Samir Hamdan aiutato nello sviluppo di questa tecnica. E. coli sono proteine ​​dal laboratorio del Prof. Nick Dixon, proteine ​​dell&#39;Università di Wollongong, e T7 sono dal Prof. Charles Richardson, Harvard Medical School. Il lavoro è supportato dal National Institutes of Health (GM077248 a AMvO) e Jane Coffin Childs Foundation (JJL).

Prima di eseguire una singola molecola esperimento replica, alcuni materiali devono essere preparate in anticipo. 1. DNA replica Template Il substrato per la reazione di replica è un biotinilato, coda M13 cerchio di rotolamento preparato utilizzando le normali tecniche di biologia molecolare 1,2. Materiali: M13mp18 DNA a singolo filamento, biotinilato fondo oligonucleotidi coda (5&#39;-Biotina-T 36 AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT-3 &#39;), la DNA polimerasi T7, blocco di calore, fenolo / alcool isoamilico / cloroformio <ol><li> Temprare il oligo biotinilato coda alla M13 con l&#39;aggiunta di 10 volte l&#39;eccesso di oligo in tampone TBS (330 nM coda di oligo, 33 nM M13). </li><li> Scaldare la miscela a 65 ° C nel blocco di calore. Una volta riscaldato, ruotare il blocco fuoco spento e consentire il raffreddamento lento a temprare correttamente il primer. </li><li> Aggiungere la M13 pronti a una miscela di 64 nM T7 polimerasi del DNA e la replicazione del buffer T7 contenente dNTP e MgCl 2. </li><li> Incubare la reazione a 37 ° C per 12 minuti e spegnere con 100 mM EDTA. </li><li> Purificare la compilati nel DNA del prodotto con fenolo / cloroformio / alcool isoamilico estrazione e Dializzare nel buffer TE o altri buffer di stoccaggio e determinare la concentrazione del DNA (Back-estrarre ogni fase organica di recuperare eventuali residui innescato M13). </li><li> Una iterazione di preparazione modello può facilmente rendere diversi ml di concentrazione nanomolari modello, sufficiente per centinaia di migliaia di singola molecola esperimenti. </li></ol> 2. Coprivetrini funzionalizzati Per fissare il DNA alla coprioggetto di vetro, il vetro viene prima funzionalizzati con un aminosilane, che viene poi accoppiato a molecole PEG biotinilato. Questo rivestimento consente di ridurre le interazioni non specifiche di DNA e proteine ​​replica con la superficie di 1,3. Materiali: coprioggetto di vetro, barattoli di colorazione, 3-amminopropiltrietossisilano, metossi-PEG5k NHS-estere, biotina-PEG5k-NHSester, acetone, KOH 1M, etanolo, Forno, sonicatore Bagno <ol><li> Pulire accuratamente i coprioggetti vetro mettendoli in colorazione vasi e riempire i vasi con etanolo. Con ultrasuoni per 30 minuti e sciacquare i vasi e riempire con 1 M KOH. Ultrasuoni per 30 minuti Ripetere i due lavaggi. </li><li> Per la reazione di funzionalizzazione primo, tutte le tracce di acqua devono essere rimosse. Riempite i barattoli con acetone e ultrasuoni per 10 min. Sciacquare i vasetti di nuovo con acetone. </li><li> Preparare un 2% v / v soluzione del reagente silano in acetone. Aggiungi ai contenitori per i lavaggi e agitare per 2 minuti. Questa reazione coppie del gruppo alcossi del aminosilane al vetro, lasciando una ammina reattiva per il passo successivo accoppiamento. Spegnere la reazione con un eccesso d&#39;acqua. </li><li> Asciugare il coprioggetto dalla loro cottura a 110 ° C in forno per 30 minuti. </li><li> Preparare un 50:1 metossi: biotina miscela PEG in 100 mM NaHCO 3 pH 8,2. Obiettivo per circa lo 0,2% w / v PEG biotinilato. </li><li> Pipettare 100 ul della miscela PEG su un vetrino asciutto silanizzata e posto un altro coprioggetti sopra. Compreso un distanziatore coprioggetto di vetro permette la separazione delle lamelle. </li><li> Incubare i coprioggetti nella soluzione di PEG per 3 ore, poi separare ogni coppia di coprioggetto e lavare a lungo con acqua. Fare attenzione a tenere i coprioggetti funzionalizzate verso l&#39;alto come unico lato una volta saranno rivestiti con PEG. </li><li> Asciugare il coprioggetto e conservare sotto vuoto. Le superfici sono stabili per almeno un mese, in modo da decine di coprioggetto può essere fatta in un batch ed utilizzato secondo necessità. </li></ol> Questi materiali devono essere fatte prima del tempo, e poi utilizzati per ogni esperimento. Per iniziare a sperimentare ogni singola molecola, iniziare l&#39;assemblaggio della camera di flusso. 