I. 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר הטכנולוגיה NanoDrop מבוסס על מערכת שימור חדשנית מדגם המשתמשת מתח הפנים להחזיק למדוד דגימות microvolume בין שני כנים אופטי ללא שימוש cuvettes או נימים. 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר משתמשת בטכנולוגיה זו כדי למדוד בקלות ובמהירות 0.5-2 טיפות μL של חלבונים, DNA, RNA, ביומולקולות אחרים. יכולת זו הפך חשוב יותר ויותר בטכניקות מולקולריות להתפתח ללא הרף להשתמש בכמויות קטנות של החומר לניתוח. האידיאל ספקטרופוטומטר microvolume התנאים שבהם מדגם מוגבל. עם זאת, קלות השימוש, מחזור מדידה מהיר, טווח הריכוז נרחב גם להפוך ספקטרופוטומטר המתאים כאשר כמויות גדולות של מדגם זמינים. מחזור המדידה היא גם הקטינה באופן משמעותי, מסייעים למדענים ברחבי workflows להגביר את היעילות שלהם. Microsample ממוקם ישירות על גבי משטח איתור טור נוזל נוצר בין הקצוות של סיבים אופטיים על ידי מתח הפנים. זה טור נוזל צורות נתיב אופטי אנכי. פלאש קסנון מנורה מספק את מקור האור ספקטרומטר ניצול מערך ליניארי CCD משמש כדי לנתח את האור שעובר דרך המדגם. הסרת התקנים ההכלה המסורתית כגון cuvettes מהמערכת יש מספר יתרונות: כמויות קטנות מאוד של המדגם יש צורך מדידה, ניקוי פשוט דורש לנגב את משטחי אופטי עם מעבדה לנגב, ואת אורך הדרך ניתן לשנות בזמן אמת במהלך המדידה. 2000c NanoDrop קובע את אורך מסלול אופטימלי אוטומטית (1 מ&quot;מ עד 0.05 מ&quot;מ), מתן מגוון רחב ביותר של מדידות ריכוז חלבון אפשרי בלי דילולים. על ידי קיצור אורך הדרך, ריכוזים גבוהים יותר של החלבון ניתן למדוד. פעולה זו מסירה ביעילות את הצורך לבצע דילולים עבור דגימות חלבון ביותר. לדוגמה, 2000c NanoDrop יכולים למדוד ריכוזי BSA גבוה ככל 400 מ&quot;ג / מ&quot;ל. 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר הוא ספקטרופוטומטר ספקטרום מלא למדידת ספיגת של DNA, RNA, חלבונים, ביומולקולות אחרים. זה פרוטוקול וידאו תתמקד המדידה של חלבונים. השנייה. ריכוז חלבון Microvolume קביעת שימוש A280 מדידות ספיגת א עקרון A280 מדידות השיטה A280 חלבון ישים מטוהרים חלבונים המכילים טריפטופן, טירוזין, פנילאלנין או שאריות ציסטאין-ציסטאין אג&quot;ח disulphide ואת ספיגת בתערוכה 280 ננומטר. שיטה זו משתמשת בערך A280 ספיגת בשילוב עם או מקדם הכחדה המונית או מקדם הכחדה טוחנת כדי לחשב את הריכוז של חלבון מטוהרים. היתרון של A280 מדידה ישירה היא שהדור של עקומת סטנדרט אינה נדרשת כדי לקבוע ריכוז החלבון. אם המדגם הוא פתרון חלבון uncharacterized, lysate התא, או לחלץ חלבון גולמי, לאחר מכן באמצעות אחד מוגדר מראש שיטות colorimetric זמין על 2000/2000c NanoDrop, כגון BCA, פירס 660 ננומטר, ברדפורד, מבחני לורי, היא מומלץ. ב Microvolume חלבון A280 מדידות - אתחול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את היישום A280 חלבון מהתפריט הראשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את סוג המדגם כדי להימדד מהרשימה הנפתחת. הגדרת ברירת המחדל היא המומלצת ביותר תערובות חלבון ידוע שבו Abs 1 = 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל. אם מדידת חלבון מזוכך מאופיין בעבר, אז גם ההכחדה ההמונית מקדם או מקדם הכחדה טוחנת ועל משקל מולקולרי ניתן להזין על מנת לקבוע את ריכוז החלבון באופן מדויק יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את יחידות הריכוז מהרשימה הנפתחת. </li></ol> ג A280 Microvolume חלבון מדידות - blanking <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקמת ריק באמצעות