We thank Mr. Hajime Ichijo for video recording and helpful advice concerning editing the video. We also thank the Osumi lab members for animal care. This work is supported by a Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Area, Neural Diversity and Neocortical Organization, from MEXT of Japan (to N. O.). T. K. was supported by a Research Fellowship of JSPS for Young Scientists.

הערה: ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם למכונים הלאומיים לבריאות מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה. הוועדה לניסויים בבעלי החיים של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת טוהוקו אישרה את הליכי הניסוי שתוארו במסמך זה. 1. ההרדמה וLaparotomy <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאיסוף דם, להשתמש בחולדות הפתוגן ללא ספציפיות זכר ספראג-Dawley. לצום חולדות לפחות 18 שעה תוך מתן מים. השתמש בחולדות מגדל זכר פרשו ב6-8 חודשים של גיל (550-650 ז) לאיסוף דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לזרום 2.5-4.0 isoflurane%, שהוא חומר הרדמה שאיפה, לתיבה מחוברת למנגנון הרדמה להציג את ההרדמה ב2.0-3.5 ליטר / דקה ל10 דקות. העבר את החולדות לתוך התיבה להציג את ההרדמה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאשר הרדמה על ידי סימון על האובדן של התגובה לגירוי בכפות עם מלקחיים. כסה את האף של wi החולדותה מסכה מחוברת למנגנון הרדמה כדי להרדים עמוק החולדות במהלך איסוף דם. הריכוז והזרימה נשמרים ב2.5-4.0% ו2.0-3.5 ליטר / דקה, בהתאמה. הערה: אין להשתמש בHalothane עבור הרדמה משאיפת כי עוברים בתרבית בסרום שנאסף מהחולדות מורדמים עם תערוכה מגיב זה עיכוב בהתפתחות עוברית בהשוואה לעוברים בתרבית בסרום המתקבל מחולדות מורדמים עם isoflurane 22. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע זיהום של הפרווה, לחטא את העור על ידי שפיכת 70% אתנול על הבטן של החולדה המורדמת. להרים את עור חיטוי ודופן בטן באזור התחתון עם זוג המלקחיים ולחתוך השכבות הללו בו זמנית לכיוון אזור בית החזה עם זוג מספריים גדול כדי לחשוף את האיברים הפנימיים. משקף את המעיים מחוץ לחלל הבטן עם זוג המלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את העור ודופן בטן לכיוון הגפיים האחורי עםזוג מספריים גדול כדי לחשוף עוד יותר את אזור הבטן האחורי. משקף את השומן המיותר מחוץ לחלל הבטן עם זוג המלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים את השומן הקרביים על קו האמצע באמצעות שני זוגות מלקחיים ולפצל את השומן בזהירות בכיוון מקביל לחשוף את אב העורקים בבטן. חזור על הליך זה לפצל את השומן הקרביים בכיוון אורך כדי לזהות את הסתעפות של אב העורקים בבטן בקלות. בנוסף, אב העורקים הוא pulsatile וניתן להבחין מהווריד הנבוב הסמוך באמצעות מאפיין זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים את השומן סביב אב העורקים בבטן וההסתעפות בזהירות עם שני זוגות מלקחיים ולהפריד את השומן באב העורקים בבטן. </li></ol> 2. איסוף דם <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להכניס את קצה מחט 21 G מחוברת למזרק 20 מיליליטר מייד גולגולת להסתעפות של אב העורקים, עם השיפוע בכיוון מטה. החזק את המזרק עם אחדשני, ולמשוך את המזרק באיטיות כדי לאסוף 15 מיליליטר של דם מעכברים ממין זכר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המחט מהמזרק, ושופך את הדם לתוך שני צינורות קרים כקרח 10 מ&quot;ל סטרילי בדיקה (איור 1 א). שמור צינורות על קרח עד צנטריפוגה כדי לעכב את היווצרות של קריש הדם. צמצם את זמן צנטריפוגה ידי צנטריפוגה כמה צינורות בפעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכברוש הרדים על ידי פתיחת בית החזה וחתכתי את הלב או עריפת הראש. </li></ol> 3. עכברוש סרום הכנה <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דם שנאסף במשך 5 דקות ב1,200 XG וטמפרטורת חדר (RT) על מנת להפריד בין הדם לשכבות העליונות ותחתונות (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הצינורות ב C ° 4 ל1.5-2 שעות כדי לתקן את קריש הפיברין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרים את קריש הפיברין בשכבה העליונה בעזרת זוג מלקחיים מעוקלים, ולסחוט את קריש הפיברין להפריד את הסרום. לאחר מכן, לחץ על קריש הפיברין עם המלקחיים המעוקלים מול מטלותwnwards ליד הממשק בין שתי השכבות (איור 1D). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 3.3 לנתק את קריש הפיברין נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מבחנות במשך 5 דקות ב1,200 XG וRT (איור 1E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר בזהירות את הסרום לתוך צינור סטרילי 15 מיליליטר באמצעות פיפטה סטרילית בזרימת אוויר למינרית קבינט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה סרום העכברוש שנאסף במשך 5 דקות ב1,200 XG וRT כדי להסיר את כל תאים אדומים שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בריכה בסרום בזהירות לתוך 15 מיליליטר חדש מעוקר צינור באמצעות פיפטה סטרילית כדי למנוע זיהום על ידי תאים אדומים שיורית בחלק התחתון של הצינור (איור 1F). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה בסרום באמבט מים ב C ° 56 ל30 דקות כדי להשבית מערכת המשלימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקרר את הצינורות של סרום חולדה לRT בזרימת אוויר למינרית הקבינט. הסרום צריך להיות aliquoted ל10 מיליליטר בצינורות סטרילי בודדים. אחסן את הצינורות ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש (איור 1H). </li></ol>

