מחקר במעבדה שלנו היא נתמכת על ידי תוכנית המחקר עירונית של NIH, המכון הלאומי על אלכוהול התעללות ועל אלכוהוליזם.

<html> I. הכנה הזרקה סעיף זה מתאר את השלבים בהכנת כי יש לנקוט לפני הזרקת cDNA לתוך הגרעין של נוירונים. ההליך בידוד עבור נוירונים הוא מעבר להיקף של מאמר זה, אך חשוב להיות נוירונים ניתק לתוך תאים בודדים ועל דבקות טוב למשטח התחתון של תא 35 מנות מ&quot;מ תרבות (ראה דיון על עצות מועילות להשגת מטרה זו). למרות מגוון רחב של נוירונים שונים העלול לשמש, הגרעינים היקפי כמו בגרעיני צוואר הרחם מעולה (SCG) או בגרעיני השורש הגבי הם העדיפו לנתיחה משום שהם נגישים בנוחות להניב מספר רב של נוירונים. יתרונות נוספים של שימוש נוירונים SCG הם כי הם אוכלוסייה הומוגנית יחסית של תאים היטב מאופיין 1,2,3,4. א הכנה של פלסמיד cDNA להזרקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע זיהום או קלקול של ה-DNA, יש ללבוש כפפות במהלך תקופת ההכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-DNA המקודד את החלבון של הריבית subcloned לתוך וקטור ביטוי מתאים של יונקים, כגון PCI (Promega, מדיסון, ויסקונסין), לפי תקנה של האמרגן מאוד פעיל constitutively ציטומגלווירוס (CMV). אם החלבון לא מסומן, לכתב פלסמיד, EGFP קידוד למשל (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, פאלו אלטו, קליפורניה), היא שיתוף הזריק זריקה כדי לאשר ביטוי מוצלח. DNA הוא מבודד באמצעות איכות גבוהה ההפרדה עמודה (למשל Midi-QIAfilter ערכת הכנה, Qiagen, Chatsworth, CA) וטיהר נוסף באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי עם מסנן PVDF (0.1 מיקרומטר, Millipore, בדפורד, מסצ&#39;וסטס) כדי להסיר חלקיקים ב הכנה פלסמיד, שיכולה לחסום זריקה pipets במהלך תהליך ההזרקה. פלסמידים מאוחסנים ב -20 ° C בריכוז של כ 1 מיקרוגרם / μl ב חיץ האחסון המתאימה DNA (למשל חיץ TE: 10 mM טריס, 1 mM EDTA, pH 8.0). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסמוך לפני microinjection, cDNAs פלסמיד הם בדילול מעורב לריכוז הסופי הרצוי TE חיץ או H 2 O. בדרך כלל, 50-10 ng / μl של הגן הכתב די תווית התאים מוזרקים, ואת הריכוז הכולל של cDNA להיות מוזרק לא יעלה על 200 ng / μl מאז ה-DNA הוא צמיג בריכוזים גבוהים עלול להדביק pipets ההזרקה. נפח קטן של cDNA להזרקה (μl 50-10) הוא הוכן על ידי טיפות ערבוב של הפתרון על פני השטח נקי של חתיכה קטנה של Parafilm (צד מתחת לגבות את הנייר). מערבבים את טיפות של תמיסת יחד pipeting מעלה ומטה מספר פעמים עם pipetor ולמנוע החדרת בועות אוויר במהלך ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pipet microloader קצה (Eppendorf, Brinkmann מכשירים, ווסטבורי, ניו יורק), להעביר את הפתרון cDNA לצינור המטוקריט שהוכנו במיוחד (פישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה). ראה סעיף חומרי לקבלת הוראות על הכנת צינורות המטוקריט (לוח חומרים). מניחים את הצינור המטוקריט המכיל את פתרון cDNA הזרקה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הצינור 15-30 דקות ב 000 גרם 10 microcentrifuge מצויד הרוטור דלי קבוע זווית או נדנוד (Eppendorf), בטמפרטורת החדר (20-24 ° C) לחלקיקים משקעים בפתרון cDNA אשר עלול לחסום את microinjection pipet. הפתרון הזרקת cDNA יכולים להישמר בטמפרטורת החדר