הכנה של explants העדשה אפיתל הותאם משיטות שמקורם במעבדה של ד&quot;ר ג&#39;ון McAvoy 9. עבודה זו ממומנת על ידי המוסד Eye Institute, תוכנית המחקר עירונית Z01-EY000238-22

חלק 1: הסרת עדשות חומרים ריאגנטים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micro-לנתח מספריים, מעוקל, טיפים בוטה, (כגון as.RS-5983, Roboz Instrument ושות כירורגי, Inc, Gaithersburg, MD); מיקרו לנתח פינצטה, קצה מעוגל (כגון Roboz # RS5137). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני השעיה: בינוני 199 המכיל 0.1% אלבומין בסרום שור, 100 יחידות / מ&quot;ל ​​לפניצילין, סטרפטומיצין 100μg/ml, 2.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​amphotericin ריאגנטים ב זמינים Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה. </li></ol> נוהל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חולדות להרדים תינוק (גילאי 2-4 ימים) בהתאם להנחיות שסופקו על ידי מכוני הבריאות הלאומיים, Bethesda, MD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את העפעפיים עם מספריים כירורגיות. לחצו בעדינות עם פינצטה מעוקל בצדדים מנוגדים של ארובת העין להכריח את העין בליטה החוצה. לעשות חתך קטן בצד האחורי של העין עם המספריים. על ידי לחיצה עם פינצטה על הצד של העין מול החתך, העדשה כמות קטנה של הגוף הזגוגי המצורפת אז יכול להיות כפוי דרך קרע, המאפשר את העדשה להיות הרים עם פינצטה מעוקל. יש להקפיד לא לשבור את הקפסולה העדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פינצטה מעוקל להעביר את העדשות אל צלחת רקמות 60mm פלסטיק תרבות המכילה 5 מ&quot;ל מדיום חם, השעיה סטרילית. </li></ol> חלק 2: Microdissection של explants חומרים ריאגנטים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלקטת הביתור Micro, טיפים 0.1 מ&quot;מ, (כגון Roboz RS-4976). אנו משתמשים סגסוגת Dumostar בגלל הגמישות של קצה, אך פלדה וסגסוגות אחרות יתקבלו אף הן. פינצטה עם עצות יותר רזה 0.1mm אינם מומלצים, כפי שהם נוטים להישבר או להתכופף במהלך הליך זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיה בינוני (ראו חלק 1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Unsupplemented F12 של חם בינוני או בינוני 199 (Invitrogen, Carlsburg, CA) </li></ol> נוהל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השלבים הבאים צריכים להתבצע סביבה נקייה, גיוס חינם באמצעות כלים לנתח סטרילית בינוני סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ סטריאו לנתח, לנקות את העדשות של רקמה כלשהי דבקות עם פינצטה קצה 0.1 מ&quot;מ ולהעבירם תרבות צלחת שנייה 60mm השעיה המכיל 5 מ&quot;ל בינוני סטרילי (שלב זה עוזר להפחית זיהום). בעזרת הפינצטה, להעביר את המספר הרצוי של עדשות לצלחת תרבות 35mm המכיל 5 מ&quot;ל בינוני סטרילי, unsupplemented. (אנו מרבים להשתמש F12 חם של (Invitrogen) של שלב זה, כי ריכוז לצבוע נמוך עושה דיסקציה קל, אולם בינוני 199 מקובלת גם לא אנטיביוטיקה או תוספות אחרות יש צורך במהלך שלב זה..) רבים כמו 12 explants יכול להתבצע במרכז צלחת בגודל כזה. עם זאת, מנה 35 מ&quot;מ אמור לשמש גם אם הם פחות explants להתבצע, כי את הכלים לנתח לא ניתן להשפיע בקלות בצלחת קטנה יותר. מעבירים את תבשיל המכיל את עדשות הנותרים תרבות רקמות החממה ב 37 מעלות צלזיוס עד שהם נחוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את הצד האחורי של העדשה. ישנן דרכים רבות להכיר זה: 1) האחורי הוא יותר עגול הקדמי, שהוא שטוח מעט; 2) עדשות עכברוש יילוד טופס קטרקט קר כפי שהם להתקרר לטמפרטורת החדר במהלך הניתוח. אם קטרקט קר לא מילא לגמרי את העדשה, הצד האחורי הוא הצד המרוחק מאזור אטום. אם אטימות מילא את העדשה, מחמם את המנה עד 37 מעלות צלזיוס במשך כמה דקות זה יהיה הפוך. הצד האחורי ניתן לזהות את הרפורמות קטרקט בקירור. 3) שרידים של Tunica vasculosa lentis יכול להיות גלוי בצד האחורי. 4) תפר אחורי יכול להיות גלוי בצד האחורי. זיהוי הצד האחורי נכונה היא חיונית, שכן זה המקום שבו הקפסולה ייפתח. פתיחת העדשה בצד הקדמי יהיה לקרוע את רקמת האפיתל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע הצד האחורי זוהה, להפוך אותו כלפי מעלה ולתפוס את העדשה ב פינצטה שמאל (לעובד ימניים). אז קמצוץ הקפסולה האחורי עם פינצטה הזכות לייצר קפל קטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד מחזיק את הקפסולה האחורי עם פינצטה הנכון, לתפוס את קפל של קפסולה עם פינצטה שמאל ולמשוך את שני זוגות פינצטה בכיוונים מנוגדים כדי להפוך דמעה קטנה הקפסולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד לתפוס את הקצה של הקפסולה retracting עם פינצטה, למשוך אותו כלפי מטה, תחילה בצד אחד, אז בצד השני, הטביע אותו בתוך הפלסטיק של המנה בפינצטה. חזור על פעולה זו מספר פעמים, נע סביב קו המשווה של העדשה, עד הקפסולה מחובר היטב בצלחת בנקודות רבות. החזקת קפסולה במקום עם פינצטה שמאל, בעדינות רוק המוני סיבים