שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוסקופיה האופטית, כגון כיצד לצלם תמונות ברזולוציית-על וכן תמונות FRET המשתמשות באותו מיקרוסקופ. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שאנחנו יכולים לשלב שלושה מודולי הדמיה שונים לתוך מיקרוסקופ אחד, להפחית באופן משמעותי את העלות הכוללת. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כמו הרכבה של נתיב העירור קשה ללמוד.
הם דורשים בחירה נכונה של חלקים ויישור אופטי רגיש. כדי להתחיל, התקן כרטיס רכישת נתונים באמצעות ממשק PCI ולהשתמש בו כדי לחבר את הלייזרים למחשב. שלוט בהתנהגויות של הלייזרים לאורך ומטה על-ידי פלט לוגי טרנזיסטור-טרנזיסטור והתאמת הכוח שלהם על-ידי הפלט האנלוגי של כרטיס זה.
לאחר מכן, הכינו שולחן אופטי מבודד רטט עם מראות ומפצלי קרן כפי שמוצג כאן ומתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. שלב את קרני הלייזר לסיבים אופטיים במצב יחיד על-ידי הרכבה תחילה של לוח מתאם סיבים בהרכבת תרגום ציר z. לאחר מכן, הר עדשת כפולה אכרומטית בצלחת כלוב.
השתמש במוט הרחבה כדי לחבר את המתאם והעדשה כדי ליצור כלוב. לאחר מכן, השתמש בפוסטים אופטיים בעובי 1 אינץ' כדי להרכיב את הכלוב על השולחן האופטי. יישר את לייזר 647 ננומטר על ידי התאמת הרכיבים כדי לקבל תפוקת כוח לייזר מקסימלית דרך הסיבים.
לאחר יישור של הלייזר הראשון נעשה, להתקין באופן זמני זוג קשתיות וליישר את שאר לייזרים אחד אחד. בדוק את יעילות היישור של כל לייזר עם מד כוח. הקפד להשאיר קשתית אחת מול לוחית המתאם כדי להפחית את ההשתקפויות של הלייזרים.
לאחר מכן, עצב והתקן את עדשת ההגדלה כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. על מנת ליצור את אפקט האסטיגמציה הדרוש לחילוץ קואורדינטות z של כל מולקולה בודדת, מניחים עדשה תלת-ממדית עם אורך מוקד של 10 מטר לתוך הקלטת ומכניסים אותה לנתיב קרן הפליטה. כדי למזער את התנודות במהלך הדמיית אפיפלואורסצנטיות רב-צבעית רציפה, השתמש במסנני פליטה הממוקמים בגלגל מסנן מחסום המחובר ליד המיקרוסקופ.
לגילוי בו-זמני של ריבוי צבעים במהלך ניסויי FRET של מולקולה אחת, מקם ערכת מסננים נוספת במפצל פליטה. כדי להגדיר עבור דימות מוגבל דיפרציה באמצעות אפי-בעירור, תחילה להתאים את הזווית המקרית של לייזר העירור למצב epi בזרוע התאורה. לאחר מכן, יש לנתק את העדשה תלת-ממדית ולהכניס את קוביית המעקף למפצל הפליטה.
לאחר מכן, הכנס את עדשת המג להרחבת התאורה. לאחר ההגדרה, לצלם תמונות מרובות ערוצים, מחסנית z ו/או זמן שפגם של המדגם בהתבסס על התוצאות הרצויות. כדי להגדיר זיהוי מולקולה אחת צבעונית של מולקולות משותקות על פני השטח, העבר תחילה את גלגל המסנן למיקום ריק.
זה יאפשר לייזרים לעבור. לאחר מכן, התאימו את הזווית המקרית של לייזרים לזווית הדשא, והתנתקו הן מהמג והן מהעדשות תלת-מימדיות. לאחר מכן, הפעל את מצב שלושת הערוצים במפצל הפליטה על-ידי החלפת קוביית העקיפה תחילה בקוביית כיול המאפשרת לכל האור לעבור בכל הערוצים.
