Samir Hamdan auxiliado no desenvolvimento desta técnica. E. coli são proteínas do laboratório do Prof Nick Dixon, proteínas Universidade de Wollongong, e T7 são do Prof Charles Richardson, Harvard Medical School. Trabalho é apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (GM077248 para AMvO) e Jane Coffin Childs Foundation (JJL).

Antes de realizar um experimento de replicação única molécula, alguns materiais precisam ser preparadas com antecedência. 1. Modelo de replicação do DNA O substrato para a reação de replicação é um biotinilado, M13 círculo cauda rolando preparado usando o padrão de biologia molecular 1,2 técnicas. Materiais: M13mp18 DNA de fita simples, primer oligonucleotídeo biotinilado cauda (5&#39;-Biotina-T 36 AATTCGTAAT CATGGTCATAGCTGTTTCCT-3 &#39;), T7 DNA polimerase, bloco de calor, fenol / álcool isoamílico / Clorofórmio <ol><li> Recozer a oligo cauda biotinilado para o M13, adicionando um excesso de 10 vezes de oligo em TBS tampão (330 nM cauda oligo, 33 nM M13). </li><li> Aquecer a mistura a 65 ° C no bloco de calor. Uma vez aquecida, por sua vez o bloco de calor e deixe resfriamento lento corretamente anneal o primer. </li><li> Adicione o M13 preparado para uma mistura de 64 nM DNA polimerase T7 e buffer de replicação T7 contendo dNTPs e MgCl 2. </li><li> Incubar a reação a 37 ° C por 12 minutos e saciar com 100 mM EDTA. </li><li> Purificar o DNA preenchido produto com fenol / clorofórmio / isoamílico extração de álcool e diálise em tampão TE ou buffer de armazenamento adequado e determinar a concentração de DNA (Back-extrair cada fase orgânica para recuperar qualquer residual preparado M13). </li><li> Uma iteração do modelo de preparação pode facilmente fazer alguns ml de modelo de concentração nanomolar, o suficiente para centenas de milhares de single-molécula de experimentos. </li></ol> 2. Lamelas funcionalizados Para prender a DNA para a lamela de vidro, o vidro é o primeiro funcionalizados com um aminosilane, que é acoplado a moléculas de PEG biotinilado. Este revestimento ajuda a reduzir as interações não específicas de DNA e proteínas de replicação com a superfície 1,3. Materiais: lamínulas de vidro, potes de coloração, 3-aminopropyltriethoxysilane, Methoxy-PEG5k NHS-éster, Biotina-PEG5k-NHSester, acetona, 1M KOH, Etanol, Forno sonicador Bath, <ol><li> Limpam-se as lamínulas de vidro, colocando-os na coloração frascos e encher os frascos com etanol. Sonicado por 30 minutos e enxaguar os frascos e encher com 1 M KOH. Sonicado por 30 minutos Repita os dois lavagens. </li><li> Para a reação de funcionalização em primeiro lugar, todos os vestígios de água precisam ser removidos. Enchei as talhas de acetona e sonicate por 10 min. Enxaguar os frascos novamente com acetona. </li><li> Prepare uma solução 2% v / v do reagente silano em acetona. Adicionar ao tinas de coloração e agitar por 2 minutos. Esta reação casais do grupo de alcóxi de aminosilane ao vidro, deixando uma amina reativos para a etapa seguinte de acoplamento. Saciar a reação com um grande excesso de água. </li><li> Seca as lamelas cozendo-los a 110 ° C no forno por 30 minutos. </li><li> Prepare um metoxi 50:1: biotina mistura PEG em 100 mM NaHCO 3 pH 8.2. Apontar para cerca de 0,2% PEG w / v biotinilado. </li><li> Pipetar 100 mL da mistura PEG em uma lamela seca silanizadas e colocar outra lamínula por cima. Incluindo um espaçador lamela de vidro vai permitir a separação das lamelas. </li><li> Incubar as lamelas na solução de PEG por 3 horas, em seguida, separe cada par de lamelas e lavar abundantemente com água. Tenha cuidado para manter as lamelas funcionalizados lateral-se como apenas o lado uma vez serão revestidas com PEG. </li><li> Seca as lamelas e armazenar sob vácuo. As superfícies de permanecer estável por pelo menos um mês, assim que dezenas de lamelas podem ser feitas em um lote e usado quando necessário. </li></ol> Estes materiais devem ser feitas antes do tempo, e então usado para cada experimento. Para iniciar cada experimento molécula única, comece a montagem da câmara de fluxo. 3. Preparação câmara de fluxo O experimento é realizado com uma câmara de fluxo simples construída com uma lamela funcionalizados, fita dupla face, uma lâmina de quartzo e tubo. Uma câmara de fluxo está preparada para 1,4 cada molécula única experiência. Materiais: fita dupla face, lâmina de barbear, lâmina de quartzo com furos para tubos de epóxi, Quick-seca, lamela funcionalizados (veja acima), Estreptavidina solução (25 mL de 1 mg / mL em PBS), tubulação, tampão de bloqueio (20 mM Tris pH 7,5, 2 mM EDTA, 50 mM NaCl, 0,2 mg / mL BSA, 0,005% Tween-20) <ol><li> Comece colocando 20-25 mL de tampão de bloqueio em um dessecador para remover quaisquer bolhas de ar para etapas posteriores. </li><li> Dê uma lamela PEG-funcionalizados e espalhar 125 de PBS-diluída solução de estreptavidina sobre a superfície. Deixar isso para incubar por 20 minutos enquanto prepara outras partes da câmara, permitindo estreptavidina para ligar a Biotins superfície. </li><li> Corte um pedaço de dupla faced fita para combinar com o tamanho da lâmina de quartzo. Marcar a posição dos furos de tubo na fita com um lápis, para que um esboço da câmara de fluxo podem ser tiradas na fita (1 mg / mL). </li><li> Faça um retângulo de 2 mm de largura em torno dos furos. Isso servirá como um canal de fluxo, por isso não deixe de fazer os lados em linha reta e deixar espaço ao redor da tubulação de entrada e saída. Se desejar, múltiplos canais ou tamanhos diferentes podem ser usados. </li><li> Corte ao longo do contorno desenhado, tornando reto, cortes limpos para garantir que nenhum sobressaia adesivo para o canal. </li><li> Limpe o quartzo, cuidadosamente, com acetona ou etanol para remover adesivo da construção anterior de fluxo de células. </li><li> Encontrar o melhor alinhamento do contorno do canal, remove um dos lados da camada adesiva e coloque cuidadosamente a fita sobre a lâmina de quartzo. Tenha o cuidado de alinhar a fita corretamente, como os buracos de entrada e saída necessidade de permanecer desbloqueados. </li><li> Cortar comprimentos de tubulação para a entrada e saída da célula de fluxo. Isso ajuda a cortar a extremidade do tubo em cerca de um ângulo de 30 ° para que o tubo não vai pressionar plana contra o fundo de câmara. Colocar os tubos em algum tipo de apoio a suspendê-las para fixação fácil a célula de fluxo nas próximas etapas. </li><li> Lavar a lamela estreptavidina revestida abundantemente com água e seque com ar comprimido. Lembre-se que apenas um lado é funcionalizado; ter cuidado para não transformar a lamela mais. Remover o outro lado do suporte de fita e colocar a lâmina de quartzo para a lamela. </li><li> Pressione levemente na lamela a empurrar para fora todo o ar aprisionado no adesivo. Isso ajudará a evitar as bolhas de ar entrando no canal de fluxo. </li><li> Vedação dos lados da câmara com epóxi. Insira o