<ol>
	<li>New, D. A. T., Copp, A. J., Cockroft, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction.">Introduction.</a> Mammalian Postimplantation Embryos. A Practical Approach. , 1-14 (1990).</li><li>Eto, K., Takakubo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+development+of+rat+embryos+in+culture+during+the+period+of+craniofacial+morphogenesis.">Improved development of rat embryos in culture during the period of craniofacial morphogenesis.</a> J Craniofac Genet Dev Biol. 5, 351-355 (1985).</li><li>Takahashi, M., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+method+of+rodent+whole+embryo+culture+using+the+rotator-type+bottle+culture+system.">The method of rodent whole embryo culture using the rotator-type bottle culture system.</a> J Vis Exp. (42), e2170 (2010).</li><li>New, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+embryo+culture,+teratogenesis,+and+the+estimation+of+teratologic+risk.">Whole embryo culture, teratogenesis, and the estimation of teratologic risk.</a> Teratology. 42, 635-642 (1990).</li><li>Matsuo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+in+the+Pax-6+gene+in+rat+small+eye+is+associated+with+impaired+migration+of+midbrain+crest+cells.">A mutation in the Pax-6 gene in rat small eye is associated with impaired migration of midbrain crest cells.</a> Nat Genet. 3, 299-304 (1993).</li><li>Nomura, T., Holmberg, J., Frisen, J., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6-dependent+boundary+defines+alignment+of+migrating+olfactory+cortex+neurons+via+the+repulsive+activity+of+ephrin+A5.">Pax6-dependent boundary defines alignment of migrating olfactory cortex neurons via the repulsive activity of ephrin A5.</a> Development. 133, 1335-1345 (2006).</li><li>Yamamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nodal+antagonists+regulate+formation+of+the+anteroposterior+axis+of+the+mouse+embryo.">Nodal antagonists regulate formation of the anteroposterior axis of the mouse embryo.</a> Nature. 428, 387-392 (2004).</li><li>Inoue, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+cadherins+in+maintaining+the+compartment+boundary+between+the+cortex+and+striatum+during+development.">Role of cadherins in maintaining the compartment boundary between the cortex and striatum during development.</a> Development. 128, 561-569 (2001).</li><li>Takahashi, M., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax6+regulates+specification+of+ventral+neurone+subtypes+in+the+hindbrain+by+establishing+progenitor+domains.">Pax6 regulates specification of ventral neurone subtypes in the hindbrain by establishing progenitor domains.</a> Development. 129, 1327-1338 (2002).</li><li>Calegari, F., Haubensak, W., Yang, D., Huttner, W. B., Buchholz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+RNA+interference+in+postimplantation+mouse+embryos+with+endoribonuclease-prepared+short+interfering+RNA.">Tissue-specific RNA interference in postimplantation mouse embryos with endoribonuclease-prepared short interfering RNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14236-14240 (2002).</li><li>Takahashi, M., Nomura, T., Osumi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferring+genes+into+cultured+mammalian+embryos+by+electroporation.">Transferring genes into cultured mammalian embryos by electroporation.</a> Dev Growth Differ. 50, 485-497 (2008).</li><li>Pryor, S. E., Massa, V., Savery, D., Greene, N. D., Copp, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergent+extension+analysis+in+mouse+whole+embryo+culture.">Convergent extension analysis in mouse whole embryo culture.</a> Methods Mol Biol. 839, 133-146 (2012).