במהלך הפגישה ההזרקה. </li></ol> ב ייצור של הזרקה pipets <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנויה microinjection pipets זכוכית זמינים מסחרית (Femtotips למשל, Eppendorf), אשר נוח אך יקר (10 דולר pipet microinjection). Pipets הזרקת יכול להיות מיוצר במעבדה באמצעות P-97 לתכנות Flaming חולץ pipet בראון (החברה סאטר Instrument, Novato, CA) ואת filamented, דק דופן צינורות זכוכית בורוסיליקט נימי (מכשירים Precision העולם, סרסוטה, פלורידה). אפשרות זו היא חסכונית יותר ומאפשר שליטה על הצורה microinjection pipet וגודל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוכנית שני שלבים משמש למשוך צר pipet טיפים microinjection. מאז פתיחת pipets microinjection צר מדי לבדוק תחת מיקרוסקופ אור, איכות pipets הזריקה חייבת להיבדק באופן ישיר על ידי הזרקת תאים ספורים לפני הגדרות התוכנית הם סופיים. להלן הגדרות המשוער עבור הגדרות, חום למשוך, מהירות וזמן: (למשוך 1) 600, 115, 15, 250; (למשוך 2) 640, 130, 65, 200. הגדרות אלה משתנות עם קבוצות שונות של זכוכית על ידי מצבו של החוט חימום חולץ, וצריך להיות מותאם לפי הצורך. לפרטים נוספים ראה 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך כמה (2-5) pipets הזרקה לכל צלחת של נוירונים להיות מוזרק, במקרה של נזק או בעיות במהלך הפגישה ההזרקה. חנות pipets ההזרקה במיכל מכוסה כדי למנוע אבק מלהיכנס קצה pipet microinjection. </li></ol> השנייה. Intranuclear microinjection &quot;אוהל&gt; סעיף זה מפרט את התהליך של הזרקת cDNA לתוך הגרעין של נוירונים. microinjection בסיסי הגדרת כוללת מיקרוסקופ הפוכה שלב ניגודיות (למשל ניקון Diaphot TMD, ניקון, מלוויל, ניו יורק) כדי להמחיש את התהליך, micromanipulator (למשל Eppendorf 5171) כדי לשלוט על תנועת pipet הזריקה לחץ ההזרקה (למשל Eppendorf FemtoJet אקספרס) לגרש את הפתרון cDNA מ pipet. חיבור לחץ ההזרקה כדי micromanipulator מאפשר סנכרון של שני התהליכים האחרונים במהלך זריקות. אחרות אופציונלי, אך מומלץ מאוד, כוללים רכיבים ניטור רכוב מערכת וידאו (מצלמת CCD, Cohu Inc, בסן דייגו, קליפורניה; שחור ולבן וידאו לפקח, Sony Corporation, טוקיו, יפן). מערכת זו אינה דרישה מוחלטת זריקות; עם זאת, צג שחור לבן מציעה ניגודיות גבוהה עבור להדמיה משופרת של גרעין התא מציעה חוויית צפייה נוחה יותר במהלך הפגישות הזרקה רב. בנוסף, המחשב הנייד פועל תוכנה להפעלת בקר כף יד יכול להיות מנוצל כדי למחצה להפוך את תהליך ההזרקה (ראה דיון לפרטים נוספים). הזמן האידיאלי להזריק נוירונים SCG הוא 3-6 שעות שלאחר ניתוק. בשלב זה, התאים הם כדוריים, מחוברת בחוזקה אל החלק התחתון של המנה, ואת הגרעין נראה בבירור, תחת מיקרוסקופ שלב לעומת זאת, כמו מרכזי עגול אברון עם קרום כהה, המכיל nucleoli בודדות או מרובות (איור 1A). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת של נוירונים ניתק במרכז הבמה מיקרוסקופ. התאם את המיקוד לייעל את הניגוד שלב האופטיקה של המיקרוסקופ כך גרעינים של נוירונים הם נראים בבירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 Pipet μl של פתרון cDNA שהוכן לתוך pipet microinjection באמצעות קצה pipet microloader. הימנע עריכת פתרון קרוב לתחתית של התחתית המטוקריט שכן הדבר עלול לעורר חלקיקים כי התיישבו במהלך צנטריפוגה. נימה של pipets microinjection צריך עזרה בציור פתרון קצה, אך אם בועות אוויר קטנות נמשכות, קפיצי בעדינות את הצד של הזכוכית כדי לסלק אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את pipet microinjection לתוך מחזיק נימי של לחץ ההזרקה ולאחר מכן כדי להבטיח את בעל micromanipulator. בעל קבוע בזווית של ° 45. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את pipet microinjection לתוך המנה. כפי pipet נכנס בינוני תרבות, המניסקוס נוצר המשפיעה על שבירה של אור מוריד את איכות התמונה של הנוירונים. כדי להקל על בעיה זו, בצריח טבעת שלב ניתן לקזז מעט עד גרעינים של נוירונים גלויים לעין שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש מערכות הזרקת הלחץ יש תפקיד &quot;נקי&quot; כי חל לחץ האוויר המקסימלי מקצה microinjection pipet למשך זמן קצר. השתמש בפונקציה זו כדי לנקות את pipet של פסולת לפני תחילת במהלך זריקות אם את קצה מופיע סתומים. אם נוזל הפיג אינו גלוי על המסך, תוך שימוש בפונקציה זו, להחליף עם pipet זריקה חדשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרכז pipet microinjection לפקח על צפייה ליישר את קצה ליד נוירון ועל המטוס מוקד זהה nucleolus. קביעת עמדה זו כמו להגביל את Z-ציר נמוך micromanipulator. עמדה זו היא העומק pipet microinjection יהיה להתקדם במהלך זריקות. עכשיו עמדת קצה כ 30 מיקרומטר מעל לנקודה זו ולכן pipet microinjection מנקה את החלק העליון של נוירונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> &quot;להזריק&quot; מצב של micromanipulator Eppendorf 5171 יכולה להיות מוגדרת עם ההגדרות הבאות לבצע זריקות intranuclear. הפונקציה להזריק מוגדר על, בעוד פונקציה לדקור הוא הפסיק. שביל זריקה באלכסון (לאורך ה-X ו-Z ציר) מייצרת את הכמות המינימלית של נזק לתאים, ולכן במצב צירית אמור לשמש זריקות. מהירות הזריקה של 300 מיקרומטר / s מספיק, ולסנכרן את הלחץ הצטברות כאשר pipet microinjection מגיע להגדיר Z-ציר הגבול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלחץ ההזרקה שולט כמות פתרון cDNA מוזרק לתוך הגרעין. בכל מצב &quot;אוטומטי&quot; הזריקה, את המסירה של ה-DNA הוא זמן שבשליטת ביוזמת micromanipulator המחובר. הלחץ הזרקה (PI) צריך להיות מוגדר בין 100-200 hectopascals (hPa: 1 hPa ~ 0.015 psi); לחצי הזרקה גבוה לא לשפר את שיעורי ההצלחה או האיכות של זריקות עשוי להצביע על בעיות אחרות עם גודל pipet קצה microinjection או דנ&quot;א טוהר . משך ההזרקה (TI) של 0.3 ו - s לחץ פיצוי (PC) של 30 hPa, המספקת לחץ חיובי קבוע, כדי למנוע כניסתם של occluding חלקיקים מן המדיום תרבות לתוך קצה pipet, אמור לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את נוירון להיות מוזרק תחת קצה pipet microinjection באמצעות xy ציר של מיקרוסקופ בקרת הבמה. יישר את קצה pipet לעיל במרכז הגרעין ידי התמקדות הלוך ושוב בין tהוא קצה ועל nucleoli. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק את הגרעין ידי לחיצה על כפתור להזריק (על micromanipulator). עבור השלב הזרקה, תנועת pipet microinjection ואת שחרורו של cDNA הפתרון נשלטים על ידי micromanipulator. קשה לאשר זריקות intranuclear מוצלח לפי העין, אבל את הזריקה של הפתרון צמיגות נמוכה יחסית cDNA (לעומת הסביבה גרעיני צמיגה), לעתים קרובות מופיעה נוצה לבנה תחת שלב בניגוד אופטיקה יכול לשמש אינדיקטור הזרקה לתוך הגרעין. לפעמים pipet microinjection לא לחדור את קרום הגרעין פשוט דוחף את הגרעין. ניסיון זריקה שנייה תנוחה עשוי להוביל זריקה מוצלחת של ה-DNA לתוך הגרעין. נפיחות של התא מעיד בדרך כלל בהזרקה cytoplasmic מכוונת. כמו כן, נפיחות גרעיני משמעותי אינו נסבל היטב על ידי נוירונים ובדרך כלל גורמת מוות של תאים זמן קצר לאחר מכן, ולכן הלחץ הזרקת ומשך לא יעלה על הערכים שהציע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך על ידי הזרקת נוירונים מחדש את הבמה מיקרוסקופ כדי ליישר את הנוירון הבא תחת pipet microinjection. שיטתי לנווט המנה להזריק כ 50-100 גרעינים לפני החזרת צלחת של נוירונים אל האינקובטור עבור הדגירה לילה. נוירונים מוזרק בהצלחה ניתן לזהות למחרת על ידי הביטוי של הגן הכתב. </li></ol> ג. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/1614/1614fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: סופיריור צוואר הרחם (SCG) נוירונים גנגליון. בניגוד שלב תמונה של SCG נוירונים 3 שעות שלאחר ניתוק (A). בשלב זה, גרעין נראה בבירור אשר מסייע יישור קצה pipet microinjection. גרעין מופיע במרכז של נוירונים עם nucleoli (מימין) בודדת (משמאל) או מרובות כהה. SCG נוירונים 16 שעות לאחר הזרקת EGFP cDNA לתוך הגרעין (B). השמאל, SCG נוירונים שנצפו תחת תאורה שלב ניגודיות. נכון, התמונה epifluorescent של הנוירונים אותו מראה זריקה מוצלחת כתוצאה ביטוי EGFP ב נוירון אחד. בר לבן מידה הוא 20 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/1614/1614figure2tmb.jpg" alt="איור 2" border="0" /> איור 2: Whole-cell הקלטות של זרמים דרך heterologously-G-חלבון לידי ביטוי בשילוב פנימית לתיקון K + (GIRK) ערוצים SCG נוירונים. GIRK זרמים (אני GIRK) היו מעוררים על ידי כבש ms מתח מ 200 ל -140 mV 40 מתוך פוטנציאל החזקת -60 mV (הבלעה של A) ההפעלה הבאה של אנדוגני α 2-adrenoceptors ידי ונוראפינפרין (NE, 10 מיקרומטר) . עקבות על גבי הקלטות מן הנוירון אותו עולה לפני (שחור) לאחר יישום לבד NE (כחול) או NE פלוס 10 mM Ba 2 + (אדום). קווים מקווקווים מציינים את הרמה הנוכחית אפס. להקלטת אני GIRK, הפתרון חיצוני הכיל (מ&quot;מ) 130 NaCl, KCl 5.4, 10 HEPES, 10 CaCl 2, 0.8 MgCl 2, 15 גלוקוז, סוכרוז 15, ו - 0.0003 TTX, מותאם pH 7.4 עם NaOH. פתרון הקלטה פנימית הכיל (מ&quot;מ) 135 KCl, 11 EGTA, CaCl 2 1, 2 MgCl 2, 10 HEPES, MgATP 4, 0.3 ו - Na 2 GTP, מותאם pH 7.2 עם KOH. המחסור הנוכחי שהושרו על ידי הרמפה מתח בנוכחות NE ב uninjected נוירונים SCG (א) מוכיח כי נוירונים SCG אינם מבטאים ערוצי GIRK אנדוגני. זריקה מוצלחת של קידוד cDNA פלסמיד פונקציונלי GIRK ערוץ 11 מעורר זרמים גדולים במהלך כבש את המתח כאשר הם נחשפים NE (B, משמאל). זרמים בעלי מאפיינים טיפוסיים של זרמים בערוצים GIRK: הפעלה על ידי אגוניסט G-חלבון קולטן מצמידים (NE), תיקון פנימה, ולחסום של זרמים ידי חוסם ערוץ המשוערת GIRK, Ba 2 + (B, ממש זכר אדום). החוגים פתח ומילא מייצגים אני GIRK על החזקת ואת השיא הנוכחי, בהתאמה. אנא <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1614/1614figure2.jpg">לחץ כאן</a> כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2.