tubo de corte nos orifícios do quartzo e foca no lugar com epóxi. Isso precisa secar por alguns minutos. </li><li> Depois de seco, comece a bloquear a superfície, puxando alguns dos desgaseificados tampão de bloqueio através de um dos tubos. A agulha calibre 21 se encaixa perfeitamente dentro do tubo de 0,76 milímetros. Lavar algumas vezes para remover bolhas de ar, e permitir que a câmara para incubar por pelo menos meia hora. </li></ol> 4. Única molécula-Experimento de replicação Materiais: câmara de fluxo preparados, SYTOX Orange, microscópio TIRF, 532 nm do laser, CCD da câmera, computador com software de aquisição de imagem, Rolling círculo substrato DNA, proteínas de replicação <ol><li> Após a célula de fluxo foi bloqueado, tudo está pronto para começar a experiência única molécula. </li><li> Pegue a célula de fluxo e colocá-lo no palco microscópio. Segure a câmara no lugar com clipes de palco e ter certeza de que o canal de fluxo é posicionado em linha reta ao longo do eixo-y. </li><li> Conecte o tubo de saída de fluxo de células para a bomba de seringa, usando um tubo conector maior diâmetro ou uma agulha. Coloque a entrada em tampão de bloqueio e puxe a seringa para remover qualquer ar no tubo. Um filme suave do tubo de saída vai ajudar a limpar as bolhas de ar aprisionado na célula de fluxo. </li><li> Diluir o modelo de DNA de ações a 25 pM em 1 mL de tampão de bloqueio. Fluxo para a câmara de fluxo moderado para permitir a cobertura boa superfície de DNA. 0,025 mL / min por 30 minutos funciona bem. Isto pode ser variado com base em quantas moléculas de DNA estão na superfície para cada lote de lamelas ou quantos forem desejados para o experimento. </li><li> Uma vez que o DNA se encontra, lavar DNA em excesso com tampão de bloqueio. Lavagem para pelo menos 200 o fluxo de células-volumes para se livrar de todo o DNA livre. </li><li> Começar a desgaseificação do buffer de replicação. Para a E. experimentos de replicação coli, fazer isso a 37 ° C para reduzir o risco de bolhas na câmara de fluxo aquecido. </li><li> Ligue o laser e câmera. O CCD refrigerado precisa atingir a temperatura antes que ele possa ser usado. </li><li> Se realizar a 37 ° C experimento, por sua vez o aquecedor ligado. Certifique-se o objetivo está em contato com a célula de fluxo ou ele vai ser um dissipador de calor mais tarde. </li><li> Após a lavagem e desgaseificação, a reação pode ser preparado. Nucleotídeos Mix, DTT, e SYTOX no buffer de replicação. Em seguida, adicione proteínas e misture delicadamente. </li><li> Fluxo da mistura de reação dentro da célula de fluxo. Esta velocidade do fluxo deve ser suficiente para esticar dsDNA. Para a 2 mm de largura, canal de fluxo 100 mícrons de altura 0,04 mL / min funciona bem. </li><li> Dar tempo para a mistura de entrar na câmara e começar a imagem. Uma boa dica é mover o campo de visão para o lado do canal e foco no material adesivo. Isso irá assegurar que você está perto da superfície para focagem. </li><li> Ajustar a potência do laser, o foco do microscópio, e ângulo TIRF. Manter o baixo consumo de energia para evitar qualquer photocleavage do DNA manchado. Adquira com 1-5 frames / segundo por vários minutos, dependendo da taxa de replicação do DNA. Se desejar, repita para obter trajetórias mais de replicação ou mover para um novo campo para ver mais moléculas. </li><li> Após a mistura de reação é quase vazio, ele é uma boa idéia a fluir com mais buffer com SYTOX para ver os campos de vista do outro. Tomando várias imagens de diferentes moléculas replicado fornece estatísticas para a determinação de processabilidade. </li></ol> 5. Resultados representante Moléculas replicantes ativamente são facilmente visíveis como linhas crescente de DNA manchado. Em nossos experimentos, fluindo 25 pM do substrato M13 dá 100-1000 moléculas em um 60x 125 M x, campo 125 mM de vista (Figura 1). Realização de experimentos de replicação usando o E. proteínas coli replissoma a 37 ° C (veja Materiais para detalhes) dá moléculas replicantes 50-50 por campo de visão. Em concentrações equivalentes dos replissoma T7, que inicia no substrato com muito mais eficiência, observa-se&gt; 70% das moléculas em um campo de replicar. Estas condições produzem uma densidade do produto tão alto que moléculas individuais são difíceis de resolver e analisar, de modo que o T7 experimentos são realizados em concentrações mais baixas de proteína. Análise de dados: Para obter dados de taxa, basta traçar o ponto final do DNA em função do tempo e calcular a inclinação (Figura 2). Para processabilidade, determinar o comprimento total do DNA. Ambos estes números terão de ser convertido em pares de bases. Antes de executar o experimento, você deve saber o tamanho do pixel da câmera para a ampliação adequada. Para a conversão de pares de bases, uma boa estimativa é simplesmente a conversão com base no comprimento de cristalografia de DNA, 2,9 pb / nm. No entanto, o fluxo laminar não será completamente esticar o DNA, para uma calibragem de comprimento DNA deve ser realizado tomando um DNA comprimento conhecido, por exemplo, 48.502 bp λ DNA, anexá-lo à célula de fluxo com um oligo biotinilado e medir seu comprimento SYTOX manchada no a vazão utilizada para o experimento de replicação. Determinar o número de pares de bases / pixel permitirá o cálculo preciso das taxas de replicação e processivities. Levando inúmeras imagens e filmes irá fornecer um grande número de moléculas do produto, permitindo plotagem de taxa e processabilidade distribuições (Figura 2) 1. <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: (De Ref 1.) Um dos desenhos animados) do ensaio de replicação rolling-círculo. (SA, estreptavidina). Levando-vertente de síntese se estende a cauda ligando o círculo e de superfície. A cauda é convertido para dsDNA pela polimerase vertente em atraso e se estendia pelo fluxo laminar. b) Exemplo de campo de visão com SYTOX Laranja e 532 nm de excitação. Pequenas manchas fluorescentes são amarrados, não replicado substratos. Observe o comprimento do extremo dos produtos e ao grande número de produtos por campo (cada célula de fluxo contém&gt; 5000 tais campos). <img src="/files/ftp_upload/1529/1529fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: (adaptado da Ref. 1.) A, b) Kymographs típico de moléculas replicadoras de T7 (a) e E. coli (b) experimentos. c) as trajetórias Endpoint de moléculas de a) e b) plotados em função do tempo. Trajetórias estão equipados com a regressão linear para obter taxas de replicação. Exemplos mostrados são 99,4 bp s -1 e 467,1 bp s -1. d) Comprimento distribuições de produtos de replicação, se encaixam com decaimento exponencial simples para obter processabilidade: 25,3 ± 1,7 kbp (T7), 85,3 ± 6,1 kbp (E. coli). e) Taxa de distribuições de trajetórias única molécula, se encaixam com gaussianas único. Significa: 75,9 ± 4,8 s -1 bp (T7), 535,5 ± 39 bp s -1 (E. coli).

