سمير حمدان ساعد في تطوير هذه التقنية. E. البروتينات القولونية هي من مختبر البروفيسور نيك ديكسون ، جامعة ولونغونغ ، والبروتينات هي من T7 البروفيسور تشارلز ريتشاردسون ، كلية هارفارد الطبية. وتدعم العمل الذي قامت به المعاهد الوطنية للصحة (GM077248 لAMvO) والتابوت جين تشايلدز مؤسسة (JJL).

<ol>
	<li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+single-molecule+observation+of+rolling-circle+DNA+replication.">Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 37, e27 (2009).</li><li>Tabor, S., Huber, H. E., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+thioredoxin+confers+processivity+on+the+DNA+polymerase+activity+of+the+gene+5+protein+of+bacteriophage+t7.">Escherichia coli thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the gene 5 protein of bacteriophage t7.</a> J Biol Chem. 262, 16212-16223 (1987).</li><li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+oxide)+grafted+to+silicon+surfaces:+Grafting+density+and+protein+adsorption.">Poly(ethylene oxide) grafted to silicon surfaces: Grafting density and protein adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li><li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M., Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+observation+of+prokaryotic+DNA+replication.">Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.</a> DNA replication: Methods and protocols. 521, 397-410 (2009).</li><li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis.">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li><li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand.">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-562 (2006).</li></ol>

المراقبة الحرجة واحد هو دراسة تأثير أورانج SYTOX صمة عار ، على البروتينات تكرار الفائدة. وهناك طريقة بسيطة للقيام بذلك هي لتنفيذ تكرار التجربة في الخلية التدفق كما هو موضح ولكن مع إغفال SYTOX. بعد خليط التفاعل قد تدفقت عبر الغرفة ، إضافة إلى SYTOX العازلة مع وصمة عار الحمض النووي ودراسة توزيع طول جزيئات منسوخة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام معظم ردود الفعل القياسية لفحص أي تأثير على معدل تكرار SYTOX والكفاءة. التجربة الموصوفة هنا فقط يستخدم تدفق قناة واحدة. يمكن تغيير هذا بسهولة من خلال خلق قنوات متعددة الغرف تدفق أو استخدام أو الأجهزة ميكروفلويديك PDMS مماثلة. زيادة عدد القنوات ييسر فحص تركيزات البروتين ، والمسوخ ، أو الجزيئات المانع ويزيد من سرعة جمع البيانات تكرارها. كما ذكرنا ، فإننا أداء E. تكرار التجارب القولونية عند 37 درجة مئوية باستخدام تدفق الالومنيوم تدفئة المنازل بنيت الخلية ، عنصر التدفئة مقاوم (خرطوشة سخان) والمتغير امدادات الطاقة. وهذا يعطي درجة حرارة جيدة الاستقرار والابتعاد عن شراء سخان الهدف. لمعايرة جهاز التدفئة ، ونحن ببساطة حفر حفرة في وسط تدفق رأس خلية الكوارتز ، وإدراج الحرارية في قناة تدفق وتدفق العازلة كالمعتاد. قياس درجة حرارة التدفق العازلة خلية في زيادة الفولتية يسمح التدفئة دقيقة.

واضاف تريس 40 ملم درجة الحموضة 7.5 ، الغلوتامات البوتاسيوم 50 ملي و 10 ملي مول كلوريد المغنيسيوم ، و 100 ميكروغرام / مل جيش صرب البوسنة ، مع dithiothreitol 5 مم ، 600 ميكرومتر dNTPs ، و 300 ميكرومتر اعبي التنس المحترفين ، و 300 ميكرومتر CTP ، و 15 نانومتر SYTOX أورانج على الفور من قبل : T7 المتماثل الاستخدام. وأضاف البروتينات على النحو التالي : 5 نانومتر gp4 (مسدوس) ، 40 نانومتر بوليميريز (1:1 gp5 : thioredoxin) ، 360 نانومتر gp2.5 1،5. إي كولاي المتماثل : HEPES 50 ملم 7.9 درجة الحموضة ، 12 المغنيسيوم خلات ملم ، 80 ملم كلوريد البوتاسيوم و 100 ميكروغرام / مل مع جيش صرب البوسنة dithiothreitol 10 ملم ، و 40 ميكرومتر dNTPs ، 200 rNTPs ميكرومتر ، و 15 نانومتر SYTOX أورانج واضاف على الفور قبل استخدامه. وأضاف البروتينات على النحو التالي : 30 نانومتر DnaB (مسدوس) ، 180 نانومتر DnaC (مونومر) ، 30 نانومتر αεθ ، 15 نانومتر τ 2 1 γ δδ&#39;χψ أو τ δδ&#39;χψ 3 ، 30 β نانومتر (ديمر) ، 300 نانومتر DnaG ، 250 نانومتر SSB (tetramer) ، 20 نانومتر بريا و 40 نانومتر PriB ، 320 نانومتر PRIC ، 480 نانومتر DNAT 1،6

