I. O NanoDrop 2000c Espectrofotômetro NanoDrop tecnologia é baseada em um sistema inovador de retenção de amostra que usa a tensão de superfície para segurar e medir amostras microvolume entre dois pedestais óptica sem o uso de tinas ou capilares. O NanoDrop 2000c espectrofotômetro utiliza esta tecnologia de forma rápida e facilmente medir gotas 0,5-2 mL de proteínas, DNA, RNA, e outras biomoléculas. Esta capacidade tornou-se cada vez mais importante como técnicas moleculares evoluir continuamente para usar pequenas quantidades de material para análise. O ideal espectrofotômetro microvolume para as condições em que amostra é limitada. No entanto, a facilidade de uso, ciclo de medição rápida e, e extensa faixa de concentração também fazer o espectrofotômetro adequado quando grandes quantidades de amostra estão disponíveis. O ciclo de medição também é bastante reduzido, ajudando os cientistas a aumentar a eficiência em todo o seu fluxo de trabalho. O microsample é colocado diretamente em cima da superfície de detecção e uma coluna de líquido é criado entre as extremidades das fibras ópticas pela tensão superficial. Esta coluna de líquido forma um caminho vertical óptico. A lâmpada de flash xenon fornece a fonte de luz e um espectrômetro utilizando um sensor CCD linear é utilizado para analisar a luz que passa através da amostra. Remoção de dispositivos de contenção tradicionais, como tinas do sistema tem várias vantagens: pequenas quantidades de amostras são necessários para a medição, a limpeza requer simplesmente limpando as superfícies ópticas com um laboratório de wipe, eo comprimento do caminho pode ser alterado em tempo real durante a medição. O 2000c NanoDrop determina o comprimento do caminho ideal automaticamente (1 mm a 0,05 mm), proporcionando a mais ampla gama de medições de concentração de proteína possível sem diluições. Encurtando o comprimento do caminho, maiores concentrações de proteína pode ser medido. Isso efetivamente remove a necessidade de realizar diluições de amostras mais proteína. Por exemplo, o 2000c NanoDrop pode medir as concentrações de BSA tão alto quanto 400 mg / mL. O NanoDrop 2000c espectrofotômetro é um espectrofotômetro de espectro total para medir a absorção de DNA, RNA, proteínas e outras biomoléculas. Este protocolo de vídeo irá focar-se na medição de proteínas. II. Microvolume determinação da concentração de proteína A280 Usando as medidas de absorbância a. Princípio da A280 Medições O método A280 Protein é aplicável a proteínas purificadas que contêm triptofano, tirosina, fenilalanina resíduos ou obrigações Cisteína Cisteína dissulfeto e exibem absorbância a 280 nm. Este método utiliza o valor de absorbância A280 em combinação com o coeficiente de extinção a massa ou o coeficiente de extinção molar para calcular a concentração da proteína purificada. A vantagem de medições diretas A280 é que a geração de uma curva padrão não é necessário para determinar a concentração de proteína. Se a amostra é uma solução de proteína descaracterizados, lisado celular, ou extrato de proteína bruta, em seguida, usando um dos métodos pré-configurados colorimétrico disponível no 2000/2000c NanoDrop, como BCA, 660 Pierce nm, Bradford, Lowry e ensaios, é recomendado. b. Microvolume Protein A280 Medidas - Startup <ol><li> Selecione o aplicativo A280 Protein a partir do menu principal. </li><li> Selecione o tipo de amostra a ser medida a partir da lista drop-down. A configuração padrão é recomendado para a maioria das misturas de proteína desconhecida, na qual um Abs = 1 mg / mL. Se a medição de uma proteína purificada previamente caracterizada, então, ou o coeficiente de extinção em massa ou coeficiente de extinção molar e massa molecular pode ser inserida para determinar a concentração de proteína mais precisamente. </li><li> Escolha as unidades de concentração a partir da lista drop-down. </li></ol> c. Proteína Microvolume Medidas A280 - Blanking <ol><li> Estabelecer um espaço em branco usando um tampão apropriado. É importante usar o buffer em que a proteína está suspenso. O buffer usado deve ser o mesmo pH e de uma força semelhante iônicos como a solução amostra. Nota: buffers RIPA contribuir absorbância muito em 280 nm e, portanto, incompatível com as proteínas direta A280. Para proteínas suspensos em tampão RIPA, recomenda-se a concentração de proteína ser determinado usando um tampão RIPA ensaio colorimétrico compatível. </li><li> Pipeta mL 2 da solução adequada para a estampagem pedestal baixo, abaixe o braço e clique em branco. </li><li> Limpe a solução em branco, os pedestais inferior e superior utilizando um laboratório seco wipe. </li></ol> d. Proteína Microvolume Medidas A280 medição Considerações importantes: A homogeneidade da amostra é extremamenteimportante, pois um volume tão pequeno está sendo medido. Para garantir que as amostras são homogêneas, suavemente, mas misturar as amostras imediatamente antes de tomar uma alíquota para a medição. Evitar a introdução de bolhas quando mistura e pipetagem. Devido à variabilidade da tensão superficial entre proteínas diferentes, recomendamos carregar 2 mL de amostras para garantir a formação de coluna adequada. Sempre usar ponteiras de baixa retenção. Para carregar uma amostra, toque a ponta da pipeta na superfície pedestal inferior óptico durante a expulsar a solução para evitar a solução de aderir a parte externa da ponta da pipeta. Expelir menos do que o valor total da amostra para evitar blowout e introdução de bolhas na amostra. <ol><li> Digite um ID da amostra no campo apropriado, carga 2 mL da primeira amostra como descrito para a Medida em branco e clique em. Uma nova porção 2μL da amostra deve ser usado para cada medição. </li><li> Retirar a amostra da pedestais inferior e superior utilizando um laboratório seco wipe. </li></ol> e. Microvolume Protein A280 Medidas de limpeza Um ordinário, que não solte fiapos