3. Flusso Camera di preparazione L&#39;esperimento viene eseguita utilizzando una camera di flusso semplice costruito con un coprioggetto funzionalizzati, nastro biadesivo, una diapositiva quarzo e tubi. Una camera di flusso viene preparato per ogni singola molecola 1,4 esperimento. Materiali: su entrambi i lati del nastro, lametta, scivolo al quarzo con fori per tubi, ad asciugatura rapida epossidica, coprioggetto funzionalizzati (vedi sopra), soluzione Streptavidina (25 ml di 1 mg / ml in PBS), tubi, buffer di blocco (20 mM Tris pH 7.5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,2 mg / ml BSA, 0,005% Tween-20) <ol><li> Iniziare a collocarlo 20-25 mL di tampone di bloccaggio in un essiccatore per rimuovere eventuali bolle d&#39;aria per fasi successive. </li><li> Prendete un PEG-funzionalizzati coprioggetto e diffusione di PBS-125 una soluzione diluita di streptavidina sulla superficie. Lasciare questo ad incubare per 20 minuti durante la preparazione di altre parti della camera, che permette di legare streptavidina biotins superficie. </li><li> Tagliare un pezzo di doppio latoNastro d in base alle dimensioni della diapositiva quarzo. Segnare la posizione dei fori tubo sul nastro con una matita in modo che il contorno della camera di flusso si possono trarre sul nastro (1 mg / mL). </li><li> Fai di 2 mm di larghezza rettangolo intorno ai fori. Questo servirà come canale di flusso, in modo da essere sicuro di fare i lati dritti e lasciare spazio attorno al tubo di ingresso e di uscita. Se lo si desidera, più canali o dimensioni diverse possono essere utilizzati. </li><li> Tagliare lungo il contorno disegnato, rendendo dritto, tagli netti per assicurarsi che non sporge adesivo nel canale. </li><li> Pulire il quarzo accuratamente con acetone o etanolo per rimuovere l&#39;adesivo dalla costruzione precedente cella di flusso. </li><li> Trova la migliore allineamento del contorno canale, rimuovere un lato del supporto adesivo e posizionare con attenzione il nastro sul vetrino di quarzo. Prestare attenzione ad allineare il nastro correttamente, come i fori di ingresso e di uscita devono rimanere sbloccato. </li><li> Tagliare le lunghezze dei tubi per l&#39;ingresso el&#39;uscita della cella di flusso. Essa aiuta a tagliare l&#39;estremità del tubo a circa 30 ° di inclinazione in modo che il tubo non si stampa contro il fondo piatto della camera. Posizionare i tubi su una sorta di sostegno di sospenderli per un facile montaggio della cella di flusso nelle fasi successive. </li><li> Sciacquare la streptavidina rivestite coprioggetto accuratamente con acqua e asciugare con aria compressa. Ricordati che solo un lato è funzionalizzato; fare attenzione a non trasformare il coprioggetto sopra. Rimuovere l&#39;altro lato del supporto a nastro e posto il vetrino di quarzo sul vetrino. </li><li> Premere leggermente il vetrino per far uscire l&#39;aria intrappolata nel adesivo. Questo aiuterà a evitare eventuali bolle d&#39;aria di entrare nel canale di flusso. </li><li> Sigillare i lati della camera con resina epossidica. Inserire il tubo tagliato nei fori del quarzo e tenuta in posizione con resina epossidica. Questo deve asciugare per qualche minuto. </li><li> Una volta asciutto, cominciano bloccando la superficie tirando alcuni dei buffer degasato blocco attraverso uno dei tubi. Un 21-gauge si adatta perfettamente all&#39;interno del tubo di 0,76 mm. Stanare un paio di volte per eliminare le bolle d&#39;aria, e permettere la camera di incubazione per almeno mezz&#39;ora. </li></ol> 4. Singola molecola di replica Experiment Materiali: camera di flusso preparati, SYTOX Orange, microscopio TIRF, 532 nm laser, telecamera CCD, computer con software di acquisizione delle immagini, Rolling-cerchio substrato DNA, proteine ​​di replica <ol><li> Dopo la cella di flusso è stato bloccato, tutto è pronto per iniziare la singola molecola esperimento. </li><li> Prendere la cella di flusso e posizionarlo sul palco microscopio. Tenere la camera in posizione con clip palco ed essere sicuri che il canale di flusso è posizionato dritto lungo l&#39;asse y. </li><li> Collegare la cella tubo di flusso in uscita per la pompa a siringa con un più grande tubo connettore diametro o un ago. Posto l&#39;ingresso nel tampone di bloccaggio e tirare indietro la siringa per rimuovere l&#39;aria nel tubo. Un film delicato del tubo di uscita aiuterà chiaro eventuali bolle d&#39;aria intrappolate nella cella di flusso. </li><li> Diluire il modello del DNA magazzino a 25 pM in 1 ml di tampone di bloccaggio. Flusso nella camera a portata moderata per consentire una buona copertura della superficie del DNA. 0,025 ml / min per 30 minuti funziona bene. Questo può essere variata in base al numero di molecole di DNA sono sulla superficie di ciascun lotto di coprioggetto o quanti sono voluti per l&#39;esperimento. </li><li> Una volta che il DNA è, lavare il DNA in eccesso con un tampone di bloccaggio. Lavare per almeno 200 volumi di flusso di cellule per sbarazzarsi di tutto il DNA libero. </li><li> Iniziare degasaggio il buffer di replica. Per la E. esperimenti replica coli, farlo a 37 ° C per ridurre il rischio di bolle nella camera di flusso riscaldato. </li><li> Accendere il laser e telecamera. Il CCD raffreddata deve raggiungere la temperatura prima di poter essere