המאגר המתאים. חשוב להשתמש חיץ שבו החלבון הוא מושעה. המאגר משמש את ה-pH צריך להיות אותו כוח יוניים דומה כפתרון המדגם. הערה: מאגרים Ripa לתרום ספיגת יותר מדי על 280 ננומטר ולכן הם בקנה אחד עם מדידות חלבון ישיר A280. עבור חלבונים המרחפים חיץ Ripa, מומלץ ריכוז חלבון ייקבע באמצעות חיץ תואם Ripa assay colorimetric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 2 μL הפתרון המתאים blanking על הדום התחתונה, להוריד את היד ולחץ על ריק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגבו את הפתרון ריק מן כנים העליון והתחתון באמצעות מעבדה יבש לנגב. </li></ol> ד A280 Microvolume חלבון מדידות מדידת שיקולים חשוב: ההומוגניות של המדגם הוא מאודחשוב מאז נפח קטן כזה נמדדת. על מנת להבטיח כי הדגימות הן הומוגניות, בעדינות אך ביסודיות לערבב את דגימות מייד לפני נטילת aliquot למדידה. הימנע מציגה בועות כאשר ערבוב pipetting. בשל השתנות של מתח הפנים בין חלבונים שונים, אנו ממליצים טעינת 2 μL של דגימות כדי להבטיח בטור המתאים. השתמש תמיד נמוך טפטפת טיפים השמירה. כדי לטעון מדגם, גע עם קצה פיפטה אל פני השטח הדום אופטי נמוכה תוך גירוש פתרון כדי למנוע את הפתרון מתוך דבקות החיצוני של קצה פיפטה. לגרש פחות הסכום המלא של המדגם כדי למנוע את ההתפרצות מבוא של בועות במדגם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן מזהה מדגם בשדה המתאים, לטעון 2 μL של המדגם הראשון כמתואר עבור מדוד את ריק ולחץ. Aliquot 2μL טרי המדגם אמור לשמש עבור כל מדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הדוגמה כנים העליון והתחתון באמצעות מעבדה יבש לנגב. </li></ol> ה Microvolume חלבון A280 מדידות ניקוי רגילה, נטולת סיבים, במעבדה לנגב הוא לעתים קרובות מספיק לניקוי כנים אופטי בין המדידות. ו ביצוע מדידות A280 חלבון שפוץ פתרונות ריאגנטים המכיל חומרים פעילי שטח יכול uncondition את הכן משטחי מדידה לאורך זמן, למנוע את עמודת נוזל דוגמת הטופס. השטחת אגל על ​​כן התחתונה מעיד על המשטח האופטי להיות מותנית. אם מאפייני פני השטח נפרץ, שפוץ כנים חשוב לוודא טור היווצרות המדגם. במקרה זה, בעירום משטחים אופטיים למחות נמרצות באמצעות מעבדה או להשתמש במגרש Pedestal NanoDrop שפוץ (PR-1) על פי ההנחיות. ג. Microvolume ריכוז חלבון באמצעות קביעת מבחני Colorimetric א עקרון הגילוי colorimetric ספקטרופוטומטר 2000c NanoDrop יכול לשמש גם כדי למדוד פתרונות חלבון uncharacterized, lysates תא, תמציות חלבון גולמי באמצעות מבחני colorimetric. שיטות Colorimetric שיטות עקיפות הכרוכות האינטראקציה של צבע עם למרכיב החלבוני של המדגם כדי לייצר מורכבות חדשה סופג אור בטווח אורך גל הנראה. ספקטרופוטומטר 2000c NanoDrop יש מספר מוגדר מראש מבחני colorimetric כולל BCA, פירס 660, ברדפורד, ושיטות לורי. Assay BCA יהיה הפגינו כמו assay דוגמה colorimetric באמצעות ספקטרופוטומטר microvolume. (צילום מסך) Assay (חומצה Bicinchoninic) BCA היא שיטה colorimetric נפוץ המשמש לעתים קרובות לפתרונות חלבון וחלבונים לדלל בנוכחותם של רכיבי כי יש ספיגת UV משמעותית (280 ננומטר). בניגוד לשיטה A280 חלבון, שיטת חלבון BCA דורש עקומת סטנדרט להיווצר לפני חלבון ריכוזי מדגם ניתן למדוד. השיטה משתמשת חומצה bicinchoninic (BCA) כמו מגיב לגילוי. CU-BCA Chelate נוצרו בנוכחות חלבון נמדד ב 562 ננומטר מנורמל ב 750 ננומטר. ב Microvolume BCA מדידות Assay BCA הכנה Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריאגנטים הנדרש כלולים בערכה סוכן הפחתת תואם (Thermo Scientific