</li><li>Kikkawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dmrta1+regulates+proneural+gene+expression+downstream+of+Pax6+in+the+mammalian+telencephalon.">Dmrta1 regulates proneural gene expression downstream of Pax6 in the mammalian telencephalon.</a> Genes Cells. 18, 636-649 (2013).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li><li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8.">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294, 1071-1074 (2001).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Turnbull, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+backscatter+microscopy+of+mouse+embryos.">Ultrasound backscatter microscopy of mouse embryos.</a> Methods Mol Biol. 135, 235-243 (2000).</li><li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-guided+microinjection+into+the+mouse+forebrain+in+utero+at+E9.5.">Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5.</a> J Vis Exp. (45), e2047 (2010).</li><li>Quinlan, G. A., Khoo, P. L., Wong, N., Trainor, P. A., Tam, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+grafting+and+labeling+in+postimplantation+mouse+embryos.">Cell grafting and labeling in postimplantation mouse embryos.</a> Methods Mol Biol. 461, 47-70 (2008).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R., Nagy, A., Gertsenstein, M., Vinterstein, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roller+culture+of+postimplantation+embryos.">Roller culture of postimplantation embryos.</a> Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , 237-241 (2003).</li><li>Garcia, M. D., Udan, R. S., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+rat+serum+for+culturing+mouse+embryos.">Preparation of rat serum for culturing mouse embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011, 391-393 (2011).</li><li>Brown-Woodman, P. D., Ritchie, H. E., Korabelnikoff, A., Emmanuel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replacement+of+ether+with+alternate+volatile+anesthetics+for+collection+of+rat+serum+used+in+embryo+culture.">Replacement of ether with alternate volatile anesthetics for collection of rat serum used in embryo culture.</a> Toxicol In Vitro. 18, 719-724 (2004).</li><li>Gray, J., Ross, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+tube+closure+in+mouse+whole+embryo+culture.">Neural tube closure in mouse whole embryo culture.</a> J Vis Exp. (56), e3132 (2011).</li><li>Machado, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstruction+of+phrenic+neuron+identity+in+embryonic+stem+cell-derived+motor+neurons.">Reconstruction of phrenic neuron identity in embryonic stem cell-derived motor neurons.</a> Development. 141, 784-794 (2014).</li><li>Glanville-Jones, H. C., Woo, N., Arkell, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+whole+embryo+culture+with+commercially+available+reagents.">Successful whole embryo culture with commercially available reagents.</a> Int J Dev Biol. 57, 61-67 (2013).</li><li>Ornoy, A., Yacobi, S., Yaffee, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+of+culture+of+11.5-day-old+rat+embryos+in+DMEM/F12+and+20%+fetal+bovine+serum.">A simple method of culture of 11.5-day-old rat embryos in DMEM/F12 and 20% fetal bovine serum.</a> J Anat. 203, 419-423 (2003).</li><li>Moore-Scott, B. A., Gordon, J., Blackburn, C. C., Condie, B. G., Manley, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+serum-free+in+vitro+culture+technique+for+midgestation+mouse+embryos.">New serum-free in vitro culture technique for midgestation mouse embryos.</a> Genesis. 35, 164-168 (2003).</li><li>Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Embryonic+Development+in+a+Serum-free+Whole+Embryo+Culture+System.">Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System.</a> J Vis Exp. (85), e50308 (2014).</li></ol>