utilizzato. </li><li> Se si esegue a 37 ° C esperimento, girare la stufa. Assicurarsi che l&#39;obiettivo è a contatto con la cella di flusso o sarà un dissipatore di calore in seguito. </li><li> Dopo il lavaggio e degasaggio, la reazione può essere preparato. Nucleotidi mix, DTT, e SYTOX nel buffer di replica. Quindi aggiungere proteine ​​e mescolare delicatamente. </li><li> Flusso della miscela di reazione nella cella di flusso. Questa velocità di flusso deve essere sufficiente per allungare dsDNA. Per un 2-mm di larghezza, 100-micron canale di flusso alto 0,04 ml / min funziona bene. </li><li> Attendere che la miscela di entrare nella camera e iniziare imaging. Un buon consiglio è quello di spostare il campo di vista a lato del canale e concentrarsi sul materiale adesivo. Questo farà sì che sono vicino alla superficie messa a fuoco. </li><li> Regolare potenza del laser, messa a fuoco microscopio, e l&#39;angolo TIRF. Mantenere il potere basso per evitare qualsiasi photocleavage del DNA macchiato. Acquisire al 05/01 fotogrammi / secondo per diversi minuti a seconda del tasso di replicazione del DNA. Se lo si desidera, ripetere per ottenere traiettorie replica più o passare ad un nuovo campo per vedere di più molecole. </li><li> Dopo la miscela di reazione è quasi vuoto, è una buona idea di flusso in più tampone con SYTOX per vedere altri campi di vista. Prendendo immagini multiple di diverse molecole replicato fornisce statistiche per la determinazione processività. </li></ol> 5. Rappresentante Risultati Molecole di replicazione attiva sono facilmente visibili come linee crescente di DNA macchiato. Nei nostri esperimenti, che scorre 25 pM del substrato M13 dà 100-1000 molecole in una, 60x 125 micron x 125 micron campo di vista (Figura 1). Esecuzione di esperimenti di replica utilizzando la E. proteine ​​coli replisoma a 37 ° C (vedi Materiali per i dettagli) dà molecole 5-50 replicare per campo di vista. A concentrazioni equivalente del replisoma T7, che avvia sul substrato molto più efficiente, osserviamo&gt; 70% delle molecole in un campo di replicare. Queste condizioni producono una densità del prodotto così alto che le molecole individuali sono difficili da risolvere ed analizzare, per cui gli esperimenti vengono eseguiti T7 a concentrazioni inferiori di proteine. Analisi dei dati: per ottenere dati di frequenza, è sufficiente tracciare il punto finale del DNA in funzione del tempo e calcolare la pendenza (Figura 2). Per processività, determinare la lunghezza totale del DNA. Entrambi questi numeri dovranno essere convertiti in coppie di basi. Prima di eseguire l&#39;esperimento, si dovrebbe sapere la dimensione in pixel della fotocamera al proprio ingrandimento. Per la conversione basepair, una buona stima è semplicemente convertendo in base alla lunghezza cristallografica del DNA, 2,9 bp / nm. Tuttavia, il flusso laminare non sarà completamente allungare il DNA, così una calibrazione lunghezza del DNA deve essere effettuata prendendo un DNA noto lunghezza, ad esempio, 48.502 bp λ DNA, allegando alla cella di flusso con un oligo biotinilato e misurazione della SYTOX macchiato di lunghezza a la portata utilizzata per l&#39;esperimento di replica. Determinazione del numero di coppie di basi / pixel consente il calcolo preciso dei tassi di replicazione e processivities. Prendendo numerose immagini e filmati fornirà un gran numero di molecole di prodotto, permettendo di tracciare distribuzioni votare e processività (Figura 2) 1. <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: (Da Rif. ​​1.) A), Cartoon del rolling-cerchio saggio di replica. (SA, streptavidina). Leader filo-sintesi si estende la coda che collega il cerchio e la superficie. La coda viene convertito in dsDNA dalla polimerasi filamento in ritardo e si estendeva dal flusso laminare. b) Esempio di campo di vista con SYTOX arancia e 532 nm di eccitazione. Piccole macchie fluorescenti sono legati, non replicate substrati. Si noti la estrema lunghezza dei prodotti e il gran numero di prodotti per campo (ogni cella di flusso contiene&gt; 5000 tali campi). <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: (adattato da Rif. ​​1). A, b) Kymographs molecole tipiche di replicare da T7 (a) ed E. coli (b) esperimenti. c) traiettorie Endpoint di molecole da a) e b) tracciati in funzione del tempo. Traiettorie sono dotati di regressione lineare per ottenere tassi di replica. Esempi riportati sono 99,4 bp s -1 e 467,1 pb s -1. d) le distribuzioni Lunghezza di prodotti per la replica, in forma con singolo decadimento esponenziale di ottenere processività: 25,3 ± 1,7 kbp (T7), 85,3 ± 6,1 kbp (E. coli). e) le distribuzioni di frequenza delle traiettorie singola molecola, in forma con gaussiane singolo. Significa: 75,9 ± 4,8 bp s -1 (T7), 535,5 ± 39 bp s -1 (E. coli).