חתול פירס לא 23250..): מגיב BCA A, B BCA מגיב, מגיב תאימות, חיץ הכינון, ו אלבומין (BSA) סטנדרטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את כל החלבונים ידוע סטנדרטים חלבון לטמפרטורת החדר ומערבבים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מספיק מגיב עובד טרי הסטנדרטים דגימות כדי להימדד באמצעות יחס של 50:1 מגיב: B </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור assay המיקרו, השתמש יחס של 1:01 מגיב הפועלים המדגם. הוסף 10 μL לעבוד מגיב על צינור אחד עם צינורות מספיק כדי לכסות את כל דגימות סטנדרטים. עבור assay גבוהה בטווח, השתמש יחס של 20:01 מגיב הפועלים המדגם. הוספת 190 μL לעבוד מגיב על צינור אחד עם צינורות מספיק כדי לכסות את כל דגימות סטנדרטים. עיין BCA פירס ערכת ספרות כדי לקבוע איזה יחס מתאים דגימות שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μL של תקן או מדגם צינור שכל אחת מהן מכילה מגיב. מערבבים היטב על ידי בעדינות vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצינורות על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תגובות לאזן לטמפרטורת החדר (~ 10 דקות). </li></ol> ג Microvolume BCA מדידות Assay יצירת Curve רגילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את שיטת חלבון BCA מהתפריט הראשי. אם החלון אימות גל מופיע, להבטיח הזרוע היא כלפי מטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את הערכים עבור כל הריכוז תקן בטבלה החלונית השמאלית. התוכנה מאפשרת עבור ההפניה ועד 7 additסטנדרטים לאומיים. וההפניה / או סטנדרטים צריך להימדד משכפל. הערה: הדרישה המינימלית עבור הדור עקומת הסטנדרטי הוא המדידה של שני סטנדרטים או מדידת ההתייחסות אפס אחד לפחות סטנדרטי. מומלץ תקנים נוספים שייכללו לפי הצורך כדי לכסות את הריכוז הצפוי בטווח assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקמת ריק. ריק עבור מבחני colorimetric הוא deionized בדרך כלל H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 2 μL של DH 2 O על הדום התחתונה, להוריד את היד ולחץ על ריק. רק אחד ריק יש צורך לכסות את כל המדידות הבאות של הפניה סטנדרטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקים את הפניה על ידי pipetting aliquot 2 μL המכיל רק מגיב עבודה חיץ עם חלבון לא על רגל התחתון. מנמיכים את הזרוע למדוד לחץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בכרטיסייה התקנים, לסמן את רמת המבוקש פיפטה 2 μL ברמה הרצויה על בסיס התחתון. מנמיכים את הזרוע למדוד לחץ. חזור על התהליך עבור כל הסטנדרטים. הקפד למדוד את כל הסטנדרטים לפני דגימות מדידה. כדי להציג את עקומת סטנדרט לחץ צפה Curve רגיל. </li></ol> ד Microvolume BCA מדידות Assay 2 מדידות חלבון μL <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי כל התקנים נמדדו, לחץ על הכפתור דוגמאות. הזן את מזהה המדגם. טען 2 μL של המדגם על המעמד התחתון לחץ מדוד. Aliquot טרי 2 μL המדגם אמור לשמש עבור כל מדידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגבו את הדוגמה כנים העליון והתחתון באמצעות מעבדה יבש לנגב. </li></ol> ה Microvolume מדידות BCA Assay ניקוי שפוץ בצע ניקוי שפוץ כמתואר A280 מדידות ישירות ספיגת. נציג תוצאות: ריכוז Microvolume נחישות חלבון מתבצע על ידי מדידה או A280 ישיר או עקיף assay colorimetric. הדוגמה A280 המדידה קובעת ריכוז חלבון על בסיס מקדם הכחדה של החלבון של עניין. הדוגמה colorimetric BCA assay קובע ריכוז חלבון מבוססת של עקומת תקן של ריכוזי חלבון ידועים.