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	<li>Tanner, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+single-molecule+observation+of+rolling-circle+DNA+replication.">Real-time single-molecule observation of rolling-circle DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 37, e27 (2009).</li><li>Tabor, S., Huber, H. E., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+thioredoxin+confers+processivity+on+the+DNA+polymerase+activity+of+the+gene+5+protein+of+bacteriophage+t7.">Escherichia coli thioredoxin confers processivity on the DNA polymerase activity of the gene 5 protein of bacteriophage t7.</a> J Biol Chem. 262, 16212-16223 (1987).</li><li>Sofia, S. J., Premnath, V. V., Merrill, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(ethylene+oxide)+grafted+to+silicon+surfaces:+Grafting+density+and+protein+adsorption.">Poly(ethylene oxide) grafted to silicon surfaces: Grafting density and protein adsorption.</a> Macromolecules. 31, 5059-5070 (1998).</li><li>Tanner, N. A., van Oijen, A. M., Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+observation+of+prokaryotic+DNA+replication.">Single-molecule observation of prokaryotic DNA replication.</a> DNA replication: Methods and protocols. 521, 397-410 (2009).</li><li>Hamdan, S. M., Loparo, J. J., Takahashi, M., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+DNA+replication+loops+reveal+temporal+control+of+lagging-strand+synthesis.">Dynamics of DNA replication loops reveal temporal control of lagging-strand synthesis.</a> Nature. 457, 336-339 (2009).</li><li>Heller, R. C., Marians, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+fork+reactivation+downstream+of+a+blocked+nascent+leading+strand.">Replication fork reactivation downstream of a blocked nascent leading strand.</a> Nature. 439, 557-562 (2006).</li></ol>

