أولا : 2000c NanoDrop الطيف ويستند NanoDrop التكنولوجيا على نظام العينة الاحتفاظ المبتكرة التي تستخدم التوتر السطحي لعقد وقياس العينات microvolume بين اثنين من الركائز البصرية من دون استخدام cuvettes أو الشعيرات الدموية. و2000c NanoDrop معمل يستخدم هذه التقنية بسرعة وسهولة قياس 0،5-2 قطرات ميكرولتر من البروتينات والحمض النووي ، والجيش الملكي النيبالي ، والجزيئات الحيوية الأخرى. وقد أصبحت هذه القدرة أهمية متزايدة مع التقنيات الجزيئية تتطور باستمرار لاستخدام كميات صغيرة من المواد لتحليلها. المثل الأعلى للمعمل microvolume الظروف التي يقتصر العينة. ومع ذلك ، وسهولة الاستخدام ، ودورة سريعة والقياس ، واسعة النطاق تركز أيضا أن يجعل من مناسبة عندما معمل كميات وافرة من العينة المتاحة. هو أيضا دورة قياس تقلص إلى حد كبير ، مما يساعد العلماء في جميع أنحاء زيادة كفاءة سير العمل الخاصة بهم. يتم وضع microsample مباشرة في أعلى سطح الكشف ويتم إنشاء عمود السائل بين طرفي الألياف الضوئية التوتر السطحي. هذا العمود السائل يشكل المسار الرأسي البصرية. وفلاش زينون مصباح يوفر مصدر الضوء واستخدام مطياف يستخدم مجموعة CCD الخطية لتحليل الضوء الذي يمر عبر العينة. إزالة أجهزة الاحتواء التقليدية مثل cuvettes من نظام له مزايا عدة : هناك حاجة لكميات صغيرة جدا من العينة للقياس ، ويتطلب تنظيف ببساطة مسح السطوح البصرية مع مختبر المسح ، ويمكن أن يتغير طول المسار في الوقت الحقيقي أثناء القياس. و2000c NanoDrop يحدد طول المسار الأمثل تلقائيا (1 ملم إلى 0.05 ملم) ، وتوفير مجموعة واسعة أكثر من ممكن قياسات تركيز البروتين دون التخفيفات. بتقصير طول المسار ، يمكن قياس تركيزات مرتفعة من البروتين. هذا فعال يزيل الحاجة إلى إجراء التخفيفات لمعظم عينات البروتين. على سبيل المثال ، يمكن لل2000c NanoDrop قياس تركيزات BSA تصل إلى 400 ملغ / مل. و2000c NanoDrop الطيف هو معمل الطيف الكامل لقياس الامتصاصية من الحمض النووي ، والجيش الملكي النيبالي ، والبروتينات ، والجزيئات الحيوية الأخرى. وهذا البروتوكول الفيديو التركيز على قياس البروتينات. II. Microvolume تحديد تركيز البروتين باستخدام قياسات امتصاص A280 أ. مبدأ القياسات A280 الأسلوب A280 البروتين ينطبق على تنقية البروتينات التي تحتوي ، التيروسين تريبتوفان ، فينيلالاناين مخلفات أو السندات ثاني كبريتيد سيستين سيستين ، ويحمل الامتصاصية عند 280 نانومتر. يستخدم هذا الأسلوب قيمة الامتصاصية A280 في تركيبة مع أي كتلة معامل الانقراض أو معامل الانقراض المولي لحساب تركيز البروتين النقي. ميزة قياسات A280 المباشر هو أن ليس مطلوبا من توليد منحنى القياسية لتحديد تركيز البروتين. إذا كانت العينة هو الحل البروتين uncharacterized ، lysate الخلية ، أو استخراج البروتين الخام ، ثم استخدام إحدى الطرق التي تم تكوينها مسبقا اللونية المتاحة على 2000/2000c NanoDrop ، مثل BCA ، بيرس 660 نانومتر ، وبرادفورد ، والمقايسات لوري ، هي الموصى بها. ب. Microvolume البروتين قياسات A280 -- بدء التشغيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد التطبيق A280 البروتين من القائمة الرئيسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد نوع العينة المراد قياسها من القائمة المنسدلة. ينصح الإعداد الافتراضي لمعظم خلائط البروتين الذي غير معروف في عبس 1 = 1 ملغ / مل. إذا كان قياس البروتين المنقى يتميز سابقا ، قد دخلت بعد ذلك إما الانقراض الجماعي للمعامل أو المولي معامل الانقراض والوزن الجزيئي لتحديد تركيز البروتين بشكل أكثر دقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار وحدات التركيز من القائمة المنسدلة. </li></ol> ج. قياسات Microvolume A280 البروتين -- تقطيع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء فارغة باستخدام العازلة المناسبة. من المهم استخدام العازلة التي علقت البروتين. ينبغي أن تكون عازلة تستخدم نفس