I. O NanoDrop 2000c Espectrofotômetro NanoDrop tecnologia é baseada em um sistema inovador de retenção de amostra que usa a tensão de superfície para segurar e medir amostras microvolume entre dois pedestais óptica sem o uso de tinas ou capilares. O NanoDrop 2000c espectrofotômetro utiliza esta tecnologia de forma rápida e facilmente medir gotas 0,5-2 mL de proteínas, DNA, RNA, e outras biomoléculas. Esta capacidade tornou-se cada vez mais importante como técnicas moleculares evoluir continuamente para usar pequenas quantidades de material para análise. O ideal espectrofotômetro microvolume para as condições em que amostra é limitada. No entanto, a facilidade de uso, ciclo de medição rápida e, e extensa faixa de concentração também fazer o espectrofotômetro adequado quando grandes quantidades de amostra estão disponíveis. O ciclo de medição também é bastante reduzido, ajudando os cientistas a aumentar a eficiência em todo o seu fluxo de trabalho. O microsample é colocado diretamente em cima da superfície de detecção e uma coluna de líquido é criado entre as extremidades das fibras ópticas pela tensão superficial. Esta coluna de líquido forma um caminho vertical óptico. A lâmpada de flash xenon fornece a fonte de luz e um espectrômetro utilizando um sensor CCD linear é utilizado para analisar a luz que passa através da amostra. Remoção de dispositivos de contenção tradicionais, como tinas do sistema tem várias vantagens: pequenas quantidades de amostras são necessários para a medição, a limpeza requer simplesmente limpando as superfícies ópticas com um laboratório de wipe, eo comprimento do caminho pode ser alterado em tempo real durante a medição. O 2000c NanoDrop determina o comprimento do caminho ideal automaticamente (1 mm a 0,05 mm), proporcionando a mais ampla gama de medições de concentração de proteína possível sem diluições. Encurtando o comprimento do caminho, maiores concentrações de proteína pode ser medido. Isso efetivamente remove a necessidade de realizar diluições de amostras mais proteína. Por exemplo, o 2000c NanoDrop pode medir as concentrações de BSA tão alto quanto 400 mg / mL. O NanoDrop 2000c espectrofotômetro é um espectrofotômetro de espectro total para medir a absorção de DNA, RNA, proteínas e outras biomoléculas. Este protocolo de vídeo irá focar-se na medição de proteínas. II. Microvolume determinação da concentração de proteína A280 Usando as medidas de absorbância a. Princípio da A280 Medições O método A280 Protein é aplicável a proteínas purificadas que contêm triptofano, tirosina, fenilalanina resíduos ou obrigações Cisteína Cisteína dissulfeto e exibem absorbância a 280 nm. Este método utiliza o valor de absorbância A280 em combinação com o coeficiente de extinção a massa ou o coeficiente de extinção molar para calcular a concentração da proteína purificada. A vantagem de medições diretas A280 é que a geração de uma curva padrão não é necessário para determinar a concentração de proteína. Se a amostra é uma solução de proteína descaracterizados, lisado celular, ou extrato de proteína bruta, em seguida, usando um dos métodos pré-configurados colorimétrico disponível no 2000/2000c NanoDrop, como BCA, 660 Pierce nm, Bradford, Lowry e ensaios, é recomendado. b. Microvolume Protein A280 Medidas - Startup <ol><li> Selecione o aplicativo A280 Protein a partir do menu principal. </li><li> Selecione o tipo de amostra a ser medida a partir da lista drop-down. A configuração padrão é recomendado para a maioria das misturas de proteína desconhecida, na qual um Abs = 1 mg / mL. Se a medição de uma proteína purificada previamente caracterizada, então, ou o coeficiente de extinção em massa ou coeficiente de extinção molar e massa molecular pode ser inserida para determinar a concentração de proteína mais precisamente. </li><li> Escolha as unidades de concentração a partir da lista drop-down. </li></ol> c. Proteína Microvolume Medidas A280 - Blanking <ol><li> Estabelecer um espaço em branco usando um tampão apropriado. É importante usar o buffer em que a proteína está suspenso. O buffer usado deve ser o mesmo pH e de uma força semelhante iônicos como a solução amostra. Nota: buffers RIPA contribuir absorbância muito em 280 nm e, portanto, incompatível com as proteínas direta A280. Para proteínas suspensos em tampão RIPA, recomenda-se a concentração de proteína ser determinado usando um tampão RIPA ensaio colorimétrico compatível. </li><li> Pipeta mL 2 da solução adequada para a estampagem pedestal baixo, abaixe o braço e clique em branco. </li><li> Limpe a solução em branco, os pedestais inferior e superior utilizando um laboratório seco wipe. </li></ol> d. Proteína Microvolume Medidas A280 medição Considerações importantes: A homogeneidade da amostra é extremamenteimportante, pois um volume tão pequeno está sendo medido. Para garantir que as amostras são homogêneas, suavemente, mas misturar as amostras imediatamente antes de tomar uma alíquota para a medição. Evitar a introdução de bolhas quando mistura e pipetagem. Devido à variabilidade da tensão superficial entre proteínas diferentes, recomendamos carregar 2 mL de amostras para garantir a formação de coluna adequada. Sempre usar ponteiras de baixa retenção. Para carregar uma amostra, toque a ponta da pipeta na superfície pedestal inferior óptico durante a expulsar a solução para evitar a solução de aderir a parte externa da ponta da pipeta. Expelir menos do que o valor total da amostra para evitar blowout e introdução de bolhas na amostra. <ol><li> Digite um ID da amostra no campo apropriado, carga 2 mL da primeira amostra como descrito para a Medida em branco e clique em. Uma nova porção 2μL da amostra deve ser usado para cada medição. </li><li> Retirar a amostra da pedestais inferior e superior utilizando um laboratório seco wipe. </li></ol> e. Microvolume Protein A280 Medidas de limpeza Um ordinário, que não solte fiapos de laboratório, limpe freqüentemente é suficiente para a limpeza do pedestais óptica entre as medidas. f. Fazendo Protein A280 Medidas Recondicionamento Soluções e reagentes contendo surfactantes pode descondicionar as superfícies pedestal de medição ao longo do tempo, impedindo que a coluna de líquido da amostra para se formar. Um achatamento da gota na parte inferior do pedestal é um indicativo da superfície óptica tornando-se incondicionada. Se as propriedades da superfície ter sido comprometida, os pedestais de recondicionamento é importante para garantir a formação de coluna de amostra. Se isso ocorrer, buff as superfícies ópticas vigorosamente usando limpe laboratório ou uso Compound Pedestal NanoDrop Recondicionamento (PR-1) como indicado. III. Microvolume determinação da concentração de proteína através de teste colorimétrico a. Princípio da detecção colorimétrica O NanoDrop espectrofotômetro 2000c também pode ser usado para medir soluções de proteína descaracterizados, lisados ​​celulares, e extratos de proteína bruta através de teste colorimétrico. Métodos colorimétricos são métodos indiretos que envolvem a interação de um corante com o componente de proteína da amostra para a produção de um novo complexo que absorve luz na faixa de comprimento de onda visível. O NanoDrop espectrofotômetro 2000c tem vários pré-configurados, incluindo ensaios colorimétricos BCA, 660 Pierce, Bradford, e métodos de Lowry. O ensaio BCA será demonstrado como um ensaio colorimétrico exemplo usando um espectrofotômetro microvolume. (Screenshot) O BCA ensaio (Ácido Bicinchoninic) é um método colorimétrico comum muitas vezes usado para diluir soluções de proteína e proteínas na presença de componentes que têm UV significativa (280 nm) absorbância. Ao contrário do método A280 Protein, a Proteína método BCA exige que uma curva padrão antes de ser gerado concentração de proteínas da amostra pode ser medido. O método utiliza ácido bicinchoninic (BCA) como