de laboratório, limpe freqüentemente é suficiente para a limpeza do pedestais óptica entre as medidas. f. Fazendo Protein A280 Medidas Recondicionamento Soluções e reagentes contendo surfactantes pode descondicionar as superfícies pedestal de medição ao longo do tempo, impedindo que a coluna de líquido da amostra para se formar. Um achatamento da gota na parte inferior do pedestal é um indicativo da superfície óptica tornando-se incondicionada. Se as propriedades da superfície ter sido comprometida, os pedestais de recondicionamento é importante para garantir a formação de coluna de amostra. Se isso ocorrer, buff as superfícies ópticas vigorosamente usando limpe laboratório ou uso Compound Pedestal NanoDrop Recondicionamento (PR-1) como indicado. III. Microvolume determinação da concentração de proteína através de teste colorimétrico a. Princípio da detecção colorimétrica O NanoDrop espectrofotômetro 2000c também pode ser usado para medir soluções de proteína descaracterizados, lisados ​​celulares, e extratos de proteína bruta através de teste colorimétrico. Métodos colorimétricos são métodos indiretos que envolvem a interação de um corante com o componente de proteína da amostra para a produção de um novo complexo que absorve luz na faixa de comprimento de onda visível. O NanoDrop espectrofotômetro 2000c tem vários pré-configurados, incluindo ensaios colorimétricos BCA, 660 Pierce, Bradford, e métodos de Lowry. O ensaio BCA será demonstrado como um ensaio colorimétrico exemplo usando um espectrofotômetro microvolume. (Screenshot) O BCA ensaio (Ácido Bicinchoninic) é um método colorimétrico comum muitas vezes usado para diluir soluções de proteína e proteínas na presença de componentes que têm UV significativa (280 nm) absorbância. Ao contrário do método A280 Protein, a Proteína método BCA exige que uma curva padrão antes de ser gerado concentração de proteínas da amostra pode ser medido. O método utiliza ácido bicinchoninic (BCA) como reagente de detecção. O quelato Cu-BCA formado na presença de proteínas é medido em 562 nm e 750 nm em normalizado. b. Microvolume Assay BCA Medidas Preparação de Ensaio BCA <ol><li> Os reagentes necessários estão contidos no kit agente redutor compatível (Thermo Scientific gato Pierce não 23250..): BCA reagente A, B BCA reagente, reagente de compatibilidade, tampão de reconstituição, e albumina (BSA) padrões. </li><li> Equilibrar todas as proteínas desconhecidas e padrões de proteína à temperatura ambiente e misture bem. </li><li> Prepare o suficiente reagente de trabalho nova para os padrões e amostras a medida usando uma proporção de 50:1 de reagente A: B </li><li> Para o ensaio micro, use uma proporção de 1:1 do reagente de trabalho para amostra. Adicionar 10 mL de Reagente de Trabalho a cada tubo com tubos suficiente para cobrir todas as amostras e padrões. Para o ensaio de alta gama, use uma proporção de 20:1 de reagente de trabalho para amostra. Adicionar 190 mL de Reagente de Trabalho a cada tubo com tubos suficiente para cobrir todas as amostras e padrões. Consulte o BCA Pierce kit de literatura para determinar que proporção é adequado para as suas amostras. </li><li> Adicionar 10 mL de padrão ou amostra a cada tubo contendo reagente. Misture bem delicadamente vórtex. </li><li> Incubar os tubos a 37 ° C por 30 minutos. </li><li> Permitir que as reações a atingir a temperatura ambiente (~ 10 minutos). </li></ol> c. Microvolume BCA Medidas Assay Gerar Curva Padrão <ol><li> Selecione o método BCA Protein a partir do menu principal. Se a janela de verificação comprimento de onda aparece, certifique-se o braço é baixo. </li><li> Digite os valores para cada concentração padrão no painel de tabela à direita. O software permite a referência e até 7 additpadrões ional. A referência e / ou padrões deve ser medido em repetições. Nota: O requisito mínimo para a geração de curva padrão é a medida de duas normas ou a medição da referência zero e pelo menos um padrão. Recomenda-se que os padrões adicionais sejam incluídos como necessário para cobrir a faixa de concentração esperada ensaio. </li><li> Estabelecer um em branco. O branco para ensaios colorimétricos geralmente é deionizada H 2 O. </li><li> Pipeta mL 2 de dH 2 O sobre o pedestal baixo, mais baixo do braço e clique em branco. Apenas um em branco é necessário para cobrir todas as medições subseqüentes da referência e padrões. </li><li> Estabelecer a referência pipetando uma alíquota de 2 mL, contendo apenas o reagente de trabalho e buffer com nenhuma proteína para o menor pedestal. Abaixe o braço e Medida clique. </li><li> Sob a guia Padrões, selecione o padrão desejado e pipetar 2 mL do padrão desejado para o menor pedestal. Abaixe o braço e Medida clique. Repita o processo para todos os padrões. Certifique-se de medida de todas as normas antes de amostras de medição. Para ver curva padrão clique em Exibir curva padrão. </li></ol> d. Medidas Microvolume BCA Protein Assay duas Medidas mL <ol><li> Afinal de contas das Normas foram medidos, clique no botão amostras. Digite o ID da amostra. Carga de 2 mL de amostra para o pedestal inferior e clique em Medida. A alíquota de 2 mL de amostra fresca deve ser usado para cada medição. </li><li> Limpe a amostra da pedestais inferior e superior utilizando um laboratório seco wipe. </li></ol> e. Medidas Assay Microvolume BCA Limpeza e Recondicionamento Realizar a limpeza e recondicionamento, como descrito na direta A280 medições de absorbância. Resultados representativos: Microvolume determinação da concentração de proteínas é realizada por qualquer um A280 medição direta ou indireta de um ensaio colorimétrico. O exemplo a medição A280 determina a concentração de proteína com base no coeficiente de extinção da proteína de interesse. O BCA exemplo ensaio colorimétrico determina a concentração de proteína baseada em uma curva padrão de concentrações de proteína conhecida.