Um crítico de controlo está a analisar o efeito da mancha, SYTOX Orange, sobre as proteínas de replicação de interesse. Uma maneira simples de fazer isso é realizar o experimento de replicação na célula de fluxo, como descrito, mas com a omissão de SYTOX. Após a mistura de reação fluiu através da câmara, adicionar tampão com SYTOX para manchar DNA e examinar a distribuição do comprimento das moléculas replicado. Alternativamente, reações granel padrão pode ser utilizado para verificar qualquer efeito sobre a taxa de SYTOX replicação e eficiência. O experimento aqui descrito utiliza apenas um canal de fluxo único. Isto pode ser alterado facilmente através da criação de multi-canal de câmaras de fluxo ou usando PDMS ou similar dispositivos microfluídicos. Aumentar o número de canais facilita muito triagem das concentrações de proteínas, os mutantes, ou moléculas de inibidor e aumenta a rapidez da coleta de dados de replicação. Como mencionado, realizamos a E. experimentos de replicação coli a 37 ° C utilizando uma casa construída em alumínio aquecedor de célula de fluxo, um elemento de aquecimento resistivo (aquecedor de cartucho) e fonte de alimentação variável. Isto dá boa estabilidade de temperatura e evita a compra de um aquecedor objetivo. Para calibrar o aquecedor, nós simplesmente um furo no centro de um alto fluxo de quartzo celular, inserido um termopar no canal de fluxo e fluiu buffer como normal. Medir o fluxo de temperatura tampão celular em tensões crescentes permite aquecimento precisas.