reagente de detecção. O quelato Cu-BCA formado na presença de proteínas é medido em 562 nm e 750 nm em normalizado. b. Microvolume Assay BCA Medidas Preparação de Ensaio BCA <ol><li> Os reagentes necessários estão contidos no kit agente redutor compatível (Thermo Scientific gato Pierce não 23250..): BCA reagente A, B BCA reagente, reagente de compatibilidade, tampão de reconstituição, e albumina (BSA) padrões. </li><li> Equilibrar todas as proteínas desconhecidas e padrões de proteína à temperatura ambiente e misture bem. </li><li> Prepare o suficiente reagente de trabalho nova para os padrões e amostras a medida usando uma proporção de 50:1 de reagente A: B </li><li> Para o ensaio micro, use uma proporção de 1:1 do reagente de trabalho para amostra. Adicionar 10 mL de Reagente de Trabalho a cada tubo com tubos suficiente para cobrir todas as amostras e padrões. Para o ensaio de alta gama, use uma proporção de 20:1 de reagente de trabalho para amostra. Adicionar 190 mL de Reagente de Trabalho a cada tubo com tubos suficiente para cobrir todas as amostras e padrões. Consulte o BCA Pierce kit de literatura para determinar que proporção é adequado para as suas amostras. </li><li> Adicionar 10 mL de padrão ou amostra a cada tubo contendo reagente. Misture bem delicadamente vórtex. </li><li> Incubar os tubos a 37 ° C por 30 minutos. </li><li> Permitir que as reações a atingir a temperatura ambiente (~ 10 minutos). </li></ol> c. Microvolume BCA Medidas Assay Gerar Curva Padrão <ol><li> Selecione o método BCA Protein a partir do menu principal. Se a janela de verificação comprimento de onda aparece, certifique-se o braço é baixo. </li><li> Digite os valores para cada concentração padrão no painel de tabela à direita. O software permite a referência e até 7 additpadrões ional. A referência e / ou padrões deve ser medido em repetições. Nota: O requisito mínimo para a geração de curva padrão é a medida de duas normas ou a medição da referência zero e pelo menos um padrão. Recomenda-se que os padrões adicionais sejam incluídos como necessário para cobrir a faixa de concentração esperada ensaio. </li><li> Estabelecer um em branco. O branco para ensaios colorimétricos geralmente é deionizada H 2 O. </li><li> Pipeta mL 2 de dH 2 O sobre o pedestal baixo, mais baixo do braço e clique em branco. Apenas um em branco é necessário para cobrir todas as medições subseqüentes da referência e padrões. </li><li> Estabelecer a referência pipetando uma alíquota de 2 mL, contendo apenas o reagente de trabalho e buffer com nenhuma proteína para o menor pedestal. Abaixe o braço e Medida clique. </li><li> Sob a guia Padrões, selecione o padrão desejado e pipetar 2 mL do padrão desejado para o menor pedestal. Abaixe o braço e Medida clique. Repita o processo para todos os padrões. Certifique-se de medida de todas as normas antes de amostras de medição. Para ver curva padrão clique em Exibir curva padrão. </li></ol> d. Medidas Microvolume BCA Protein Assay duas Medidas mL <ol><li> Afinal de contas das Normas foram medidos, clique no botão amostras. Digite o ID da amostra. Carga de 2 mL de amostra para o pedestal inferior e clique em Medida. A alíquota de 2 mL de amostra fresca deve ser usado para cada medição. </li><li> Limpe a amostra da pedestais inferior e superior utilizando um laboratório seco wipe. </li></ol> e. Medidas Assay Microvolume BCA Limpeza e Recondicionamento Realizar a limpeza e recondicionamento, como descrito na direta A280 medições de absorbância. Resultados representativos: Microvolume determinação da concentração de proteínas é realizada por qualquer um A280 medição direta ou indireta de um ensaio colorimétrico. O exemplo a medição A280 determina a concentração de proteína com base no coeficiente de extinção da proteína de interesse. O BCA exemplo ensaio colorimétrico determina a concentração de proteína baseada em uma curva padrão de concentrações de proteína conhecida.