עם פינצטה הזכות לשבור את הקשר בין התאים סיבים ותאי אפיתל בקו המשווה את העדשה. ואז לדחוף את המוני סיבים משם, מגלגל אותו הקפסולה / אפיתל, אשר נשאר מחובר לתחתיתצלחת. המשך בתהליך זה עם כל עדשות בצלחת. הסר וזורקים את ההמונים סיבים (או לשמור אותם קפואים מקור חלבונים העדשה למחקרים אחרים). </li></ol> חלק 3: Microdissection והתרבות של explants המרכזי חומרים ריאגנטים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באיזמל חד פעמי סטרילי, # 15 להב, (סינסינטי כירורגי ושות סינסינטי, אוהיו) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוספט סטרילי שנאגרו מלוחים עם סידן ומגנזיום (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינוני תרבות: בינוני השעיה המכיל 100ng/ml FGF-2 (סיגמא אולדריץ, Inc סנט לואיס, מיזורי). </li></ol> נוהל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל סטרילי, לחתוך אפיתל היקפי (PE), אשר מכיל תאים בשלבים המוקדמים של בידול (איור 1A), משאיר הכיכר המרכזית 2.0mm כ בצד, המורכב מתאי אפיתל מרכזי בלבד (CE) (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את תבשיל המכיל את explants מרכזי ארון biosafety. לשטוף 3 פעמים עם PBS סטרילי המכיל סידן ומגנזיום ופעם עם 1ml של טרי בינוני, (37 ° C CO, 5% 2) equilibrated ההשעיה. אלו רוחץ לצמצם במידה ניכרת את הסיכוי לזיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2ml של המדיום תרבות להשרות התמיינות 1, והמקום explants ב humidified, בתרבית רקמה החממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. תקופות תרבות עשוי להיות קצר ככל כמה שעות או להאריך עוד שבועיים עד שלושה שבועות, בהתאם לפרמטר הנלמד. בינוני יש לשנות כל יומיים שלושה. </li></ol> חלק 4: קצירת של explants לניתוח אירועים בידול 1. Explants מסיק לניתוח של חלבון או רנ&quot;א חומרים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microdissecting פינצטה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SDS תמוגה חוצץ או RNA-בהמשך </li></ol> נוהל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתום תקופת הדגירה, להסיר את המדיום לתרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ סטריאו לנתח, לשחרר בעדינות את הקצוות של כל explant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם כל explant בפינצטה ולהעביר אותו צינור המכיל כ חיץ SDS תמוגה 100μl (לניתוח חלבונים) או RNA, לאחר מכן (לניתוח RNA). להתסיס את קצה של פינצטה בפתרון על מנת להבטיח כי explant אינו מקל על פינצטה. </li></ol> 2. Explants מסיק עבור immunofluorescence חומרים ריאגנטים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוספט שנאגרו מלוחים עם סידן ומגנזיום (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוספט שנאגרו מלוחים (ללא סידן ומגנזיום) (Invitrogen, בקרלסבד, קליפורניה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Paraformaldehyde 4% (Bioproducts בוסטון, Worcester, MA) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microdissecting פינצטה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עט סימון הידרופובי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ זכוכית שקופיות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.25% Triton X-100 ב פוספט שנאגרו מלוחים. </li></ol> נוהל: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף explants בקצרה PBS המכיל סידן ומגנזיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיקון רקמות על ידי הוספת paraformaldehyde 4% במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מקבע ולהחליף פוספט שנאגרו מלוחים. Explants קבוע להיות נוקשה למדי, ומאפשר להם להיות הרים והועברו שקופיות זכוכית immunostaining. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום טיפה קטנה של PBS (ללא סידן ומגנזיום) בשקופית כדי לסייע למקם את הרקמה ולמנוע מסתלסל. בעזרת פינצטה microdissecting, להרים את explant ו להכניס אותו לתוך הירידה בשקופית. מבלי לגעת explant, להסיר בזהירות את הנוזל עם הפתיל נייר כדי לשטח את explant על הזכוכית ולתת הרקמה יבש באוויר בטמפרטורת החדר למשך 3 עד 5 דקות. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1519/fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1 א אפיתל היקפי מבטא ספציפי בידול חלבונים. Explant הראו היה immunostained עבור N-cadherin מיד לאחר microdissection. הביטוי הוא ראה בלהקה של תאים אפיתל הפריפריה, המציין כי תאים באזור זה החלו להבחין. B. אפיתל היקפי יכול להיות trimmed ממנו להסיר תאים המבטאים N-cadherin אחרים ספציפיים בידול חלבונים. Annulus אדום מייצג את המיקום של תאים המבטאים N-cadherin, בעוד ריבוע קטן המתוארים אפור מייצג את רביע של האפיתל המוצג בלוח 1 א. האפיתל היקפי ניתן להסיר על ידי ארבעה חתכים אזמל, משאיר הכיכר המרכזית המכילה תאים בלבד טרם החלו להבחין.