<ol>
	<li>Aitken, A., Learmonth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+determination+by+UV+absorption.">Protein determination by UV absorption.</a> , (1996).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).</li><li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Coomassie+Brilliant+Blue+G250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrilamide+gels.">Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. , (2006).</li><li>Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. u. j. i. m. o. t. o., Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein.">Quantitation of protein.</a> Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li></ol>

המחברים הם עובדים של תרמו פישר סיינטיפיק המייצרת ריאגנטים וכלים המשמשים במאמר זה.

Quantitation Microvolume משתמש המתח הפנימי משטח המאפיינים של מדגם כדי ליצור עמודה נוזל בין שני משטחים המדידה. היעדר של התקן בלימה, המאפשר אורך הדרך לשנות בזמן אמת, למעשה מבטל את הצורך לבצע דילולים. יכולת זו מגדילה באופן דרמטי את הטווח הדינמי של ריכוזי חלבון, כמו גם את מהירות המדידה. באמצעות כמויות מינימליות של המדגם, מספר רב של דוגמאות ניתן לנתח במהירות ובאופן מדויק, מאפשרת למדענים לבצע מדידות יותר להשיג שליטה באיכות טובה יותר. בנוסף, ובמידת הצורך, דגימות יקרות ניתן לשחזר לאחר לקיחת המדידה. כאשר בנפחים קטנים כאלה נמדדים, מדגם הומוגניות הוא מאוד חשוב כדי למנוע טעויות דגימה. נמוכה פיפטה טיפים שמירה תמיד צריך לשמש עבור דגימות העמסה את הטיפים צריך להיות שונה בין מדגם משכפל. משטחים הדום יש לנקות כראוי מותנה כדי להבטיח את התוצאות המדויקות ביותר. לבסוף, ספקטרופוטומטר microvolume הוא אידיאלי כאשר המדגם הוא מוגבל, לעומת זאת, קלות שימוש, מהירות, טווח דינמי רחב של הספקטרומטר להפוך אותו מתאים כאשר המדגם הוא בשפע.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratory wipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>23250</td><td>Reducing agent compatible</td></tr><tr><td>PR-1 Reconditioning Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microvolume protein concentration determination using the nanodrop 2000c spectrophotometer

לספקטרופוטומטריה מסורתית דורשת הצבת דגימות לתוך cuvettes או נימים. זה בדרך כלל לא מעשי בשל כרכים מדגם מוגבל לעתים קרובות לניתוח חלבונים. המדעית Thermo NanoDrop 2000c ספקטרופוטומטר פותרת בעיה זו באמצעות מערכת שימור חדשנית מדגם המכיל דגימות microvolume בין שני משטחים מדידת מתח פנים באמצעות תכונות של נוזלים, המאפשר כימות של דגימות בכמויות נמוכות ככל μL 0.5-2. חיסול cuvettes או נימים מאפשר שינויים בזמן אמת אורך הדרך, אשר מפחית את זמן המדידה תוך הוגדל הטווח הדינאמי של ריכוזי חלבון זה ניתנת למדידה. הצורך דילולים מסולק גם, ההכנות כימות מדגם קל יחסית כמו משטחי מדידה יכול להימחק פשוט עם מעבדה לנגב. מאמר זה מציג וידאו שינויים בשיטות מסורתיות ריכוז חלבון נחישות עבור כימות של כמויות microvolume של חלבון באמצעות A280 קריאות ספיגת או assay colorimetric BCA.