לאחר מכן, הפעל את המצלמה תחת DIC והתאם את הצמצם של מפצל הפליטה עד ששלושה ערוצים מופרדים לחלוטין יופיעו על המסך. סובבו את ידיות בקרת ההתאמה האנכית-אופקית במפצל הפליטה, ויישרו בערך את שלושת הערוצים. לאחר מכן, כבה את המצלמה והחלף את קוביית הכיול בקובייה המשולשת.
מניחים מדגם של חרוזים רב ערוציים 100 ננומטר. עם העירור ב-488 ננומטר, חרוזים מרובי ערוצים של 100 ננומטר פולטים אורכי גל שונים של אור, ומאפשרים יישור תלת-ערוצי. לאחר מכן, הפעל את המצלמה ואת לייזר 488 ננומטר, להתקרב על אחד חרוזים בהירים, ולבסוף ליישר את שלושת הערוצים על ידי הפיכת ידיות בקרת התאמה שוב.
עם המדגם עכשיו במקום, באמצעות לייזר חלש, לנווט לאזור עם צפיפות נקודה סבירה ולהתאים את כוח הלייזר ואת זמן החשיפה כדי להשיג אות לרעש מקובל ורמות photobleaching. לאחר מכן השתמש בתוכנת ההדמיה כדי לצלם תמונות לשגות בזמן. להדמיה ברזולוציית-על, התחילו בהכנסת העדשה תלת-ממדית והסירו את עדשת המאג.
לאחר מכן לקבוע את הזווית המקרית של לייזר העירור האופטימלי להיות זווית הדשא. על מנת למצוא את הגובה האובייקטיבי הנכון עבור הדמיית SR, השתמש בהדמיית DIC כדי למצוא את המישור האמצעי של התאים. זהה את המישור לפי הגובה שבו התאים הופכים לשקופים.
לאחר שנקבע מישור המוקד הרצוי, התחל הדמיה ברזולוציית-על. תוך כדי הדמיה, שנה את כוח הלייזר של 405 ננומטר כדי לשמור על צפיפות סבירה של כתמים מהבהבים. התחל הדמיה ללא כוח לייזר סגול.
ספור את מספר הנקודות המהבהבות בתקופה מסוימת והגדל את כוח הלייזר הסגול כך שמספר הנקודות המהבהב יישמר מעל סף ספירה המוגדר על-ידי המשתמש בשדה התצוגה. נתח את הנתונים על-ידי זיהוי centroids של כל נקודה במסגרות ההדמיה וחלץ ערכי z עבור כל נקודה מרוחב X ו- Y. בנה תמונה משוחזרת והדמי אובייקטים תלת-ממדיים.
הגדרת מיקרוסקופ זה מאפשרת מעבר גמיש ובלתי ניתן לשחזור בין שיטות הדמיה שונות, כולל הדמיה אפיפלורסנטית קונבנציונלית, הדמיה מבוססת זיהוי מולקולה אחת ברזולוציית-על וזיהוי מולקולות בודדות צבעוניות. על מנת לחשוף פרטים עדין יותר בהרכבה המולקולרית, מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר משלבת אלפי תמונות כמו זו. תמונות אלה משוחזרות לאחר מכן כדי ליצור תמונה סופית ברזולוציית-על.
טכניקות רזולוציית-על מאפשרות רזולוציה מרחבית גבוהה, ומספקות פרטים שלא ניתן לראות בטכניקות אחרות. אפשרות זו מסומנת בשתי התמונות המוצגות כאן. התמונה ברזולוציית-על מציגה את אותה רגולציה חיידקית RNase כמו תמונת האפיפלואורסצנטיות, אך מאפשרת זיהוי מולקולה בודדת.
SmFRET היא שיטה נוספת המסוגלת אנגסטרום לרזולוציית ננומטר. כאן, מולקולות RNA מקופלות תויגו בצבע תורם ירוק וצבע מקבל אדום. מסלולי עוצמת פלואורסצנטיות ניתן לחלץ ממולקולות בודדות בודדות, יצירת יעילות FRET כפונקציה של זמן.
אל תשכח כי עבודה עם לייזרים יכול להיות מסוכן, ואמצעי זהירות כגון לבישת הגנה על העיניים או הורדת כוחות לייזר תמיד צריך להילקח שבו ביצוע הליך זה.