<ol>
	<li>Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential+of+the+superior+cervical+ganglion.">The action potential of the superior cervical ganglion.</a> J Physiol. 85, 179-206 (1935).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+modulation+of+N-type+calcium+channels+by+G-protein+&#x03B2;&#x03B3;+subunits.">Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein &#x03B2;&#x03B3; subunits.</a> Nature. 380, 255-258 (1996).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Brain Res. 485, 205-214 (1989).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+and+calcium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Pflugers Arch. 411, 481-490 (1988).</li><li>Dean, D. A., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Live Cell Imaging: a Laboratory Manual. 1, 51-66 (2005).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+receptors+and+signaling+proteins+in+adult+mammalian+sympathetic+neurons+by+microinjection.">Heterologous expression of receptors and signaling proteins in adult mammalian sympathetic neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 83, 191-202 (1997).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+G-protein+signaling+components+in+adult+mammalian+neurons+by+microinjection.">Expression of G-protein signaling components in adult mammalian neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 259, 167-181 (2004).</li><li>Ikeda, S. R., Jeong, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGS-insensitive+G&#x03B1;+subunits+to+study+endogenous+RGS+protein+action+on+G-protein+modulation+of+N-type+calcium+channels+in+sympathetic+neurons..">Use of RGS-insensitive G&#x03B1; subunits to study endogenous RGS protein action on G-protein modulation of N-type calcium channels in sympathetic neurons..</a> Methods Enzymol. 389, 170-189 (2004).</li><li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+gene+transfer+into+neurons.">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Curr Opin Neurobiol. 12, 566-573 (2002).</li><li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology.">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30, 606-610 (2008).</li><li>Vivaudou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+G-protein+regulation+of+GIRK1+and+GIRK4,+the+two+subunits+of+the+KACh+channel,+using+functional+homomeric+mutants.">Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants.</a> J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).</li></ol>