Watch this Scientific Journal Video about Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer at JoVE.com

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

דגימות Microvolume הם לכמת ידי מערכת ספקטרופוטומטר המשתמשת מתח הפנים הטבעי לשמור דגימות ללא שימוש cuvettes או נימים. טווח דינמי של ריכוזי חלבון מהירות שבה הם יכולים להימדד הם גדל מאוד בשיטה זו.

ריכוז חלבון Microvolume קביעת באמצעות 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

<a class="grey_button" href="/video/1770">&#x4E2D;&#x6587;</a><a class="grey_button" href="/video/1920">Deutsch</a> <a class="grey_button" href="/video/1921">Fran&#231;ais</a> <a class="grey_button" href="/video/1922"> Espa&ntilde;ol </a> <a class="grey_button" href="/video/2187"> &#x65E5;&#x672C;&#x8A9E; </a>

microvolume-protein-concentration-determination-using-nanodrop-2000c

Research

JoVE Journal

Biology

113.9K Views.  Thermo Scientific NanoDrop Products. 中文Deutsch Français Español 日本語 

Video: Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average result masking the rich single cell behavior within a complex population. Single cell protein detection and quantification technologies have made a remarkable impact in recent years. Here we describe a practical and flexible single cell analysis platform based on addressable droplet microarrays. This study describes how the absolute copy numbers of target proteins may be measured with single cell resolution. The tumor suppressor p53 is the most commonly mutated gene in human cancer, with more than 50% of total cancer cases exhibiting a non-healthy p53 expression pattern. The protocol describes steps to create 10 nL droplets within which single human cancer cells are isolated and the copy number of p53 protein is measured with single molecule resolution to precisely determine the variability in expression. The method may be applied to any cell type including primary material to determine the absolute copy number of any target proteins of interest.

Here we present addressable droplet microarrays (ADMs), a droplet array based method able to determine absolute protein abundance in single cells. We demonstrate the capability of ADMs to characterize the heterogeneity in expression of the tumor suppressor protein p53 in a human cancer cell line.

ספירת חלבונים בתאים יחיד עם Droplet למיעון מיקרו-מערכים

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Cancer Research

Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma - mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.

Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.

התקנים עבור כמותי Metalloproteomic ניתוח באמצעות גודל הרחקת ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

Chemistry

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Bioengineering

UV-Vis Spectroscopic Characterization of Nanomaterials in Aqueous Media

The physicochemical characterization of nanomaterials (NMs) is often an analytical challenge, due to their small size (at least one dimension in the nanoscale, i.e. 1&#8211;100 nm), dynamic nature, and diverse properties. At the same time, reliable and repeatable characterization is paramount to ensure safety and quality in the manufacturing of NM-bearing products. There are several methods available to monitor and achieve reliable measurement of nanoscale-related properties, one example of which is Ultraviolet-Visible Spectroscopy (UV-Vis). This is a well-established, simple, and inexpensive technique that provides non-invasive and fast real-time screening evaluation of NM size, concentration, and aggregation state. Such features make UV-Vis an ideal methodology to assess the proficiency testing schemes (PTS) of a validated standard operating procedure (SOP) intended to evaluate the performance and reproducibility of a characterization method. In this paper, the PTS of six partner laboratories from the H2020 project ACEnano were assessed through an interlaboratory comparison (ILC). Standard gold (Au) colloid suspensions of different sizes (ranging 5&#8211;100 nm) were characterized by UV-Vis at the different institutions to develop an implementable and robust protocol for NM size characterization.

This study presents the benchmarking results for an interlaboratory comparison (ILC) designed to test the standard operating procedure (SOP) developed for gold (Au) colloid dispersions characterized by ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), amongst six partners from the H2020 ACEnano project for sample preparation, measurement, and analysis of the results.

אפיון ספקטרוסקופי UV-Vis של ננו-חומרים במדיה מימית

The physicochemical characterization of nanomaterials (NMs) is often an analytical challenge, due to their small size (at least one dimension in the ...