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Un controllo critico sta esaminando l&#39;effetto della macchia, SYTOX Orange, sulle proteine ​​replica di interesse. Un modo semplice per farlo è quello di eseguire l&#39;esperimento di replica nella cella di flusso, come descritto, ma con l&#39;omissione di SYTOX. Dopo la miscela di reazione è fluito attraverso la camera, aggiungere tampone con SYTOX a macchia di DNA ed esamina la ripartizione lunghezza delle molecole replicati. In alternativa, le reazioni di massa standard può essere utilizzato per verificare eventuali effetti di SYTOX sul tasso di replicazione e di efficienza. L&#39;esperimento descritto qui utilizza solo un singolo canale di flusso. Questo può essere cambiato facilmente con la creazione di multi-canale camere di flusso o con PDMS o simili dispositivi microfluidici. Aumentare il numero di canali facilita notevolmente lo screening delle concentrazioni di proteine, mutanti, o molecole inibitori ed aumenta la rapidità della raccolta di replica dei dati. Come detto, noi dobbiamo fare la E. coli esperimenti replica a 37 ° C con una casa costruita flusso riscaldatore cellula in alluminio, un elemento riscaldante resistivo (riscaldatore a cartuccia) e alimentatore variabile. Questo dà una buona stabilità della temperatura ed evita l&#39;acquisto di un riscaldatore obiettivo. Per calibrare il riscaldamento, abbiamo semplicemente praticato un foro al centro di un top quarzo cella di flusso, una termocoppia inserita nel canale di flusso e di buffer scorreva normalmente. Misurare la temperatura della cella di flusso del buffer a tensioni sempre più accurata permette di riscaldamento.