<ol>
	<li>McAvoy, J. W., Chamberlain, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+(FGF)+induces+different+responses+in+lens+epithelial+cells+depending+on+its+concentration.">Fibroblast growth factor (FGF) induces different responses in lens epithelial cells depending on its concentration.</a> Development. 107 (2), 221-228 (1989).</li><li>Campbell, M. T., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+fibre+differentiation+in+cultured+rat+lens+epithelium+under+the+influence+of+neural+retina-conditioned+medium.">Onset of fibre differentiation in cultured rat lens epithelium under the influence of neural retina-conditioned medium.</a> Exp Eye Res. 39 (1), 83-94 (1984).</li><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+analysis+of+lens+epithelial+explants+induced+to+differentiate+into+fibres+by+fibroblast+growth+factor+(FGF).">Structural analysis of lens epithelial explants induced to differentiate into fibres by fibroblast growth factor (FGF).</a> Exp Eye Res. 49 (3), 479-494 (1989).</li><li>Golestaneh, N., Fan, J., Fariss, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lens+major+intrinsic+protein+(MIP)/aquaporin+0+expression+in+rat+lens+epithelia+explants+requires+fibroblast+growth+factor-induced+ERK+and+JNK+signaling.">Lens major intrinsic protein (MIP)/aquaporin 0 expression in rat lens epithelia explants requires fibroblast growth factor-induced ERK and JNK signaling.</a> J Biol Chem. 279 (30), 31813-31822 (2004).</li><li>Saravanamuthu, S. S., Gao, C. Y., Zelenka, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+is+required+for+lateral+induction+of+Jagged1+during+FGF-induced+lens+fiber+differentiation.">Notch signaling is required for lateral induction of Jagged1 during FGF-induced lens fiber differentiation.</a> Dev Biol. 332 (1), 166-176 (2009).</li><li>Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF-induced+lens+cell+proliferation+and+differentiation+is+dependent+on+MAPK+(ERK1/2)+signalling.">FGF-induced lens cell proliferation and differentiation is dependent on MAPK (ERK1/2) signalling.</a> Development. 128 (24), 5075-5084 (2001).</li><li>Dirks, R. P., Kraft, H. J., Van Genesen, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cooperation+between+two+silencers+creates+an+enhancer+element+that+controls+both+the+lens-preferred+and+the+differentiation+stage-specific+expression+of+the+rat+beta+B2-crystallin+gene.">The cooperation between two silencers creates an enhancer element that controls both the lens-preferred and the differentiation stage-specific expression of the rat beta B2-crystallin gene.</a> Eur J Biochem. 239 (1), 23-32 (1996).</li><li>Yang, Y., Stopka, T., Golestaneh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+alphaA-crystallin+via+Pax6,+c-Maf,+CREB+and+a+broad+domain+of+lens-specific+chromatin.">Regulation of alphaA-crystallin via Pax6, c-Maf, CREB and a broad domain of lens-specific chromatin.</a> The EMBO journal. 25 (10), 2107-2118 (2006).</li><li>McAvoy, J. W., T, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+retinas+promote+cell+division+and+fibre+differentiation+in+lens+epithelial+explants.">Neural retinas promote cell division and fibre differentiation in lens epithelial explants.</a> Curr Eye Res. 3 (6), 827-834 (1984).</li></ol>