No conflicts of interest are declared.

תוצאות לשחזור בניסויי WEC תלויות בשימוש בסרום באיכות גבוהה IC חולדה וטכניקה לנתיחה עובר מדויק 3. לא לקצר את תקופת צום לפני איסוף דם בגלל הצום יש צורך לתקנן ריכוזי הגלוקוז בדם. אין להשתמש בחולדות נקבות להכנת הסרום כי רמות הורמונים משתנות אצל בעלי חיים נקבה על פי מחז...

מגוון רחב של בעלי חיים משמשים מודל בביולוגיה התפתחותית לחקור מנגנוני התפתחות ברמות מולקולריות ותאיות. לדוגמא, מין דו חיים ועופות היה בשימוש נרחב כמו חיות מודל קלאסיות המתאימים למניפולציה ישירה של עוברים, כי העוברים האלה להתפתח מחוץ של האם. בניגוד לבעלי חיים אלה, עוברי יונקים גדלים ברחמה של האם, וצמיחה בשלבים מאוחר יותר היא מכריע תלויה בתפקוד של הרחם. לכן, קשה בדרך כלל כדי לתפעל ישירות עוברי יונקים כגון אלה מהעכבר והחולדה בשלבים מוקדמים. ב 1960s, דניס החדש הוקם תרבות עובר כל יונקים טכניקה (WEC) באמצעות מנגנוני WEC עם אספקת חמצן רציפה ובקרת חום 1. בWEC, עוברי עכבר וחולדה יכולים לגדול vivo לשעבר, (כלומר, מחוץ לרחם). למרות טכניקת WEC שימשה לעתים קרובות בטרטולוגיה ידי הוספת chemic השוניםאל תרכובות לתוך מדיום התרבות, טכניקה זו שימשה גם במחקרים בביולוגיה התפתחותית שונים לבחון מנגנוני התפתחות ייחודיים ביונקים 2-4. לדוגמא, WEC הוא בשילוב עם טכניקות אחרות, כגון תיוג תא, בעוברי wild-type ו מוטציה באמצעות צבע פלואורסצנטי 5, תא השתלה 6, והכנסת גן באמצעות lipofection 7 וelectroporation 8-13. לאחרונה, במניפולציה ברחם כבר בשימוש כדי לנתח תהליכים התפתחותיים בעוברי מכרסמים בשלבים מאוחר יותר וכבר בשילוב עם טכניקות electroporation 14-16. עם זאת, שיטות אלו אינן מתאימות למניפולציה של עוברי postimplantation וmidgestation בשל קשיי השגת הזרקה מקומית מדויקת של פתרון ה-DNA לעוברי בשלבים המוקדמים. למרות שהשתלת תאי אולטרסאונד מונחה והזרקה של וקטורים ויראליים לעוברי מוקדמים (כלומר, דווח E8.5-E-9.5 בעכבר) ברחם בעבר 17,18, כישורים מעולים נדרשים לבצע ניסויים אלה עם שיעור הצלחה גבוה. לכן, יש WEC עם נגישות גבוהה vivo לשעבר יתרונות ביחס למניפולציה של עוברי עכבר וחולדה. סרום החולדה centrifuged מייד (IC) שהוכן מחולדות זכרים משמש לעתים קרובות למדיום WEC. כשהם עוברים בתרבית בשלב postimplantation (כלומר, מוקדם יותר מאשר E8.0 בעכבר או E10.0 בחולדה), תערובת של מדיום סינטטי וסרום עכברוש IC משמש לעתים קרובות כאמצעי לWEC 19. עם זאת, לעוברי תרבות באמצע ההריון (כלומר., E8.0-12.5 בעוברי עכבר או E10.0-E14.5 בעוברי עכברים), יש להשתמש בסרום 100% כמדיום כי אף מדיה חלופית זמינה כרגע מאפשרת עוברים לגדול בדרך כלל במבחנה במשך יותר מ 2 ימים. הכנת סרום עכברים באיכות גבוהה היאצעד קריטי להשגת שחזור בניסויי WEC. בהשוואה לצנטריפוגה מתעכבת, IC יש את היתרון של הפחתת המוליזה כאשר הסרום נאסף על ידי סחיטת קריש הפיברין כי רוב תאי הדם האדומים כבר הופרדו מקריש