<ol>
	<li>Aitken, A., Learmonth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+determination+by+UV+absorption.">Protein determination by UV absorption.</a> , (1996).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).</li><li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Coomassie+Brilliant+Blue+G250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrilamide+gels.">Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. , (2006).</li><li>Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. u. j. i. m. o. t. o., Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein.">Quantitation of protein.</a> Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li></ol>

Os autores são funcionários da Thermo Fisher Scientific, que produz os reagentes e as ferramentas usadas neste artigo.

Quantificação Microvolume usa as propriedades de superfície intrínseca a tensão de uma amostra para formar uma coluna de líquido entre duas superfícies de medição. A ausência de um dispositivo de contenção, permite que o comprimento do caminho para a mudança em tempo real, eliminando essencialmente a necessidade de realizar diluições. Esta capacidade aumenta dramaticamente a gama dinâmica das concentrações de proteínas, bem como a velocidade de medição. Utilizando quantidades mínimas de amostra, um grande número de amostras podem ser analisadas com rapidez e precisão, permitindo aos cientistas fazer medições mais e obter um melhor controlo de qualidade. Além disso, e se necessário, as amostras preciosas podem ser recuperados depois de tomar uma medida. Quando tais pequenos volumes estão sendo medidos, homogeneidade da amostra é extremamente importante para evitar erros de amostragem. Ponteiras de baixa retenção deve ser sempre utilizado para as amostras de carga e as dicas devem ser alteradas entre a amostra repetições. As superfícies pedestal devem ser limpos e condicionados para garantir os resultados mais precisos. Finalmente, o espectrofotômetro microvolume é ideal quando a amostra é limitada, no entanto, a facilidade de uso, velocidade e faixa dinâmica ampla do espectrômetro de torná-lo adequado quando a amostra é abundante.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratory wipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>23250</td><td>Reducing agent compatible</td></tr><tr><td>PR-1 Reconditioning Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microvolume protein concentration determination using the nanodrop 2000c spectrophotometer