העדשה עכברוש מערכת explant שימש בהצלחה על ידי מספר מעבדות מחקר בידול הטרמינל של תאים אפיתל העדשה לסיבי העדשה 21,3,4,5. כאשר נחשף FGF-2 ב 100ng/ml explants יתחיל להראות שינויים איתות בתוך 6 דקות, עם שינויים במורפולוגיה ועל ביטוי גנים המופיעים ברצף במשך כמה ימים 3,4,5. תרבויות נשארים קיימא עבור 2-3 שבועות אם הטיפול נלקח על מנת למנוע זיהום. Explants המרכזי המתואר פרוטוקול זה שימושי במיוחד עבור לומדים את רצף האירועים הקשורים הבחנה, מכיוון שהם מכילים מעט אם בכלל תאים המבטאים סמנים בידול לפני FGF-2 הוא הוסיף 1,5. התאים אז להבדיל סינכרוני, כמו במדגם, כך שניתן לעקוב אחר מהלך הזמן של איתות תעתיק אירועים הקשורים בידול. Explants culturing עבור זמן שונים ובכך מספק מידע מדויק על זמני רצף האירועים. מעכבי ספציפיים ניתן להוסיף בינוני התרבות לזהות איתות המסלולים הרלוונטיים. Explants ניתן להשתמש כדי לנתח את ביטוי החלבון על ידי אלקטרופורזה בג&#39;ל SDS ו immunoblotting או לנתח את הביטוי של mRNAs ספציפי על ידי RT-PCR. התשואות חלבון בטווח 20-50 מיקרוגרם / explant ואת התשואה RNA הוא כ 200-600 ng / explant, בהתאם לאורך התקופה והתרבות. בדרך כלל אנחנו מוצאים 5-6 explants לכל צלחת תספק מספיק חלבון או רנ&quot;א עבור מבחני מספר. RNA מן explants יכול לשמש גם כדי להכין cDNA להערכת ביטוי גנים על ידי ניתוח microarray, אשר יכול לזהות גנים הרומן הזה יכול להיות קריטי עבור בידול. Explants יכול להיות גם transfected. למרות היעילות transfection הוא בדרך כלל נמוך, זה מספיק עבור assaying גנים כתב 4, 7, 8. מיקרוסקופיה immunofluorescence של explants מספק נלווה שימושי בשיטות ביוכימיות על ידי קביעת מיקום subcellular של חלבונים של עניין. לפיכך, הכנת והתרבות של explants העדשה עכברוש מספק מערכת רבת עוצמה ללימוד העדשה בידול מסוף ביונקים, אשר יכול להשלים בטכניקות vivo, כמו הדור של העכברים הטרנסגניים ו עקום החוצה.

preparation and culture of rat lens epithelial explants for studying terminal differentiation