הפיברין. כסרום חולדה המוליטית לא מצליח לתמוך בצמיחה התקינה של עוברי חולדה ועכבר, הכנת הסרום באמצעות צנטריפוגה המיידית עדיפה להכנה באמצעות צנטריפוגה מתעכבת. הפרוטוקול שלנו מכיל בהשוואה לפרוטוקולים אחרים שני צעדים נוספים 18-20 (כלומר., אחסון הדם שנאסף על קרח לפני צנטריפוגה הראשונה ושמירה על דגימות דם שנאספו במשך שעה 2 על 4 מעלות צלזיוס לאחר צנטריפוגה הראשונה). הצעד לשעבר יכול לעכב את היווצרותם של קרישי הדם, והצעד האחרון מקדם את ההתמצקות של קריש הפיברין לסחיטה קלה. לכן, הפרוטוקול שלנו יכול להיות בשימוש על ידי מתחילים. עם זאת, איסוף דם להפקה או לסרוםמיצוי מדויק על ידי פשוט מתייחס לספרי פרוטוקול קשה מאוד 19-21. במאמר זה וידאו, אנחנו מדגימים הפרוטוקול הסטנדרטי שלנו להכנת סרום האופטימלי IC חולדה, הכולל איסוף דם מאב העורקים בבטן של חולדות וחילוץ של הסרום על ידי צנטריפוגה גבריות.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott</td><td>B506</td><td>For rat anesthesia.</td></tr><tr><td>Large scissors</td><td>Napox</td><td>B-7H</td><td>Stelized scissors for cutting the skin and muscle of rats.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Napox</td><td>A-3-2</td><td>Stelized forceps for picking up the skin of rats and squeezing the fibrin clot.</td></tr><tr><td>Sprague-Dawley (SD) rat</td><td>Charles Rivers Laboratories</td><td></td><td>Retired male rats from colony in the lab or purchased retired male rats.</td></tr><tr><td>Syringe (20 ml)</td><td>TERUMO</td><td>SS-29ESZ</td><td></td></tr><tr><td>Needle (21 G x 5/8&quot;)</td><td>TERUMO</td><td>NN-2116R</td><td></td></tr><tr><td>Sterile test (spitz) tube (10 ml)</td><td>ASIAKIZAI</td><td>1101C000B-10</td><td>For collection of boold</td></tr><tr><td>Sterile disposable pipette</td><td>Eiken Chemical</td><td>CD2000 No.4</td><td></td></tr><tr><td>Sterilie disposable tube (15 ml)&amp;nbsp;</td><td>Falcon</td><td>2196</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

איור 1 מציג תוצאות נציג של ההליכים המתוארים להפרדת תאי דם ובסרום. אנחנו בדרך כלל להשיג 15 מיליליטר של דם מעכברוש בדימוס גברי (איור 1 א). על ידי צנטריפוגה, הדם שנאסף ניתן להפריד לשכבה עליונה המכילה סרום וקריש הפיברין, אשר מצוינים עם חץ, ושכבה תחתונה המכי?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture at JoVE.com

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

הכנת סרום העכברוש מתאים לתרבות עובר שלמה יונקים

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for ...

preparation-of-rat-serum-suitable-for-mammalian-whole-embryo-culture

Research

JoVE Journal

Biology

13.8K Views.  Jichi Medical University. Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.