Replica T7: 40 mM Tris pH 7,5, 50 mM glutammato di potassio, 10 mM cloruro di magnesio, 100 mg / ml BSA, con mM ditiotreitolo 5, 600 mM dNTPs, 300 mM ATP, 300 mM CTP, e 15 nM SYTOX Arancione aggiunto immediatamente prima uso. Proteine ​​aggiunto: 5 nM gp4 (esamero), 40 nM polimerasi (1:1 GP5: tioredoxina), 360 nm gp2.5 1,5. Replica E. coli: 50 HEPES mM pH 7,9, 12 mM acetato di magnesio, 80 mM di cloruro di potassio, 100 mg / ml BSA con mM ditiotreitolo 10, 40 mM dNTPs, 200 rNTPs microM e 15 nM SYTOX Arancione aggiunta immediatamente prima dell&#39;uso. Proteine ​​aggiunto come: 30 nM DnaB (esamero), 180 nM DnaC (monomero), 30 αεθ nM, 15 nM τ 2 γ 1 δδ&#39;χψ o τ 3 δδ&#39;χψ, 30 β nM (dimero), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetramero), 20 nM Pria, 40 nM PriB, 320 nM PRIC, 480 nM DNAT 1,6

visualizing single-molecule dna replication with fluorescence microscopy

Descriviamo un semplice microscopio a fluorescenza basato in tempo reale metodo per osservare la replicazione del DNA a livello di singola molecola. Una circolare, modello di DNA biforcuta è collegato a un coprioggetto di vetro funzionalizzati e replicato ampiamente dopo l&#39;introduzione di proteine ​​e nucleotidi replica (Figura 1). La crescita dei prodotti a doppio filamento di DNA (dsDNA) è esteso a flusso laminare e visualizzati utilizzando un colorante intercalante. Misurare la posizione della fine del DNA in crescita in tempo reale permette la precisa determinazione del tasso di replicazione (Figura 2). Inoltre, la lunghezza dei prodotti di DNA completato rapporti sulla processività della replicazione. Questo esperimento può essere eseguita molto facilmente e rapidamente e richiede solo un microscopio a fluorescenza con una macchina fotografica abbastanza sensibile.

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Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Questo protocollo dimostra una semplice molecola singola tecnica di microscopia a fluorescenza per la visualizzazione di replicazione del DNA da replisomes singoli in tempo reale.

Visualizzazione singola molecola di DNA replica con microscopia a fluorescenza

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

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