקודיות, התואמות את אבלציה ספציפית של נוירונים דופאמין בדיאנספלון הגחוני של 6-OHDA נגע דגי זברה בוגרים, באמצעות התקנה פשוטה מאוד. מחקרים עתידיים על המנגנונים שבבסיס הארגון העצבי, כמו גם הגורמים המהותיים והחיצוניים המווסתים את התהליך, עשויים לספק תובנות חשובות על אסטרטגיות טיפול בהחלפת תאים נגד מחלת פרקינסון.
לשמור על הדג במיכל מים מינרלי מזוקק עם גרם אחד לליטר מלח ים מסחרי, תחת טמפרטורת שליטה של 28, בתוספת או מינוס מעלה אחת צלזיוס. יש לאכלס עד 25 דגים למיכל של 45 ליטר ולחשוף אותם לפוטופריויד כהה של 14 שעות ו-10 שעות. להאכיל את הדגים לפחות פעמיים ביום עם כדורי מזון, בתוספת תולעים מיובשות בהקפאה.
הכן פתרון מלאי של Tricaine מתנסולפונאט, על ידי המסת שניים וחצי גרם של Tricaine מתנסלפונט וחמישה גרם של סודיום ביקרבונט ב 250 מיליליטר של מים מזוקקים. לדלל שני מיליליטר של פתרון מלאי כדי להפוך 200 מיליליטר של פתרון הרדמה עובד. הכן טרי 99.96 מילימולרי 6-hydroxydopamine, על ידי המסה ראשונה 0.2 מיליגרם של חומצה אסקורבית במיליליטר אחד של 0.9% משקל על ידי נפח סטרילי מסונן נתרן כלורי.
סנן את הפתרון באמצעות מסנן של 0.2 מיקרון. לאחר מכן להוסיף 25 מיליגרם של 6-hydroxydopamine, בצורת אבקה, לתוך הפתרון. מקם את הדגים המרדים על ספוג ספוג מים, ממוקם מתחת למיקרוסקופ סטריאו והרטיב את הדגים באופן קבוע.
זהה את המיקום להזרקה, בהתבסס על ההצטלבות בין תפר metopic, תפר קורונלי ותפר קשתי, המחבר את הגולגולת הקודקודית והחזיתית של מוח דג הזברה. ואז לעשות חור קטן של מילימטר אחד בריבוע, באמצעות מחט חדה 27 מד. מנמיכים את מזרק המיקרו-קפילרי בזווית של 60 מעלות, עד שהוא מגיע לעומק של 1200 מיקרומטר מהגג הגולגולתי של גולגולת דג הזברה.
הקש על מגבלת Z כדי לתקן את המיקום. הגדר את לחץ ההזרקה הראשוני ל-4,000 הקטופסקל. משך ההזרקה הוא 2.3 שניות.
לחץ פיצוי ל-10 הקטופסקל. להנמיך את עוצמת הזריקה, עם כל זריקה עוקבת. הזרקו 0.5 מיקרוליטרים של רעלן עצבי 99.96 מילימולרי 6-הידרוקסידופמין או 0.9% משקל לפי נפח מלוחים, בקבוצת הביקורת המזויפת, ותנו למיקרו-קפילרי לנוח במשך 20 שניות.
ממשיכים להרטיב את הדגים במים מזוקקים לאורך כל התהליך, כדי למנוע ייבוש. הסירו באיטיות את המיקרו-קפרילריה והחיו את הדגים תחת מים מזוקקים זורמים. מניחים את הדגים במיכל התאוששות מבודד ומסירים כל הסחת דעת שעלולה להפריע לתהליך ההחלמה.
לשטוף את microcapillary לפני הזריקה הבאה, כדי לנקות את החסימה ולוודא כי עוצמת הזריקה מספיק כדי להניב את הנפח הרצוי של 0.5 מיקרוליטרים של 6-hydroxydopamine. בצע הערכת לוקומוטור של דגי זברה בנפרד, באמצעות מבחן הטנק הפתוח, ביום השלישי וביום 30, לאחר 6-hydroxydopamine. הנח את הטנק הניסיוני, עם קירותיו מכוסים בנייר לבן, על פלטפורמה מוגבהת.
להאיר את הטנק מלמטה, באמצעות מקור אור. מלאו את המיכל ב-80 עד 90% מים מזוקקים ושמרו על הטמפרטורה ב-28, פלוס או מינוס מעלות צלזיוס. למדוד את הטמפרטורה באמצעות מדחום ולווסת אותו באמצעות תנור אקווריום מסחרי.
לאחר שתי דקות לפחות של התאקלמות, להקליט את התנהגות שחייה דגים מתצוגה מתוכננת על המישור הדו מימדי של אזור הניסוי, באמצעות מצלמת וידאו במשך חמש דקות. כדי למנוע חוסר עקביות, בקבוצות שונות של הקלטות, לא יעלה על 10 דקות של התאקלמות. נתח את קטעי הווידאו באמצעות תוכנת מעקב וידאו עם פרוטוקול הטנק הפתוח, לרכישת מרחק נסע ומהירות ממוצעת של כל נושא.
הניסוי הנוכחי העריך את השינויים בהתנהגות השחייה של דגי הזברה הבוגרים, בעקבות מיקרו-חדירה תוך-שרירית עם 6-הידרוקסידופמין. אזור המוח העיקרי של עניין היה diencephalon הגחון, המורכב של האזור preoptic, שחפת אחורית והיפותלמוס. יותר מ -85% של טירוזין hydroxylase immunoreactive נוירונים דופאמין ב diencephalon הגחוני היו ablated ביום השלישי postlesion.
מספר נוירונים טירוזין הידרוקסילאז immunoreactive דופאמין ואז להגדיל על ידי יותר מ 50% ביום 14 postlesion, לפני השגת התחדשות מלאה 30 ימים postlesion. ניתוח התנהגות השחייה של דגי הזברה, באמצעות תוכנת מעקב וידאו, הצביע על כך שהמהירות הממוצעת והמרחק שעברו של הקבוצה הנגעת, ביום השלישי שלאחר ההדבקה, צומצמו באופן משמעותי לפחות מ -45% בהשוואה לזיוף. הקבוצה הנגעית הציגה התאוששות של תפקוד מוטורי, 30 ימים postlesion, ללא הבדל משמעותי של המהירות הממוצעת או המרחק נסע, בהשוואה לזיוף.
חשוב לבצע את הערכת הלוקומוטור בתוך מסגרת זמן קבועה. לדוגמה, 8:00 עד 12:00. וטמפרטורת המים נשמרה על 28 מעלות צלזיוס, לאורך כל הניסוי. בדיקות התנהגותיות אחרות, כמו shoaling והתנהגויות דמויי חרדה, ניתן לבצע, כדי לחקור שינויים נוספים או השפעות תפקודיות של אבלציה נוירונים דופאמין, לאחר הזרקת 6-OHDA של המוח דגי הזברה הבוגר.