visualizing single-molecule dna replication with fluorescence microscopy

وصفنا بسيطة مضان المجهري المستندة في الوقت الحقيقي لمراقبة طريقة تكرار الحمض النووي على مستوى واحد جزيء. ومرفق بهذا التعميم ، قالب الحمض النووي متشعب إلى ساترة functionalized الزجاج على نطاق واسع وتكرارها بعد إدخال البروتينات النسخ والنيوكليوتيدات (الشكل 1). يتم توسيع المتزايد الناتج المزدوج حبلا الحمض النووي (dsDNA) مع تدفق الصفحي وتصور باستخدام صبغة الإقحام. قياس موقف نهاية الحمض النووي المتنامي في الوقت الحقيقي يسمح التحديد الدقيق لمعدل التكرار (الشكل 2). وعلاوة على ذلك ، وطول الحمض النووي الانتهاء من المنتجات تقارير عن processivity من تكرارها. يمكن إجراء هذه التجربة بسهولة وبسرعة جدا ويتطلب سوى مضان المجهر مع كاميرا حساسة إلى حد معقول.

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

يوضح هذا البروتوكول بسيطة المجهري مضان المفرد جزيء تقنية لتصور تكرار الحمض النووي التي replisomes الفردية في الوقت الحقيقي.

تصور تكرار الحمض النووي جزيء واحدة مع مضان المجهري

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

visualizing-single-molecule-dna-replication-with-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

22.4K Views.  Harvard Medical School. يوضح هذا البروتوكول بسيطة المجهري مضان المفرد جزيء تقنية لتصور تكرار الحمض النووي التي replisomes الفردية في الوقت الحقيقي.

Video: Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome organization are governed by DNA-binding proteins that recognize specific DNA structures or sequences. In vitro experiments have helped to generate detailed models for the function of many types of DNA-binding proteins, yet, the exact mechanisms of these processes and their organization in the complex environment of the living cell remain far less understood. We recently introduced a method for quantifying DNA-repair activities in live Escherichia coli cells using Photoactivated Localization Microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking. Our general approach identifies individual DNA-binding events by the change in the mobility of a single protein upon association with the chromosome. The fraction of bound molecules provides a direct quantitative measure for the protein activity and abundance of substrates or binding sites at the single-cell level. Here, we describe the concept of the method and demonstrate sample preparation, data acquisition, and data analysis procedures.

Photoactivated localization microscopy (PALM) combined with single-molecule tracking allows direct observation and quantification of protein-DNA interactions in live Escherichia coli cells.

تصور التفاعلات الحمض النووي البروتين في الخلايا البكتيرية عن طريق لايف Photoactivated تتبع جزيء واحدة

Protein-DNA interactions are at the heart of many fundamental cellular processes. For example, DNA replication, transcription, repair, and chromosome ...

Immunology and Infection

Single-Molecule Dwell-Time Analysis of Restriction Endonuclease-Mediated DNA Cleavage

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for hundreds of individual restriction endonuclease (REase) molecules in one experiment. This assay does not require protein labeling and can be carried out with a single imaging channel. In addition, the results of multiple individual experiments can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions. Analysis of the resulting dwell-time distributions can help elucidate the DNA cleavage mechanism by revealing the presence of kinetic steps that cannot be directly observed. Example data collected using this assay with the well-studied REase, EcoRV - a dimeric Type IIP restriction endonuclease that cleaves the palindromic sequence GAT&#8595;ATC (where &#8595; is the cut site) - are in agreement with prior studies. These results suggest that there are at least three steps in the pathway to DNA cleavage that is initiated by introducing magnesium after EcoRV binds DNA in its absence, with an average rate of 0.17 s-1 for each step.