Espectrofotometria tradicional exige colocar amostras em tinas ou capilares. Isso é muitas vezes impraticável devido aos volumes de amostra limitada frequentemente utilizado para análise de proteínas. A Thermo Scientific NanoDrop 2000c Espectrofotômetro resolve este problema com um inovador sistema de retenção de amostra que contém amostras microvolume entre duas superfícies de medição usando as propriedades da tensão superficial de líquidos, permitindo a quantificação de amostras em volumes tão baixo quanto 0,5-2 mL. A eliminação de tinas ou capilares permite alterações em tempo real no comprimento do caminho, o que reduz o tempo de medição, enquanto aumenta muito a gama dinâmica das concentrações de proteína que pode ser medido. A necessidade de diluições também é eliminada, e os preparativos para a quantificação da amostra são relativamente fáceis como as superfícies de medição pode ser simplesmente eliminado com laboratório wipe. Este artigo vídeo apresenta modificações aos tradicionais métodos de determinação de concentração de proteína para a quantificação dos valores microvolume de proteínas usando A280 leituras de absorbância ou o BCA ensaio colorimétrico.

Watch this Scientific Journal Video about Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer at JoVE.com

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Microvolume amostras são quantificados por um sistema de espectrofotômetro que utiliza tensão superficial natural para manter as amostras sem o uso de tinas ou capilares. A gama dinâmica das concentrações de proteína e velocidade, que pode ser medido aumentam consideravelmente com este método.

Microvolume determinação da concentração de proteína utilizando o NanoDrop 2000c Espectrofotômetro

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

<a class="grey_button" href="/video/1770">&#x4E2D;&#x6587;</a><a class="grey_button" href="/video/1920">Deutsch</a> <a class="grey_button" href="/video/1921">Fran&#231;ais</a> <a class="grey_button" href="/video/1922"> Espa&ntilde;ol </a> <a class="grey_button" href="/video/2187"> &#x65E5;&#x672C;&#x8A9E; </a>

microvolume-protein-concentration-determination-using-nanodrop-2000c

Research

JoVE Journal

Biology

113.9K visualizações.  Thermo Scientific NanoDrop Products. 中文Deutsch Français Español 日本語 

Vídeo: Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Counting Proteins in Single Cells with Addressable Droplet Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average result masking the rich single cell behavior within a complex population. Single cell protein detection and quantification technologies have made a remarkable impact in recent years. Here we describe a practical and flexible single cell analysis platform based on addressable droplet microarrays. This study describes how the absolute copy numbers of target proteins may be measured with single cell resolution. The tumor suppressor p53 is the most commonly mutated gene in human cancer, with more than 50% of total cancer cases exhibiting a non-healthy p53 expression pattern. The protocol describes steps to create 10 nL droplets within which single human cancer cells are isolated and the copy number of p53 protein is measured with single molecule resolution to precisely determine the variability in expression. The method may be applied to any cell type including primary material to determine the absolute copy number of any target proteins of interest.

Here we present addressable droplet microarrays (ADMs), a droplet array based method able to determine absolute protein abundance in single cells. We demonstrate the capability of ADMs to characterize the heterogeneity in expression of the tumor suppressor protein p53 in a human cancer cell line.

Contagem de proteínas em células únicas com gotículas endereçável Microarrays

Often cellular behavior and cellular responses are analyzed at the population level where the responses of many cells are pooled together as an average ...

Pesquisa do câncer

Standards for Quantitative Metalloproteomic Analysis Using Size Exclusion ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of diseases including Alzheimer's and Parkinson's disease, but the exact role these metals play is yet to be fully elucidated. Identification of metalloproteins encounters many challenges and difficulties. Here we report an approach that allows metalloproteins in complex samples to be quantified. This is achieved using size exclusion chromatography coupled with inductively coupled plasma - mass spectrometry (SEC-ICP-MS). Using six known metalloproteins, the size exclusion column can be calibrated and the respective trace elements (iron, copper, zinc, cobalt, iodine) can be used for quantification. SEC-ICP-MS traces of human brain and plasma are presented. The use of these metalloprotein standards provides the means to quantitatively compare metalloprotein abundances between biological samples. This technique is poised to help shed light on the role of metalloproteins in neurodegenerative disease as well as other diseases where imbalances in trace elements are implicated.