درجة الحموضة وجود قوة مماثلة الأيونية هو الحل العينة. ملاحظة : المخازن RIPA الامتصاصية تسهم كثيرا في 280 نانومتر ، وبالتالي فهي تتعارض مع القياسات المباشرة البروتين A280. عن البروتينات علقت في منطقة عازلة RIPA ، فمن المستحسن أن يتم تحديد تركيز البروتين باستخدام العازلة RIPA مقايسة اللونية متوافق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 ميكرولتر ماصة للتقطيع الحل المناسب على قاعدة التمثال أسفل ، وانخفاض الذراع وفوق فارغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح حل فارغة من الركائز العليا والسفلى باستخدام المختبر الجاف محو. </li></ol> د. قياسات Microvolume A280 قياس البروتين اعتبارات هامة : إن تجانس العينة للغايةيتم قياس حجم مهم من هذا القبيل منذ الصغيرة. للتأكد من أن عينات متجانسة ، ولكن بلطف مزيج دقيق العينات فورا قبل أخذ قسامة للقياس. تجنب إدخال فقاعات عند خلط وpipetting. بسبب التباين في حدة التوتر بين مختلف البروتينات السطحية ، نوصي التحميل 2 ميكرولتر من العينات المناسبة لضمان تشكيل العمود. دائما قلة استخدام ماصة نصائح الاحتفاظ بهم. لتحميل عينة ، تلمس طرف الماصة على السطح السفلي رمى الضوئية بينما طرد الحل لمنع حل من الالتزام من طرف خارج ماصة. طرد أقل من المبلغ الكامل لنموذج لمنع الانفجار وإدخال فقاعات في العينة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدخل رقم العينة في الحقل المناسب ، تحميل 2 ميكرولتر من العينة الأولى كما هو موضح في قياس فارغة وانقر فوق موافق. وينبغي استخدام قسامة الطازجة 2μL من العينة لكل قياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عينة من الركائز العليا والسفلى باستخدام المختبر الجاف محو. </li></ol> ه. Microvolume البروتين A280 قياسات التنظيف عادية ، خالية من الوبر ، والمختبرات القضاء في كثير من الأحيان ما يكفي لتنظيف الركائز البصرية بين القياسات. ف. صنع البروتين A280 قياسات تجديد قد تحتوي على حلول والكواشف السطحي uncondition السطوح رمى القياس على مر الزمن ، ومنع عمود السائل العينة إلى النموذج. وتسطيح الحبرية على أقل رمى يدل على السطح البصري تصبح دون شروط. إذا كان قد تم المساس خصائص السطح ، وتجديد والركائز مهم لضمان عينة تشكيل العمود. إذا كان هذا يحدث ، برتقالي السطوح البصرية باستخدام بقوة يمسح المختبر أو استخدام NanoDrop مجمع الركيزة تجديد (PR - 1) وفقا لتوجيهات. III. Microvolume تحديد تركيز البروتين عن طريق فحوصات اللونية أ. مبدأ الكشف اللونية يمكن أيضا معمل 2000c NanoDrop يمكن استخدامها لقياس البروتين حلول uncharacterized ، lysates الخلية ، ومقتطفات من البروتين الخام باستخدام المقايسات اللونية. الأساليب اللونية هي طرق غير المباشرة التي تنطوي على التفاعل مع صبغة البروتين المكون من العينة لانتاج المجمع الجديد الذي يمتص الضوء في النطاق الموجي مرئية. في معمل 2000c NanoDrop ديها عدة فحوصات ما قبل تكوين اللونية بما BCA ، بيرس 660 ، برادفورد ، وأساليب لوري. وسوف أثبت الفحص BCA باعتبارها مقايسة المثال اللونية باستخدام معمل microvolume. (الصورة) و(Bicinchoninic حمض) BCA مقايسة هو طريقة شائعة اللونية غالبا ما تستخدم لإيجاد حلول تخفف من البروتين والبروتينات في وجود مكونات الأشعة فوق البنفسجية التي لها كبير (280 نانومتر) الامتصاصية. خلافا للبروتين طريقة A280 ، الأسلوب BCA البروتين يتطلب أن يتم إنشاء منحنى قياسي قبل أن تتمكن من قياس تركيزات البروتين العينة. الأسلوب يستخدم حمض bicinchoninic (BCA) ، والكاشف الكشف. يقاس كلاب النحاس ، BCA شكلت في وجود البروتين في 562 نانومتر ، وتطبيع في 750 نانومتر. ب. Microvolume BCA الفحص الفحص BCA إعداد قياسات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترد الكواشف المطلوبة في الحد من عوامل عدة متوافقة (الحرارية القط بيرس العلمية لم 23250.) : BCA كاشف A ، B BCA كاشف ، كاشف التوافق ، العازلة