המשטח הקדמי של עדשת העין מכוסה בשכבה של תאים אפיתל, אשר מתרבים באזור טבעתי שבבסיס גוף ריסי. בעקבות החלוקה, תאים אלו נודדים בדיעבד, שם FGF לשדר מן הרשתית גורמת להם להתמיין למגוון האחורי של סיבים מאורכים תאים העדשה, אשר מהווים את חלק הארי של העדשה. התמיינות של תאים אפיתל העדשה לתוך סיבי העדשה יכול להיגרם על ידי במבחנה explants culturing האזור המרכזי של האפיתל הקדמית בנוכחות של FGF-2. Explants מוכנים מן העדשות של חולדות הילוד על ידי הסרת העדשות מהעין ו לתפוס את הקפסולה העדשה בצד האחורי עם פינצטה לנתח. קפסולה אחורית אז הוא נקרע בעדינות לפתוח ולחצתי לתחתית צלחת פלסטיק של תרבית רקמה. אזורי הפריפריה של explant מוסרים עם אזמל והאזור המרכזי בתרבית ואז בנוכחות 100ng/ml FGF-2 עוד 2-3 שבועות, תלוי בפרמטרים כדי להיחקר. מכיוון שתאי האפיתל explants תרבותי להבחין בתיאום המשוער לאורך תקופה של ימים עד שבועות, במהלך תקופה של איתות ביטוי גנים ניתן לקבוע תוך שימוש בטכניקות מולקולריות, ביוכימיות, וגם תרופתי. מיקרוסקופיה immunofluorescence הוא נספח חזק בשיטות אלה כפי שהוא מדגים את subcellular לוקליזציה של חלבונים עניין יכול לחשוף את ההשלכות הפיזיולוגיות של מניפולציות ניסיוני של מסלולי איתות.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation at JoVE.com

Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

Explants האזור המרכזי של עכברוש העדשה epithelia להבדיל סינכרוני כאשר בתרבית בנוכחות של FGF-2. מיקרוסקופיה immunofluorescence של תרבויות כאלה יכולים מספק מידע רומן על ביטוי גנים ואירועים איתות הקשורים בידול סופנית.

הכנה והתרבות של עדשה Explants עכברוש אפיתל ללימוד בידול Terminal

The anterior surface of the ocular lens is covered by a monolayer of epithelial cells, which proliferate in an annular zone underlying the ciliary body.  ...

preparation-culture-rat-lens-epithelial-explants-for-studying

Research

JoVE Journal

Biology

12.6K Views.  National Eye Institute (NEI), National Institutes of Health (NIH). Explants האזור המרכזי של עכברוש העדשה epithelia להבדיל סינכרוני כאשר בתרבית בנוכחות של FGF-2. מיקרוסקופיה immunofluorescence של תרבויות כאלה יכולים מספק מידע רומן על ביטוי גנים ואירועים איתות הקשורים בידול סופנית.

Video: Preparation and Culture of Rat Lens Epithelial Explants for Studying Terminal Differentiation

Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, organotypic slice cultures allow one to perform a number of manipulations that are not presently feasible in-vivo. To date, organtotypic embryonic brain slice cultures have been used to follow individual cells using time-lapse microscopy, manipulate the expression of genes in the ganglionic emanances (a region that is hard to target by in-utero electroporation), as well as for pharmacological studies. In this video protocol we demonstrate how to make organotypic slice cultures from rat embryonic day 18 embryos. The protocol involves dissecting the embryos, embedding them on ice in low melt agarose, slicing the embedded brains on the vibratome, and finally plating the slices onto filters in culture dishes. This protocol is also applicable in its present form to making organotypic slice cultures from different embryonic ages for both rats and mice. 

פורסים תרבות Organotypic של E18 מוח החולדה

Organotypic slice cultures from embryonic rodent brains are widely used to study brain development. While there are often advantages to an in-vivo system, ...

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed protocol for biolistic transfection of rat hippocampal slices, from the initial preparation of DNA coated bullets to the final shooting of the organotypic slice cultures using a gene gun. Gene gun transfection is an efficient and easy means of transfecting neurons and is especially useful for fluorescently labeling a small subset of cells in tissue slice. In this video, we first outline the steps required to coat gold particles with DNA. We next demonstrate how to line the inside of plastic tubing with the gold/DNA bullets, and how to cut this tubing to obtain the plastic cartridges for loading into the gene gun. Finally, we perform biolistic transfection of rat hippocampal slice cultures, demonstrating handling of the Bio-Rad Helios gene gun, and offering trouble shooting advice to obtain healthy and optimally transfected tissue slices.  

We describe a method for preparing DNA coated gold bullets and demonstrate the use of such bullets to biolistically transfect neurons in cultured hippocampal slices.

הכנת כדורי אקדח ין transfection Biolistic של נוירונים תרבות Slice

Biolistic transfection is a physical means of transfecting cells by bombarding tissue with high velocity DNA coated particles. We provide a detailed ...