Using quantum-dot-labeled DNA and total internal reflection fluorescence microscopy, we can investigate the reaction mechanism of restriction endonucleases while using unlabeled protein. This single-molecule technique allows for massively multiplexed observation of individual protein-DNA interactions, and data can be pooled to generate well-populated dwell-time distributions.

تحليل وقت السكون أحادي الجزيء لانقسام الحمض النووي بوساطة نوكلياز التقييد

This novel total internal reflection fluorescence microscopy-based assay facilitates the simultaneous measurement of the length of the catalytic cycle for ...

Biochemistry

Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. Linearized &lambda; DNA is modified to have a biotin on the end of one strand, and a digoxigenin moiety on the other end of the same strand. The biotinylated end is attached to a functionalized glass coverslip and the digoxigeninated end to a small bead. The assembly of these DNA-bead tethers on the surface of a flow cell allows a laminar flow to be applied to exert a drag force on the bead. As a result, the DNA is stretched close to and parallel to the surface of the coverslip at a force that is determined by the flow rate (Figure 1). The length of the DNA is measured by monitoring the position of the bead. Length differences between single- and double-stranded DNA are utilized to obtain real-time information on the activity of the replication proteins at the fork. Measuring the position of the bead allows precise determination of the rates and processivities of DNA unwinding and polymerization (Figure 2).

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system.

الملاحظة المباشرة من الحمض النووي الانزيمات تكرار استخدام الحمض النووي جزيء واحدة تمتد الفحص

We describe a method for observing real time replication of individual DNA molecules mediated by proteins of the bacteriophage replication system. ...

تصوير حركة Cdc45 / Mcm2-7 / GINS المعاد تشكيلها بالكامل (CMG)

Hybrid Ensemble and Single-molecule Assay to Image the Motion of Fully Reconstituted CMG

Eukaryotes have one replicative helicase known as CMG, which centrally organizes and drives the replisome, and leads the way at the front of replication forks. Obtaining a deep mechanistic understanding of the dynamics of CMG is critical to elucidating how cells achieve the enormous task of efficiently and accurately replicating their entire genome once per cell cycle. Single-molecule techniques are uniquely suited to quantify the dynamics of CMG due to their unparalleled temporal and spatial resolution. Nevertheless, single-molecule studies of CMG motion have thus far relied on pre-formed CMG purified from cells as a complex, which precludes the study of the steps leading up to its activation. Here, we describe a hybrid ensemble and single-molecule assay that allowed imaging at the single-molecule level of the motion of fluorescently labeled CMG after fully reconstituting its assembly and activation from 36 different purified S. cerevisiae polypeptides. This assay relies on the double functionalization of the ends of a linear DNA substrate with two orthogonal attachment moieties, and can be adapted to study similarly complex DNA-processing mechanisms at the single-molecule level.

تسليط الضوء على المؤلف: التحقيق في ديناميات الحركة للمكونات المستردة حقيقية النواة على مستوى الجزيء الواحد

We report a hybrid ensemble and single-molecule assay to directly image and quantify the motion of fluorescently labeled, fully reconstituted Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) helicase on linear DNA molecules held in place in an optical trap.

مجموعة هجينة ومقايسة أحادية الجزيء لتصوير حركة CMG المعاد تشكيلها بالكامل

Eukaryotes have one replicative helicase known as CMG, which centrally organizes and drives the replisome, and leads the way at the front of replication ...

<meta charset="utf8"></head><body>لوحظ فك الحمض النووي بوساطة CMG بواسطة نمو جهاز ssDNA-RPA

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a dynamic complex of proteins termed the replisome. At the heart of the replisome is the&#160;CDC45-MCM2-7-GINS (CMG) helicase, which separates the two strands of the DNA double helix such that DNA polymerases can copy each strand. During genome duplication, replisomes must overcome a plethora of obstacles and challenges. Each of these threatens genome stability, as failure to replicate DNA completely and accurately can lead to mutations, diseases, or cell death. Therefore, it is of great interest to understand how CMG functions in the replisome during both normal replication and replication stress. Here, we describe a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy assay using recombinant purified proteins, which allows for real-time visualization of surface-tethered stretched DNA molecules by individual CMG complexes. This assay provides a powerful platform to investigate CMG behavior at the single-molecule level, allowing helicase dynamics to be directly observed with real-time control over reaction conditions.