إعادة إعماره ، والزلال (BSA) المعايير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يوازن جميع البروتينات غير معروفة ومعايير البروتين إلى درجة حرارة الغرفة وتخلط جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد يكفي جديدة كاشف يعمل لحساب المعايير والعينات المراد قياسها باستخدام نسبة 50:1 من كاشف A : B </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمقايسة الدقيقة ، واستخدام نسبة 1:1 من كاشف تعمل على العينة. أضف 10 ميكرولتر من العمل كاشف لكل أنبوب مع أنابيب كافية لتغطية جميع العينات والمعايير. لمقايسة عالية المدى ، واستخدام نسبة 20:01 من كاشف تعمل على العينة. إضافة 190 ميكرولتر من العمل كاشف لكل أنبوب مع أنابيب كافية لتغطية جميع العينات والمعايير. الرجوع إلى الأدب بيرس BCA عدة لتحديد النسبة التي هي مناسبة للعينات الخاصة بك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أضف 10 ميكرولتر من معيار أو نموذج يحتوي على كل أنبوب كاشف. مزيج جيد من قبل vortexing بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأنابيب في 37 دقيقة لمدة 30 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لردود الفعل للتوازن في درجة حرارة الغرفة (~ 10 دقيقة). </li></ol> ج. قياسات Microvolume الفحص BCA توليد منحنى قياسي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد أسلوب BCA البروتين من القائمة الرئيسية. إذا كان الطول الموجي يظهر إطار التحقق ، وضمان الذراع إلى الأسفل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدخل القيم لكل تركيز القياسية في الجدول الجزء الأيسر. البرنامج يسمح للمرجعية وaddit تصل إلى 7IONAL المعايير. يجب أن تقاس مرجع و / أو معايير متماثلة في. ملاحظة : الحد الأدنى المطلوب لتوليد المنحنى هو معيار قياس معيارين أو قياس مستوى الصفر ، وإشارة واحدة على الأقل. فمن المستحسن أن يتم تضمين معايير إضافية حسب الضرورة لتغطية تركيز مقايسة المتوقع النطاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء فارغة. غير منزوع الأيونات عموما فارغة لفحوصات اللونية H 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 2 ميكرولتر من DH 2 O على قاعدة التمثال أسفل ، وانخفاض الذراع وفوق فارغ. واحد فقط فارغ اللازمة لتغطية جميع القياسات اللاحقة من المرجعية والمعايير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء إشارة pipetting a قسامة 2 ميكرولتر تحتوي على كاشف الوحيدة التي تعمل والعازلة مع عدم وجود بروتين على أقل رمى. انخفاض الذراع وقياس فوق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت علامة التبويب معايير ، تسليط الضوء على المعايير المطلوبة وماصة ميكرولتر 2 من المعيار المطلوب على أقل رمى. انخفاض الذراع وقياس فوق. تكرار هذه العملية لجميع المعايير. تأكد من قياس جميع المعايير السابقة لقياس العينات. انقر فوق عرض قياسي عرض المنحنى منحنى قياسي. </li></ol> د. قياسات Microvolume الفحص BCA 2 قياسات البروتين ميكرولتر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم قياس كل من المعايير ، انقر على زر العينات. أدخل رقم العينة. تحميل 2 ميكرولتر من العينة على الدنيا ورمى فوق القياس. وينبغي استخدام الطازجة 2 قسامة ميكرولتر من العينة لكل قياس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح عينة من الركائز العليا والسفلى باستخدام المختبر الجاف محو. </li></ol> ه. قياسات Microvolume الفحص BCA تنظيف وتجديد تنفيذ تنظيف وتجديد كما هو موضح في القياسات المباشرة الامتصاصية A280. ممثل النتائج : يتم تنفيذ Microvolume تحديد تركيز البروتين إما من خلال قياس A280 مباشرة أو غير مباشرة مقايسة اللونية. مثال قياس تركيز البروتين A280 يحدد على أساس معامل الانقراض من البروتين من الفائدة. على سبيل المثال الفحص اللونية BCA يحدد تركيز البروتين القائمة على منحنى مستوى تركيزات بروتين معروف.