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

ראשי תאים אנושיים אפיתל הסימפונות גדלה מ Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Preparation of Rat Tail Tendons for Biomechanical and Mechanobiological Studies

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working with those tissues is challenging because they are very fragile, and until now there was no rigorously detailed protocol for their isolation.
Faced with these challenges, we have developed methods and instruments to facilitate manipulation of RTTs and control tissue viability, sterility and integrity. This article describes the experimental procedures used to prepare RTTs for biomechanical and mechanobiological studies. Our work is divided into four main steps: extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.
At each step, all procedures, materials and manipulations are presented in detail so that they can be easily reproduced. Moreover, the specific instruments developed are presented: a manipulation plate used to segregate RTTs, an optic micrometer to position the tissue during the cross-sectional area measurement and an anchoring system to attach the RTTs onto a bioreactor.
Finally, we describe the results obtained after multiple tests to validate our methods. The viability, sterility and integrity evaluations demonstrate that our procedures are sufficiently rigorous for manipulations of fragile tissues such as rat tail tendons.

This article describes the experimental procedures used to prepare rat tail tendons for biomechanical and mechanobiological studies. Several features of the main steps in preparation are demonstrated, beginning with extraction, cross-sectional area measurement, rinsing and loading into the bioreactor chamber.

הכנת הגידים זנב עכברוש ללימודי biomechanical ו Mechanobiological

Rat tail tendons (RTTs) are a common biological model used in experimental in vitro studies in the fields of tendon physiology and tendinopathy. Working ...

A System for Culturing Iris Pigment Epithelial Cells to Study Lens Regeneration in Newt

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, heart, the jaw 1. Specifically, newts are unique for its lens regeneration capability. Upon lens removal, IPE cells of the dorsal iris transdifferentiate to lens cells and eventually form a new lens in about a month 2,3. This property of regeneration is never exhibited by the ventral iris cells. The regeneration potential of the iris cells can be studied by making transplants of the in vitro cultured IPE cells. For the culture, the dorsal and ventral iris cells are first isolated from the eye and cultured separately for a time period of 2 weeks (Figure 1). These cultured cells are reaggregated and implanted back to the newt eye. Past studies have shown that the dorsal reaggregate maintains its lens forming capacity whereas the ventral aggregate does not form a lens, recapitulating, thus the in vivo process (Figure 2) 4,5. This system of determining regeneration potential of dorsal and ventral iris cells is very useful in studying the role of genes and proteins involved in lens regeneration.

In newt, the lens regenerates always from the dorsal iris by transdifferentiation of the iris pigmented epithelial cells (IPEs). Here we describe a procedure to culture dorsal and ventral newt IPE cells and their implantation to the newt eye. The implanted cells are then studied by tissue sectioning and immunohistochemistry.

מערכת culturing איריס תאים פיגמנט אפיתל לחקר התחדשות עדשה של ניוט

Salamanders like newt and axolotl possess the ability to regenerate many of its lost body parts such as limbs, the tail with spinal cord, eye, brain, ...

A Novel Method for the Culture and Polarized Stimulation of Human Intestinal Mucosa Explants

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper homeostasis directly depends on these interactions, as they shape an entire immunological response inducing tolerance against food antigens while at the same time mounting effective immune responses against pathogenic microbes accidentally ingested with food.
Intestinal homeostasis is preserved also through various complex interactions between the microbiota (including food-associated beneficial bacterial strains) and the host, that regulate the attachment/degradation of mucus, the production of antimicrobial peptides by the epithelial barrier, and the "education" of epithelial cells' that controls the tolerogenic or immunogenic phenotype of unique, gut-resident lymphoid cells' populations. These interactions have been so far very difficult to reproduce with in vitro assays using either cultured cell lines or peripheral blood mononuclear cells. In addition, mouse models differ substantially in components of the intestinal mucosa (mucus layer organization, commensal bacteria community) with respect to the human gut. Thus, studies of a variety of treatments to be brought in the clinics for important stress-related or pathological conditions such as irritable bowel syndrome, inflammatory bowel disease or colorectal cancer have been difficult to carry out.
To address these issues, we developed a novel system that enables us to stimulate explants of human intestinal mucosa that retain their in situ conditioning by the host microbiota and immune response, in a polarized fashion. Polarized apical stimulation is of great importance for the outcome of the elicited immune response. It has been repeatedly shown that the same stimuli can produce completely different responses when they bypass the apical face of the intestinal epithelium, stimulating epithelial cells basolaterally or coming into direct contact with lamina propria components, switching the phenotype from tolerogenic to immunogenic and causing unnecessary and excessive inflammation in the area.
We achieved polarized stimulation by gluing a cave cylinder which delimited the area of stimulation on the apical face of the mucosa as will be described in the protocol. We used this model to examine, among others, differential effects of three different Lactobacilli strains. We show that this model system is very powerful to assess the immunomodulatory properties of probiotics in healthy and disease conditions.