<meta charset="utf8"></head><body>أضواء الكاتب: كشف ديناميكيات تكرار الحمض النووي حقيقيات النواة من خلال تصور الجزيء الفردي

This protocol demonstrates performing a single-molecule assay for live visualization of DNA unwinding by CMG helicase. It describes (1) preparing a DNA substrate, (2) purifying fluorescently labeled Drosophila melanogaster CMG helicase, (3) preparing a microfluidic flow cell for total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy, and (4) the single-molecule DNA unwinding assay.

تصور أحادي الجزيء في الوقت الحقيقي لفك الحمض النووي بواسطة CMG Helicase

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not only ensure faithful genome duplication in the face of endogenous and exogenous DNA damage but also prevent genomic instability, a recognized causative factor in tumor development.
Here, we describe a simple and cost-effective fluorescence microscopy-based method to visualize DNA replication in the avian B-cell line DT40. This cell line provides a powerful tool to investigate protein function in vivo by reverse genetics in vertebrate cells1. DNA fiber fluorography in DT40 cells lacking a specific gene allows one to elucidate the function of this gene product in DNA replication and genome stability. Traditional methods to analyze replication fork dynamics in vertebrate cells rely on measuring the overall rate of DNA synthesis in a population of pulse-labeled cells. This is a quantitative approach and does not allow for qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis. In contrast, the rate of movement of active forks can be followed directly when using the DNA fiber technique2-4. In this approach, nascent DNA is labeled in vivo by incorporation of halogenated nucleotides (Fig 1A). Subsequently, individual fibers are stretched onto a microscope slide, and the labeled DNA replication tracts are stained with specific antibodies and visualized by fluorescence microscopy (Fig 1B). Initiation of replication as well as fork directionality is determined by the consecutive use of two differently modified analogues. Furthermore, the dual-labeling approach allows for quantitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase, i.e. replication structures such as ongoing and stalled forks, replication origin density as well as fork terminations. Finally, the experimental procedure can be accomplished within a day, and requires only general laboratory equipment and a fluorescence microscope.

DT40, a model vertebrate genetic system, provides a powerful tool to analyze protein function. Here we describe a simple method that allows qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase in DT40 cells at the single molecule level.

تصور تكرار الحمض النووي في DT40 النظام النموذجي الفقارية باستخدام تقنيات الحمض النووي الألياف

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

تصور تكرار الحمض النووي جزيء واحدة مع مضان المجهري

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

تصور التفاعلات الحمض النووي البروتين في الخلايا البكتيرية عن طريق لايف Photoactivated تتبع جزيء واحدة

تحليل وقت السكون أحادي الجزيء لانقسام الحمض النووي بوساطة نوكلياز التقييد

الملاحظة المباشرة من الحمض النووي الانزيمات تكرار استخدام الحمض النووي جزيء واحدة تمتد الفحص

مجموعة هجينة ومقايسة أحادية الجزيء لتصوير حركة CMG المعاد تشكيلها بالكامل

مجموعة هجينة ومقايسة أحادية الجزيء لتصوير حركة CMG المعاد تشكيلها بالكامل

مجموعة هجينة ومقايسة أحادية الجزيء لتصوير حركة CMG المعاد تشكيلها بالكامل

تصور أحادي الجزيء في الوقت الحقيقي لفك الحمض النووي بواسطة CMG Helicase

تصور أحادي الجزيء في الوقت الحقيقي لفك الحمض النووي بواسطة CMG Helicase

تصور أحادي الجزيء في الوقت الحقيقي لفك الحمض النووي بواسطة CMG Helicase

تصور تكرار الحمض النووي في DT40 النظام النموذجي الفقارية باستخدام تقنيات الحمض النووي الألياف