בעיות נפוצות נתקל והצעות: כפי שהוזכר קודם לכן, זריקות גרעיני מוצלח תלוי שיש תאים חסיד אל צלחות בתרבית רקמה. דחיית תחילת זריקות כמה שעות לאחר הליך תא דיסוציאציה מאפשר נוירונים לדבוק בתחתית הכלים. בנוסף, מנות עם ציפוי 0.1 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של משקל מולקולרי גבוה פולי-L-ליזין (Sigma, סנט לואיס, מיזורי) עזרי הידבקות של נוירונים על פני השטח התחתון של הכלים. חסימה של pipets microinjection, במיוחד כאשר מנסים להזריק ריכוז גבוה של ה-DNA, יכולה להיות בעיה תכופים. באמצעות הפרדה גבוהה עמודות איכות לבודד ולטהר פלסמיד דנ&quot;א, ואת ביצוע הפעולות טיהור נוספים שהוזכרו (מסננים ספין, מסתובב צינורות המטוקריט) יכול לעזור להסיר חלקיקים לפני הזרקה. במהלך זריקות, הפונקציה &quot;נקי&quot; של לחץ ההזרקה אפשר להשתמש (עבור s 0.2 מספיק), אבל אם זה לא פותר את הבעיה, pipet הזרקה חדשה יש להשתמש. אם רוב pipets microinjection להיות סתומים במהלך הפגישה זריקה, שקול לשנות את ההגדרות של חולץ pipet זכוכית כדי לייצר pipet טיפים microinjection עם פתח גדול יותר. סוגיה נוספת שעולה במהלך זריקות גרעיני הוא חוסר האחידות של פני השטח התחתון של מנות בתרבית רקמה. השתנות זו משפיע ישירות על דיוק המיקוד של טיפים pipet זריקה לגרעין מאז עומק שחוצה pipet במהלך זריקות קבוע. לכן, להגביל את זה Z-ציר חייב להיות מותאם במהלך זריקות בתוך צלחת אחת. זה יהיה ברור כאשר התאמה הכרחית: לא תהיה אינדיקציה הזרקת גרעיני (לא נוצה לבנה או בגרעין התא הוא החמיץ לחלוטין), או קצה pipet הזרקת מתקרב לתחתית הקערה (דחיסת התא או אפילו את קצה pipet מתרסק לתוך החלק התחתון של המנה). זכוכית שיבוט צילינדרים (. OD 10 מ&quot;מ, חתול מס &#39;2090-01010, Bellco זכוכית, Vineland, NJ) יכול לשמש במהלך ציפוי של נוירונים להגביל אותם באזור קטן יותר מצומצם יותר, ולכן צמצום המרחק הנדרש כדי להעביר pipet בין הזרקת זריקות. גלילים אלה שיבוט יוסרו לפני ביצוע microinjections. החסרונות של השיטה: Microinjections Intranuclear הם תובענית מבחינה טכנית, אשר דורשים סבלנות רמה גבוהה של מיומנות ידנית על ידי המפעיל. בקיאות עם הטכניקה הזו, כמו עם מיומנות אחרת, מגיע עם התרגול. לכן, מומלץ לתרגל זריקות הגרעין של הגן כתב לבד לפני שתנסה ניסויים בפועל. כדי להמשיך ולסייע בתהליך הזרקה, יתכן שניתן יהיה לגבש את הצעדים של micromanipulator והלחץ מזרק לתוך תוכנת מחשב. תוכניות כגון איגור Pro (WaveMetrics, אגם Oswego, OR) יכול להיות מנוצל כדי לשמור הגדרות microinjection ו לתוכנית בקרי רב תכליתיים (ShuttlePro, קונטור עיצוב, ווינדהאם, NH) כדי למחצה להפוך את תהליך ההזרקה (ראה 6,7,8 עבור לפרטים נוספים). חסרון נוסף של הטכניקה microinjection intranuclear הוא שיעור הצלחה נמוך. כ 10-20% של זריקות גרעיני ניסו להוביל ביטוי חלבון. בעוד יעילות זה עשוי להיות מספיק עבור יישומים שאינם דורשים מספר גדול של תאים לבטא, electrophysiology למשל, עבור מבחני ביוכימיים שונים זה עלול שלא להספיק. יישומים של הטכניקה: למרות חסרונות, microinjection intranuclear של ה-DNA הוא טכניקה שימושית מאוד עבור heterologously לבטא חלבונים נוירונים. רמות גבוהות של ביטוי חלבון מושגות עם microinjections גרעיני בגלל מספר גדול של פלסמידים שוחרר לתוך הגרעין במהלך זריקות, מקדם מאוד פעיל CMV בוויסות שעתוק הגנים, יציבות ארוכה של פלסמידים בגרעין. חלבון על הביטוי הוא שימושי במיוחד דומיננטי שלילי בניסויים שבהם רמות גבוהות של חלבונים Heterologous נדרשים להכריע את חלבון אנדוגני. יתרון נוסף של intranuclear זריקות היא היכולת לספק את חלק עקבית של בונה cDNA לגרעין כאשר בונה מרובים מוזרקים. בעזרת שיטות transfection אחרים, קשה reproducibly להציג שיעור זהה של ה-DNA בכל לבנות לתוך תאים שונים בתוך התבשיל זהה בין transfections. הזרקה ישירה של פתרון cDNA לתוך הגרעין זה מבטל מקור שונות ומאפשר יחס של חלבונים הביע להיות titered ביעילות. שיטות transfection מסורתית יש יעילות מוגבלת שלאחר mitotic תאים בגלל התאגדות נמוכה של דנ&quot;א לתוך הגרעין 9 רעילות כימית הקשורים reag transfectionלהורים 10. Microinjections גרעיני להתגבר על בעיות אלו על ידי החדרת חומר גנטי מכני לתוך הגרעין. למרות הטכניקה הזו הוא מעורב יותר, את היכולת ללמוד את ההשפעה של חלבון במערכת ביולוגית תפקודית, להשלים עם מסלולי איתות אנדוגני, יותר מפצה על אופיו מייגע של טכניקה זו. כל הליכי הניסוי על בעלי חיים בוצעו בהתאם המכונים הלאומיים לבריאות של הנחיות לטיפול בבעלי חיים ולשימוש.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ultrafree-MC Filter Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC30VV00</td>
<td>Durapore PVDF filter; 0.1 &mu;m pore-size</td>
</tr>
<tr>
<td>TE buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Quality Biological, Inc</td>
<td>351-010-131</td>
<td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro-hematocrit capillary tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22-362-574</td>
<td>Unheparinized Preparation: 
Soak in 100% ethanol overnight. Wash thoroughly with deionized water three times and dry bake glass in an oven (95&deg;C). Cut the cleaned hematocrit tubes into 3-4 cm length pieces using a diamond-tipped scriber, and seal one end closed with a flame and forceps to hold the glass. Store in a clean glass beaker and cover to prevent dust build-up. </td>
</tr>
<tr>
<td>Microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5417 R</td>
<td>With a fixed angle or swinging-bucket rotor</td>
</tr>
<tr>
<td>Microloader 20 &mu;l pipet tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242 956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection capillary glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW120F-4</td>
<td>Thin-walled with filament, 1.2 mm outer-diameter, 0.9 mm inner-diameter, 100 mm length</td>
</tr>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>With platinum-iridium box filament (part # FB330B)</td>
</tr>
<tr>
<td>Nikon Diaphot TMD Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>20x and 40x phase-contrast objective lenses, mounted on a vibration isolation table</td>
</tr>
<tr>
<td>Charge-coupled device (CCD) camera </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cohu Inc.</td>
<td>6410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Video monitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sony Corporation</td>
<td>PVM-122</td>
<td>Black and White, 9&#x201D; screen </td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5171</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>FemtoJet Express</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Contour Design</td>
<td>S-PROV2</td>
<td>Programmable multimedia controller</td>
</tr>
<tr>
<td>Igor Pro</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WaveMetrics</td>
<td>Version 4.05A</td>
<td>Command program to control the microinjection controller written by S. Ikeda</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