<ol>
	<li>Aitken, A., Learmonth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+determination+by+UV+absorption.">Protein determination by UV absorption.</a> , (1996).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A., Randall, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+measurement+with+the+Folin+phenol+reagent.">Protein measurement with the Folin phenol reagent.</a> J. Biol. Chem. 193, 265-275 (1951).</li><li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Coomassie+Brilliant+Blue+G250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrilamide+gels.">Use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrilamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li><li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration.">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. 10:1A.17. , (2006).</li><li>Smith, P. K., Krohn, R. I., Hermanson, G. T., Mallia, A. K., Gartner, F. H., Provenzano, F. u. j. i. m. o. t. o., Goeke, E. K., Olson, N. M., J, B., Klenk, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li><li>Stoscheck, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+protein.">Quantitation of protein.</a> Meth. Enzymol. 182, 50-68 (1990).</li></ol>

المؤلفون هم موظفون من الحرارية فيشر العلمية التي تنتج الكواشف والأدوات المستخدمة في هذه المقالة.

Microvolume الكميات يستخدم التوتر السطحي الجوهرية خصائص عينة لتشكيل العمود السائل قياس السطوح بين البلدين. غياب جهاز الاحتواء ، ويسمح طول الطريق إلى التغيير في الوقت الحقيقي ، والقضاء اساسا على الحاجة إلى إجراء التخفيفات. هذا يزيد بشكل كبير من قدرة دينامية مجموعة من تركيزات البروتين وكذلك سرعة القياس. باستخدام كميات ضئيلة من العينة ، يمكن تحليل عدد كبير من العينات بسرعة وبدقة ، مما يسمح للعلماء لاتخاذ مزيد من القياسات وتحقيق أفضل مراقبة الجودة. بالإضافة إلى ذلك ، وإذا لزم الأمر ، يمكن استرداد العينات الثمينة بعد أخذ القياس. عندما يتم قياس كميات صغيرة من هذا القبيل ، والتجانس عينة من المهم للغاية لتجنب أخطاء أخذ العينات. وينبغي دائما منخفضة نصائح ماصة الاحتفاظ تستعمل لعينات التحميل وينبغي تغيير نصائح بين عينة يتطابق. يجب أن تكون السطوح رمى تنظيفها بشكل صحيح ومكيفة لضمان الحصول على النتائج الأكثر دقة. أخيرا ، معمل microvolume مثالية عند عينة محدودة ، ومع ذلك ، وسهولة الاستخدام والسرعة واسعة النطاق الديناميكي لمطياف تجعلها مناسبة عند عينة وفيرة.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>NanoDrop 2000c Spectrophotometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laboratory wipes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>23250</td>
<td>Reducing agent compatible</td>
</tr>
<tr>
<td>PR-1 Reconditioning Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microvolume protein concentration determination using the nanodrop 2000c spectrophotometer