Engineering

הרחבת טווח הריכוז של ניתוח פוטומטריית מסה באמצעות מיקרופלואידיקה

Analysis of Protein Complex Formation at Micromolar Concentrations by Coupling Microfluidics with Mass Photometry

Mass photometry is a versatile mass measurement technology that enables the study of biomolecular interactions and complex formation in solution without labels. Mass photometry is generally suited to analyzing samples in the 100 pM-100 nM concentration range. However, in many biological systems, it is necessary to measure more concentrated samples to study low-affinity or transient interactions. Here, we demonstrate a method that effectively expands the range of sample concentrations that can be analyzed by mass photometry from nanomolar to tens of micromolar. 
In this protocol, mass photometry is combined with a novel microfluidics system to investigate the formation of protein complexes in solution in the micromolar concentration range. With the microfluidics system, users can maintain a sample at a desired higher concentration followed by dilution to the nanomolar range - several milliseconds prior to the mass photometry measurement. Due to the speed of the dilution, data is obtained before the equilibrium of the sample has shifted (i.e., dissociation of the complex). 
The technique is applied to measure interactions between an immunoglobulin G (IgG) antibody and the neonatal Fc receptor, showing the formation of high-order complexes that were not quantifiable with static mass photometry measurements. 
In conclusion, the combination of mass photometry and microfluidics makes it possible to characterize samples in the micromolar concentration range and is proficient in measuring biomolecular interactions with weaker affinities. These capabilities can be applied in a range of contexts - including the development and design of biotherapeutics - enabling thorough characterization of diverse protein-protein interactions.

מחבר זרקור: אפיון אינטראקציות חלבונים בעלי זיקה נמוכה בתמיסה באמצעות טכנולוגיית MassFluidix

This protocol combines mass photometry with a novel microfluidics system to investigate low-affinity protein-protein interactions. This approach is based on the rapid dilution of highly concentrated complexes in solution, which enables low-affinity measurements and broadens the applicability of mass photometry.

ניתוח היווצרות קומפלקס חלבונים בריכוזים מיקרומולרים על ידי צימוד מיקרופלואידיקה עם פוטומטריית מסה

Mass photometry is a versatile mass measurement technology that enables the study of biomolecular interactions and complex formation in solution without ...

Biochemistry

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop Microvolume quantitation של חומצות גרעין

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

קביעת ריכוז חומצות גרעין וחלבונים שימוש Micro בנפח Bio-spec ספקטרופוטומטר Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually untranslated &#8212; first exons. Bcrp1 (Abcg2), the murine orthologue of the ABC transporter Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), has at least four alternative promoters that are designated by the corresponding four alternative first exons produced: E1U, E1A, E1B, and E1C. Herein, in-silico protocols are presented to predict alternative promoter usage for Bcrp1. Furthermore, reporter assay methods are described to produce reporter constructs for alternative promoters and to determine the functionality of putative promoters upstream of the alternative first exons that are identified.

With the murine ABC transporter Bcrp1 (Abcg2) as an example, in-silico protocols are presented to detect alternative promoter usage in genes expressed in mouse tissues, and to evaluate the functionality of the alternative promoters identified using reporter assays.

ריכוז חלבון Microvolume קביעת באמצעות 2000c NanoDrop ספקטרופוטומטר

Transcript

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ספירת חלבונים בתאים יחיד עם Droplet למיעון מיקרו-מערכים

התקנים עבור כמותי Metalloproteomic ניתוח באמצעות גודל הרחקת ICP-MS

הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

אפיון ספקטרוסקופי UV-Vis של ננו-חומרים במדיה מימית

ניתוח היווצרות קומפלקס חלבונים בריכוזים מיקרומולרים על ידי צימוד מיקרופלואידיקה עם פוטומטריית מסה

ניתוח היווצרות קומפלקס חלבונים בריכוזים מיקרומולרים על ידי צימוד מיקרופלואידיקה עם פוטומטריית מסה

ניתוח היווצרות קומפלקס חלבונים בריכוזים מיקרומולרים על ידי צימוד מיקרופלואידיקה עם פוטומטריית מסה

NanoDrop Microvolume quantitation של חומצות גרעין

קביעת ריכוז חומצות גרעין וחלבונים שימוש Micro בנפח Bio-spec ספקטרופוטומטר Nano

שיטות לגלות אלטרנטיבי שימוש יזם ותקנת תעתיק של Murine Bcrp1