Video: Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

גישת optogenetic להערכת יצירת קשרים עצביים במערכת Co-תרבות

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Developmental Biology

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, cell culture has been widely used in developmental biology studies. However, it is important to determine whether in vitro cultured cells truly represent in vivo cell types. Grafting cells into embryos, followed by an assessment of their contribution during development is a useful method to determine the potential of in vitro cultured cells. In this study, we describe a method for grafting cells into a defined site of early postimplantation mouse embryos, followed by ex vivo culture. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing precise localization and adjustment of the number of cells receiving exogenous DNA with both high transfection efficiency and low cell death. These techniques, which do not require any specialized equipment, render experimental manipulations of the gastrulation and early organogenesis-stage mouse embryo possible, allowing analysis of commitment in cultured cell subpopulations and the effect of genetic manipulations in situ on cell differentiation.

We demonstrate a method for grafting cultured cells into defined sites of early mouse embryos to determine their in vivo potential. We also introduce an optimized electroporation method that uses glass capillaries of known diameter, allowing the precise delivery of exogenous DNA into a few cells in the embryos.

שיטות להעברת לוקליזציה דווקא של תאים או DNA לPostimplantation המוקדם עכבר עוברים

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.

הכנת עכברוש Oligodendrocyte ובתאי תרבויות וכימות של Oligodendrogenesis באמצעות סריקת קרינת Dual-אינפרא אדום

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

Isolation of Murine Embryonic Hemogenic Endothelial Cells

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, and is necessary for the emergence of definitive HSPC from the murine extra embryonic yolk sac, placenta, umbilical vessels, and the embryonic aorta-gonad-mesonephros (AGM) region. The transient nature and small size of this cell population renders its reproducible isolation for careful quantification and experimental applications technically difficult. We have established a fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based protocol for simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC during their peak generation times in the yolk sac and AGM. We demonstrate methods for dissection of yolk sac and AGM tissues from mouse embryos, and we present optimized tissue digestion and antibody conjugation conditions for maximal cell survival prior to identification and retrieval via FACS. Representative FACS analysis plots are shown that identify the hemogenic endothelial cell and HSPC phenotypes, and describe a methylcellulose-based assay for evaluating their blood forming potential on a clonal level.

Hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) derive from specialized (hemogenic) endothelial cells during development, yet little is known about the process by which some endothelial cells specify to become blood forming. We demonstrate a flow-cytometry based method allowing simultaneous isolation of hemogenic endothelial cells and HSPC from murine embryonic tissues.

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

The specification of hemogenic endothelial cells from embryonic vascular endothelium occurs during brief developmental periods within distinct tissues, ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

בידוד והתרבות של תאים עובריים עצביים עכברוש: ​​פרוטוקול מהיר

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Neuroscience

Preparation of Rat Brain Aggregate Cultures for Neuron and Glia Development Studies

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) would provide a powerful platform for neuroscientists to investigate axo-glial interactions, properties and differentiation of multipotent progenitors, and progression of oligodendroglial lineage cells at the cellular and molecular level.  We describe here a CNS aggregate culture system from embryonic rat forebrains, which can be maintained in a serum-free medium up to 3-4 weeks and is used in our laboratory as a model to study neuron-glia interaction and CNS myelination.  This video clip will demonstrate how to isolate and grow these CNS aggregate cultures from E16 rat brain.  Furthermore, from the same brain dissection, highly enriched regular dissociated neuronal cultures can be readily obtained and used for various studies on CNS neurons or used for co-cultures with other cells. 

A protocols for an embryonic rat brain aggregate culture system is described. Multipotent progenitors in the aggregates can develop and differentiate into neurons, astrocytes and oligodendrocytes.

הכנת המוח עכברוש תרבויות מצטבר עבור Neuron ופיתוח מחקרים גליה

An in vitro system that recapitulates the development and differentiation of progenitors into mature neurons and glia in the central nervous system (CNS) ...