القياس الطيفي التقليدية يتطلب وضع العينات في cuvettes أو الشعيرات الدموية. هذا هو في كثير من الأحيان غير عملي نظرا لحجم عينة محدودة غالبا ما تستخدم لتحليل البروتين. العلمية الحرارية NanoDrop 2000c الطيف يحل هذه المشكلة مع نظام العينة الاحتفاظ المبتكرة التي تحمل عينات microvolume بين السطوح اثنين باستخدام قياس خصائص التوتر السطحي للسوائل ، مما يمكن القياس الكمي للعينات في أحجام منخفضة تصل إلى 0،5-2 ميكرولتر. التخلص من الشعيرات الدموية يسمح cuvettes أو التغييرات في الوقت الحقيقي في طول الطريق ، مما يقلل من الوقت مع زيادة كبيرة قياس دينامية مجموعة من تركيزات البروتين التي يمكن قياسها. يتم القضاء أيضا على الحاجة إلى التخفيفات ، والاستعدادات لتقدير حجم العينة هي سهلة نسبيا حيث يمكن قياس السطوح محو ببساطة مع مختبر المسح. هذا المقال يعرض الفيديو تعديلات على الطرق التقليدية لتحديد تركيز البروتين الكمي لكميات من البروتين microvolume باستخدام قراءات الامتصاصية A280 أو مقايسة اللونية BCA.

Watch this Scientific Journal Video about Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer at JoVE.com

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

وكميا عينات Microvolume بواسطة نظام يستخدم معمل الطبيعية التوتر السطحي للاحتفاظ عينات من دون استخدام cuvettes أو الشعيرات الدموية. وزيادة كبيرة في مجموعة ديناميكية من تركيزات البروتين والسرعة التي يمكن قياسها مع هذا الأسلوب.

Microvolume تحديد تركيز البروتين باستخدام 2000c NanoDrop الطيف

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

<a class="grey_button" href="/video/1770">&#x4E2D;&#x6587;</a><a class="grey_button" href="/video/1920">Deutsch</a> <a class="grey_button" href="/video/1921">Fran&#231;ais</a> <a class="grey_button" href="/video/1922"> Espa&ntilde;ol </a> <a class="grey_button" href="/video/2187"> &#x65E5;&#x672C;&#x8A9E; </a>

microvolume-protein-concentration-determination-using-nanodrop-2000c

Research

JoVE Journal

Biology

113.2K Views.  Thermo Scientific NanoDrop Products. 中文Deutsch Français Español 日本語 

Video: Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

على أهمية تركيز البروتين الصحيح لحركية وتقارب في تحديد هيكل وظيفة التحليل

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae. Although this protocol is based on the overexpression of a protein, it can easily be adapted for morphological phenotypes dependent on suppression of protein expression. Our lab is interested in studying the signaling properties of the endocytic adaptor protein epsin. To that purpose we used a dominant negative approach in which we over-expressed the conserved Epsin N-Terminal Homology (ENTH) domain in order to interfere with the functions of endogenous epsin-2 (Ent2 or YLR206W). We observed that overexpression of the ENTH domain of Ent2 (ENTH2) in wild type cells led to a cell division defect that is dependent on the mislocalization of a family of scaffolding proteins, septins.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of phenotype development as a function of protein concentration at population and single-cell levels in Saccharomyces cerevisiae.