We introduce a novel method for the maintenance of human intestinal mucosa in culture and monitoring of the response to various types of stimuli over at least 24 hrs. With our method, the polarity of the tissue is maintained, allowing for a physiological stimulation via the apical route.

שיטה חדשה לתרבות והמקוטבת גירוי של רירית המעי Explants אדם

Few models currently exist to realistically simulate the complex human intestine's micro-environment, where a variety of interactions take place. Proper ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

הכנת סרום העכברוש מתאים לתרבות עובר שלמה יונקים

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

ללא עדשה מיקרוסקופ וידאו עבור הדינמיקה וניתוח כמותי של תרבית תאים חסיד

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Isolation, Purification, and Differentiation of Osteoclast Precursors from Rat Bone Marrow

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or macrophage precursors. Excessive bone resorption is one the most significant cellular mechanisms leading to osteolytic diseases, including osteoporosis, periodontitis, and periprosthetic osteolysis. The main physiological function of osteoclasts is to absorb both the hydroxyapatite mineral component and the organic matrix of bone, generating the characteristic resorption appearance on the surface of bones. There are relatively few osteoclasts compared to other cells in the body, especially in adult bones. Recent studies have focused on how to obtain more mature osteoclasts in less time, which has always been a problem. Several improvements in the isolation and culture techniques have developed in laboratories in order to obtain more mature osteoclasts. Here, we introduce a method that isolates bone marrow in less time and with less effort compared to the traditional procedure, using a special and simple device. With the use of density gradient centrifugation, we obtain large amounts of fully differentiated osteoclasts from rat bone marrow, which are identified by classical methods.

Osteoclasts are tissue-specific macrophage polykaryons derived from the monocyte-macrophage lineage of hematopoietic stem cells. This protocol describes how to isolate bone marrow cells so that large quantities of osteoclasts are obtained while reducing the risk of accidents found in traditional methods.

בידוד, טיהור, והבידול של אוסטאוקלסט מקדים של מח עצם חולדה

Osteoclasts are large, multinucleated, and bone-resorbing cells of the monocyte-macrophage lineage that are formed by the fusion of monocytes or ...

Isolation and Enrichment of Human Lung Epithelial Progenitor Cells for Organoid Culture

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, epithelial progenitor cells can self-renew and generate differentiating progeny that exhibit cellular functions similar to those of their in vivo counterparts. Herein we describe a step-by-step protocol to isolate region-specific progenitors from human lung and generate 3D organoid cultures as an experimental and validation tool. We define proximal and distal regions of the lung with the goal of isolating region-specific progenitor cells. We utilized a combination of enzymatic and mechanical dissociation to isolate total cells from the lung and trachea. Specific progenitor cells were then fractionated from the proximal or distal origin cells using fluorescence associated cell sorting (FACS) based on cell type-specific surface markers, such as NGFR&#160;for sorting basal cells and HTII-280 for sorting alveolar type II cells. Isolated basal or alveolar type II progenitors were used to generate 3D organoid cultures. Both distal and proximal progenitors formed organoids with a colony forming efficiency of 9-13% in distal region and 7-10% in proximal region when plated 5000 cell/well on day 30. Distal organoids maintained HTII-280+ alveolar type II cells in culture whereas proximal organoids differentiated into ciliated and secretory cells by day 30. These 3D organoid cultures can be used as an experimental tool for studying the cell biology of lung epithelium and epithelial mesenchymal interactions, as well as for the development and validation of therapeutic strategies targeting epithelial dysfunction in a disease.

This article provides a detailed methodology for tissue dissociation and cellular fractionation approaches allowing enrichment of viable epithelial cells from proximal and distal regions of the human lung. Herein these approaches are applied for the functional analysis of lung epithelial progenitor cells through the use of 3D organoids culture models.

בידוד והעשרה של תאי אב אפיתל הריאה האנושיים לתרבית אורגנואידית

Epithelial organoid models serve as valuable tools to study the basic biology of an organ system and for disease modeling. When grown as organoids, ...