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. Platforms have been recently developed for highly robust and prolonged ex utero culture of mouse embryos from egg-cylinder stages until advanced organogenesis. These platforms enable appropriate and faithful development of pregastrulating embryos (E5.5) until the hind limb formation stage (E11). Late gastrulating embryos (E7.5) are grown in rotating bottles in these settings, while extended culture from pregastrulation stages (E5.5 or E6.5) requires a combination of static and rotating bottle cultures. In addition, sensitive regulation of O2 and CO2 concentration, gas pressure, glucose levels, and the use of a specific ex utero culture medium are critical for proper embryo development. Here, a detailed step-by-step protocol for extended ex utero mouse embryo culture is provided. The ability to grow normal mouse embryos ex utero from gastrulation to organogenesis represents a valuable tool for characterizing the effect of different experimental perturbations during embryonic development.

Ex Utero Culture of Mouse Embryos from Pregastrulation to Advanced Organogenesis

An enhanced platform for whole-embryo culture allows continuous and robust ex utero development of postimplantation mouse embryos for up to six days, from pregastrulation stages until advanced organogenesis. In this protocol, we detail the standard procedure for successful embryo culture using static plates and rotating bottle systems.

רחם לשעבר תרבות של עוברי עכבר מ pregastrulation כדי Organogenesis מתקדם

Postimplantation mammalian embryo culture methods have been generally inefficient and limited to brief periods after dissection out of the uterus. ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

שיטת התרבות העובר שלמים מכרסמים באמצעות Rotator מסוג התרבות מערכת בקבוק

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

עכבר עוברי פיתוח במערכת סרום ללא תרבות שלמה עובר

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

הכנת סרום העכברוש מתאים לתרבות עובר שלמה יונקים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

גישת optogenetic להערכת יצירת קשרים עצביים במערכת Co-תרבות

בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות

שיטות להעברת לוקליזציה דווקא של תאים או DNA לPostimplantation המוקדם עכבר עוברים

הכנת עכברוש Oligodendrocyte ובתאי תרבויות וכימות של Oligodendrogenesis באמצעות סריקת קרינת Dual-אינפרא אדום

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

בידוד והתרבות של תאים עובריים עצביים עכברוש: פרוטוקול מהיר

הכנת המוח עכברוש תרבויות מצטבר עבור Neuron ופיתוח מחקרים גליה

רחם לשעבר תרבות של עוברי עכבר מ pregastrulation כדי Organogenesis מתקדם

שיטת התרבות העובר שלמים מכרסמים באמצעות Rotator מסוג התרבות מערכת בקבוק

עכבר עוברי פיתוח במערכת סרום ללא תרבות שלמה עובר

הכנת סרום העכברוש מתאים לתרבות עובר שלמה יונקים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

גישת optogenetic להערכת יצירת קשרים עצביים במערכת Co-תרבות

בידול עצבי של תאי עכבר גזע עובריים בסרום ללא חד שכבתי תרבות

שיטות להעברת לוקליזציה דווקא של תאים או DNA לPostimplantation המוקדם עכבר עוברים

הכנת עכברוש Oligodendrocyte ובתאי תרבויות וכימות של Oligodendrogenesis באמצעות סריקת קרינת Dual-אינפרא אדום

בידוד של Murine העוברי Hemogenic לתאי אנדותל

בידוד והתרבות של תאים עובריים עצביים עכברוש: ​​פרוטוקול מהיר

הכנת המוח עכברוש תרבויות מצטבר עבור Neuron ופיתוח מחקרים גליה

רחם לשעבר תרבות של עוברי עכבר מ pregastrulation כדי Organogenesis מתקדם

שיטת התרבות העובר שלמים מכרסמים באמצעות Rotator מסוג התרבות מערכת בקבוק

עכבר עוברי פיתוח במערכת סרום ללא תרבות שלמה עובר

בידוד והתרבות של תאים עובריים עצביים עכברוש: פרוטוקול מהיר