تحليل للوضع النمط الظاهري المورفولوجية كدالة للتركيز البروتين في الخميرة الناشيء.

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

تحديد الأنسجة باستخدام زرع رسملة الحيوان (ACT) في الفحص القيطم المورق</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular biology assays such as synthesis and purification of DNA, diagnostic applications such as quantification of DNA amplification products, and detection of DNA molecules in drug preparations. During this video we will demonstrate the capability of the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a Micro Plate Reader accessory to perform dsDNA quantification using Molecular Probes Quant-it PicoGreen dye reagent kit.
The F-7000 Fluorescence Spectrophotometer offers high sensitivity and high speed measurements. It is a highly flexible system capable of measuring fluorescence, luminescence, and phosphorescence. Several measuring modes are available, including wavelength scan, time scan, photometry and 3-D scan measurement. The spectrophotometer has sensitivity in the range of 50 picomoles of fluorescein when using a 300 &#956;L sample volume in the microplate, and is capable of measuring scan speeds of 60,000 nm/minute. It also has a wide dynamic range of up to 5 orders of magnitude which allows for the use of calibration curves over a wide range of concentrations. The optical system uses all reflective optics for maximum energy and sensitivity. The standard wavelength range is 200 to 750 nm, and can be extended to 900 nm when using one of the optional near infrared photomultipliers. The system allows optional temperature control for the plate reader from 5 to 60 degrees Celsius using an optional external temperature controlled liquid circulator. The microplate reader allows for the use of 96 well microplates, and the measuring speed for 96 wells is less than 60 seconds when using the kinetics mode.
Software controls for the F-7000 and Microplate Reader are also highly flexible. Samples may be set in either column or row formats, and any combination of wells may be chosen for sample measurements. This allows for optimal utilization of the microplate. Additionally, the software allows importing micro plate sample configurations created in Excel and saved in comma separated values, or "csv" format. Microplate measuring configurations can be saved and recalled by the software for convenience and increased productivity. Data results can be output to a standard report, to Excel, or to an optional Report Generator Program.

Demonstration of quantification of dsDNA using Molecular Probes PicoGreen dye and Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer equipped with a microplate reader accessory.

الكمي للdsDNA باستخدام F - 7000 هيتاشي الإسفار الطيف وصبغ PicoGreen

Quantification of DNA, especially in small concentrations, is an important task with a wide range of biological applications including standard molecular ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop Microvolume الكميات من الأحماض النووية

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

تعيين تركيز الأحماض النووية والبروتينات باستخدام الصغرى ، حجم الطيف نانو بيو المواصفات

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Protein Purification-free Method of Binding Affinity Determination by Microscale Thermophoresis

Quantitative characterization of protein interactions is essential in practically any field of life sciences, particularly drug discovery. Most of currently available methods of KD determination require access to purified protein of interest, generation of which can be time-consuming and expensive. We have developed a protocol that allows for determination of binding affinity by microscale thermophoresis (MST) without purification of the target protein from cell lysates. The method involves overexpression of the GFP-fused protein and cell lysis in non-denaturing conditions. Application of the method to STAT3-GFP transiently expressed in HEK293 cells allowed to determine for the first time the affinity of the well-studied transcription factor to oligonucleotides with different sequences. The protocol is straightforward and can have a variety of application for studying interactions of proteins with small molecules, peptides, DNA, RNA, and proteins.

Microscale thermophoresis (MST) can be widely used for determination of binding affinity without purification of the target protein from cell lysates. The protocol involves overexpression of the GFP-fused protein, cell lysis in non-denaturing conditions, and detection of MST signal in the presence of varying concentrations of the ligand.

البروتين طريقة خالية من تنقية تجليد تحديد الانجذاب من قبل Thermophoresis الميكروسكيل

Quantitative characterization of protein  interactions is essential in practically any field of life sciences,  particularly drug discovery. Most of ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

تحديد تفاعلات البروتين يجند عن طريق المسح الضوئي التفاضلية Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

تحديد مواقع التفاعل البروتين البروتين عن طريق الببتيد صفائف

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...