Size exclusion chromatography hyphenated with inductively coupled plasma - mass spectrometry (ICP-MS) is a powerful tool to measure changes in the abundance of metalloproteins directly from biological samples. Here we describe a set of metalloprotein standards used to estimate molecular mass and the amount of metal associated with unknown proteins.

Normas para Análise Quantitativa Metalloproteomic Usando Tamanho Exclusão ICP-MS

Metals are essential for protein function as cofactors to catalyze chemical reactions. Disruption of metal homeostasis is implicated in a number of ...

Química

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a technology for regenerative medicine2. Unlike viruses, which have significant safety issues, polymeric nanoparticles can be designed to be non-toxic, non-immunogenic, non-mutagenic, easier to synthesize, chemically versatile, capable of carrying larger nucleic acid cargo and biodegradable and/or environmentally responsive. Cationic polymers self-assemble with negatively charged DNA via electrostatic interaction to form complexes on the order of 100 nm that are commonly termed polymeric nanoparticles. Examples of biomaterials used to form nanoscale polycationic gene delivery nanoparticles include polylysine, polyphosphoesters, poly(amidoamines)s and polyethylenimine (PEI), which is a non-degradable off-the-shelf cationic polymer commonly used for nucleic acid delivery1,3 . Poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are a newer class of cationic polymers4 that are hydrolytically degradable5,6 and have been shown to be effective at gene delivery to hard-to-transfect cell types such as human retinal endothelial cells (HRECs)7, mouse mammary epithelial cells8, human brain cancer cells9 and macrovascular (human umbilical vein, HUVECs) endothelial cells10.
A new protocol to characterize polymeric nanoparticles utilizing nanoparticle tracking analysis (NTA) is described. In this approach, both the particle size distribution and the distribution of the number of plasmids per particle are obtained11. In addition, a high-throughput 96-well plate transfection assay for rapid screening of the transfection efficacy of polymeric nanoparticles is presented. In this protocol, poly(beta-amino ester)s (PBAEs) are used as model polymers and human retinal endothelial cells (HRECs) are used as model human cells. This protocol can be easily adapted to evaluate any polymeric nanoparticle and any cell type of interest in a multi-well plate format.

A protocol for nanoparticle tracking analysis (NTA) and high-throughput flow cytometry to evaluate polymeric gene delivery nanoparticles is described. NTA is utilized to characterize the nanoparticle particle size distribution and the plasmid per particle distribution. High-throughput flow cytometry enables quantitative transfection efficacy evaluation for a library of gene delivery biomaterials.

Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

Bioengenharia

UV-Vis Spectroscopic Characterization of Nanomaterials in Aqueous Media

The physicochemical characterization of nanomaterials (NMs) is often an analytical challenge, due to their small size (at least one dimension in the nanoscale, i.e. 1&#8211;100 nm), dynamic nature, and diverse properties. At the same time, reliable and repeatable characterization is paramount to ensure safety and quality in the manufacturing of NM-bearing products. There are several methods available to monitor and achieve reliable measurement of nanoscale-related properties, one example of which is Ultraviolet-Visible Spectroscopy (UV-Vis). This is a well-established, simple, and inexpensive technique that provides non-invasive and fast real-time screening evaluation of NM size, concentration, and aggregation state. Such features make UV-Vis an ideal methodology to assess the proficiency testing schemes (PTS) of a validated standard operating procedure (SOP) intended to evaluate the performance and reproducibility of a characterization method. In this paper, the PTS of six partner laboratories from the H2020 project ACEnano were assessed through an interlaboratory comparison (ILC). Standard gold (Au) colloid suspensions of different sizes (ranging 5&#8211;100 nm) were characterized by UV-Vis at the different institutions to develop an implementable and robust protocol for NM size characterization.

This study presents the benchmarking results for an interlaboratory comparison (ILC) designed to test the standard operating procedure (SOP) developed for gold (Au) colloid dispersions characterized by ultraviolet-visible Spectroscopy (UV-Vis), amongst six partners from the H2020 ACEnano project for sample preparation, measurement, and analysis of the results.

Caracterização espectroscópica UV-Vis de nanomateriais na mídia aquosa

The physicochemical characterization of nanomaterials (NMs) is often an analytical challenge, due to their small size (at least one dimension in the ...