<ol>
	<li>Aitken, A., Learmonth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+determination+by+UV+absorption.">Protein determination by UV absorption.</a> , (1996).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).</li><li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Coomassie+Brilliant+Blue+G250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrilamide+gels.">Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. , (2006).</li><li>Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. u. j. i. m. o. t. o., Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein.">Quantitation of protein.</a> Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li></ol>

Os autores são funcionários da Thermo Fisher Scientific, que produz os reagentes e as ferramentas usadas neste artigo.

Quantificação Microvolume usa as propriedades de superfície intrínseca a tensão de uma amostra para formar uma coluna de líquido entre duas superfícies de medição. A ausência de um dispositivo de contenção, permite que o comprimento do caminho para a mudança em tempo real, eliminando essencialmente a necessidade de realizar diluições. Esta capacidade aumenta dramaticamente a gama dinâmica das concentrações de proteínas, bem como a velocidade de medição. Utilizando quantidades mínimas de amostra, um grande número de amostras podem ser analisadas com rapidez e precisão, permitindo aos cientistas fazer medições mais e obter um melhor controlo de qualidade. Além disso, e se necessário, as amostras preciosas podem ser recuperados depois de tomar uma medida. Quando tais pequenos volumes estão sendo medidos, homogeneidade da amostra é extremamente importante para evitar erros de amostragem. Ponteiras de baixa retenção deve ser sempre utilizado para as amostras de carga e as dicas devem ser alteradas entre a amostra repetições. As superfícies pedestal devem ser limpos e condicionados para garantir os resultados mais precisos. Finalmente, o espectrofotômetro microvolume é ideal quando a amostra é limitada, no entanto, a facilidade de uso, velocidade e faixa dinâmica ampla do espectrômetro de torná-lo adequado quando a amostra é abundante.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
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<tr>
<td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laboratory wipes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>23250</td>
<td>Reducing agent compatible</td>
</tr>
<tr>
<td>PR-1 Reconditioning Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microvolume protein concentration determination using the nanodrop 2000c spectrophotometer

Espectrofotometria tradicional exige colocar amostras em tinas ou capilares. Isso é muitas vezes impraticável devido aos volumes de amostra limitada frequentemente utilizado para análise de proteínas. A Thermo Scientific NanoDrop 2000c Espectrofotômetro resolve este problema com um inovador sistema de retenção de amostra que contém amostras microvolume entre duas superfícies de medição usando as propriedades da tensão superficial de líquidos, permitindo a quantificação de amostras em volumes tão baixo quanto 0,5-2 mL. A eliminação de tinas ou capilares permite alterações em tempo real no comprimento do caminho, o que reduz o tempo de medição, enquanto aumenta muito a gama dinâmica das concentrações de proteína que pode ser medido. A necessidade de diluições também é eliminada, e os preparativos para a quantificação da amostra são relativamente fáceis como as superfícies de medição pode ser simplesmente eliminado com laboratório wipe. Este artigo vídeo apresenta modificações aos tradicionais métodos de determinação de concentração de proteína para a quantificação dos valores microvolume de proteínas usando A280 leituras de absorbância ou o BCA ensaio colorimétrico.

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Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Microvolume amostras são quantificados por um sistema de espectrofotômetro que utiliza tensão superficial natural para manter as amostras sem o uso de tinas ou capilares. A gama dinâmica das concentrações de proteína e velocidade, que pode ser medido aumentam consideravelmente com este método.

Microvolume determinação da concentração de proteína utilizando o NanoDrop 2000c Espectrofotômetro

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

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microvolume-protein-concentration-determination-using-nanodrop-2000c

Research

JoVE Journal

Biology

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Vídeo: Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

A importância da concentração de proteína correta para Cinética e Determinação Affinity na estrutura-função Análise

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Biologia

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

Usando o sistema de fracionamento GELFREE 8100 para Fracionamento baseada no peso molecular com Recovery Fase Líquida

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

Análise do desenvolvimento de um fenótipo morfológico como uma função da concentração de proteínas em levedura de brotamento

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

Determinação tecido Usando o Transplante Cap Animal (ACT) em Ensaio Xenopus laevis</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

Quantificação de dsDNA usando a Hitachi F-7000 Espectrofotômetro de Fluorescência e PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop quantificação Microvolume de Ácidos Nucléicos

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Determinação de concentração de ácidos nucléicos e proteínas Usando o Micro-volume Bio-spec Espectrofotômetro Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Determinação de interacções proteína-ligante Usando Differential Scanning Fluorimetria

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

A identificação da proteína-proteína Locais de interacção Usando Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...