T7 Replicação: 40 mM Tris pH 7,5, 50 mM glutamato de potássio, 10 mM de cloreto de magnésio, 100 mg / mL BSA, com 5 mM ditiotreitol, 600 mM dNTPs, 300 mM ATP, 300 mM CTP, e 15 nM SYTOX Laranja adicionado imediatamente antes uso. Proteínas adicionadas como: 5 nM gp4 (hexâmero), 40 nM polimerase (1:1 GP5: thioredoxin), 360 nm gp2.5 1,5. E. coli replicação: 50 mM HEPES pH 7,9, 12 mM de acetato de magnésio, 80 mM de cloreto de potássio, 100 mg / mL BSA com 10 mM ditiotreitol, 40 mM dNTPs, 200 rNTPs mM, e 15 nM SYTOX Laranja adicionado imediatamente antes do uso. Proteínas adicionadas como: 30 nM DnaB (hexâmero), 180 nM DNAC (monômero), 30 nM αεθ, 15 nM 2 τ γ uma δδ&#39;χψ ou τ 3 δδ&#39;χψ, 30 β nM (dimer), 300 nM DnaG, 250 nM SSB (tetrâmero), 20 nM Pria, 40 nM PRIB, 320 nM Pric, 480 nM DNAT 1,6

visualizing single-molecule dna replication with fluorescence microscopy

Nós descrevemos um simples microscopia de fluorescência baseada em método em tempo real para observar a replicação do DNA ao nível de moléculas individuais. A circular, modelo de DNA bifurcada é anexado a uma lamela de vidro funcionalizados e replicados extensivamente após a introdução das proteínas de replicação e nucleotídeos (Figura 1). O crescimento do produto DNA dupla fita (dsDNA) é estendido com fluxo laminar e visualizados usando um corante intercalando. Medir a posição do fim de DNA crescente em tempo real permite a determinação precisa da taxa de replicação (Figura 2). Além disso, o comprimento dos produtos de DNA concluído relatórios sobre a processabilidade de replicação. Este experimento pode ser realizado muito facilmente e rapidamente e requer apenas um microscópio de fluorescência com uma câmera razoavelmente sensíveis.

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Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

Este protocolo demonstra uma simples molécula única técnica de microscopia de fluorescência para a visualização de replicação do DNA por replisomes individuais em tempo real.

Replicação de DNA visualizar Único molécula com microscopia de fluorescência

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

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