Engenharia

Expandindo a faixa de concentração da análise de fotometria de massa com microfluídica

Analysis of Protein Complex Formation at Micromolar Concentrations by Coupling Microfluidics with Mass Photometry

Mass photometry is a versatile mass measurement technology that enables the study of biomolecular interactions and complex formation in solution without labels. Mass photometry is generally suited to analyzing samples in the 100 pM-100 nM concentration range. However, in many biological systems, it is necessary to measure more concentrated samples to study low-affinity or transient interactions. Here, we demonstrate a method that effectively expands the range of sample concentrations that can be analyzed by mass photometry from nanomolar to tens of micromolar. 
In this protocol, mass photometry is combined with a novel microfluidics system to investigate the formation of protein complexes in solution in the micromolar concentration range. With the microfluidics system, users can maintain a sample at a desired higher concentration followed by dilution to the nanomolar range - several milliseconds prior to the mass photometry measurement. Due to the speed of the dilution, data is obtained before the equilibrium of the sample has shifted (i.e., dissociation of the complex). 
The technique is applied to measure interactions between an immunoglobulin G (IgG) antibody and the neonatal Fc receptor, showing the formation of high-order complexes that were not quantifiable with static mass photometry measurements. 
In conclusion, the combination of mass photometry and microfluidics makes it possible to characterize samples in the micromolar concentration range and is proficient in measuring biomolecular interactions with weaker affinities. These capabilities can be applied in a range of contexts - including the development and design of biotherapeutics - enabling thorough characterization of diverse protein-protein interactions.

Autor em destaque: Caracterização de interações proteicas de baixa afinidade em solução usando a tecnologia MassFluidix

This protocol combines mass photometry with a novel microfluidics system to investigate low-affinity protein-protein interactions. This approach is based on the rapid dilution of highly concentrated complexes in solution, which enables low-affinity measurements and broadens the applicability of mass photometry.

Análise da formação de complexos proteicos em concentrações micromolares por acoplamento de microfluídica com fotometria de massa

Mass photometry is a versatile mass measurement technology that enables the study of biomolecular interactions and complex formation in solution without ...

Bioquímica

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop quantificação Microvolume de Ácidos Nucléicos

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Biologia

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Determinação de concentração de ácidos nucléicos e proteínas Usando o Micro-volume Bio-spec Espectrofotômetro Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Methods to Discover Alternative Promoter Usage and Transcriptional Regulation of Murine Bcrp1

Gene expression in different tissues is often controlled by alternative promoters that result in the synthesis of mRNA with unique &#8212; usually untranslated &#8212; first exons. Bcrp1 (Abcg2), the murine orthologue of the ABC transporter Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), has at least four alternative promoters that are designated by the corresponding four alternative first exons produced: E1U, E1A, E1B, and E1C. Herein, in-silico protocols are presented to predict alternative promoter usage for Bcrp1. Furthermore, reporter assay methods are described to produce reporter constructs for alternative promoters and to determine the functionality of putative promoters upstream of the alternative first exons that are identified.

With the murine ABC transporter Bcrp1 (Abcg2) as an example, in-silico protocols are presented to detect alternative promoter usage in genes expressed in mouse tissues, and to evaluate the functionality of the alternative promoters identified using reporter assays.

Microvolume determinação da concentração de proteína utilizando o NanoDrop 2000c Espectrofotômetro

Transcrição

Resumo

Explore mais vídeos

Capítulos neste vídeo

Contagem de proteínas em células únicas com gotículas endereçável Microarrays

Normas para Análise Quantitativa Metalloproteomic Usando Tamanho Exclusão ICP-MS

Avaliação de Entrega Gene Polimérico Nanopartículas por Análise Nanoparticle Rastreamento e alta capacidade de Citometria de Fluxo

Caracterização espectroscópica UV-Vis de nanomateriais na mídia aquosa

Análise da formação de complexos proteicos em concentrações micromolares por acoplamento de microfluídica com fotometria de massa

Análise da formação de complexos proteicos em concentrações micromolares por acoplamento de microfluídica com fotometria de massa

Análise da formação de complexos proteicos em concentrações micromolares por acoplamento de microfluídica com fotometria de massa

NanoDrop quantificação Microvolume de Ácidos Nucléicos

Determinação de concentração de ácidos nucléicos e proteínas Usando o Micro-volume Bio-spec Espectrofotômetro Nano

Métodos para descobrir Uso Promotor Alternativa e regulação da transcrição de Murino Bcrp1