intranuclear microinjection of dna into dissociated adult mammalian neurons

ראשי בתרביות תאים עצביים הם כלי רב ערך כדי ללמוד לתפקד חלבון כיוון שהם מייצגים מערכת יותר רלוונטי מבחינה ביולוגית לעומת שורות תאים הונצח. עם זאת, טבע פוסט mitotic של נוירונים העיקרי מונע חלבון יעיל הביטוי Heterologous באמצעות הליכים נפוצים כגון electroporation או כימית בתיווך transfection. לפיכך, טכניקות אחרות חייב להיות מועסק על מנת לבטא בצורה יעילה החלבונים האלה בתאים שאינם מתחלקים. במאמר זה נתאר את הצעדים הנדרשים לביצוע זריקות intranuclear של מבנים cDNA לתוך ניתק נוירונים אוהד מבוגר. טכניקה זו, אשר הוחל על סוגים שונים של נוירונים, מצליח לגרום ביטוי חלבון Heterologous. ציוד חיוני עבור ההליך microinjection כוללת מיקרוסקופ הפוך לדמיין תאים, זריקת כוס pipet מלאים פתרון cDNA המחובר מערכת N 2 (g) משלוח לחץ, micromanipulator. Micromanipulator מרכזת את ההצעה הזרקת pipet microinjection עם הדופק קצרה של N 2 בלחץ להוציא cDNA פתרון מקצה pipet. טכניקה זו אין רעילות הקשורות הרבה שיטות transfection אחרים ומאפשר בונה DNA מרובים להתבטא ביחס עקבי. מספר נמוך של תאים מוזרק הופכת את ההליך microinjection גם מתאים מחקרים תא בודד כגון הקלטות הדמיה אלקטרו אופטית, אבל לא יכול להיות אידיאלי עבור מבחני ביוכימיים הדורשים מספר גדול יותר של תאים transfection יעילות גבוהה יותר. למרות microinjections intranuclear דורשים השקעה של ציוד הזמן, את היכולת להשיג רמות גבוהות של ביטוי חלבון Heterologous בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית עושה את הטכניקה הזאת כלי שימושי מאוד לחקור את תפקוד החלבון.

Watch this Scientific Journal Video about Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons at JoVE.com

Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

הזרקה ישירה של intranuclear cDNA היא טכניקה יעילה transfection שלאחר mitotic תאים. שיטה זו מספקת רמות גבוהות של ביטוי חלבון מן Heterologous בונה cDNA בודדות או מרובות ומאפשר תפקוד החלבון להיחקר בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית עם מגוון רחב של מבחני תא בודד.

Microinjection Intranuclear של דנ&quot;א לתוך ניתק נוירונים היונקים למבוגרים

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

intranuclear-microinjection-dna-into-dissociated-adult-mammalian

Google

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K Views.  National Institutes of Health (NIH). הזרקה ישירה של intranuclear cDNA היא טכניקה יעילה transfection שלאחר mitotic תאים. שיטה זו מספקת רמות גבוהות של ביטוי חלבון מן Heterologous בונה cDNA בודדות או מרובות ומאפשר תפקוד החלבון להיחקר בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית עם מגוון רחב של מבחני תא בודד.

Video: Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

הכנת ניתק תרבויות עכבר קליפתיים Neuron

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

ה-DNA transfection של שרירי השלד היונקים באמצעות In vivo Electroporation

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

ניתוח תיקון DNA פעמיים גדיל Break (DSB) בתאי יונקים

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

הזרקה לתוך intraperitoneal דג הזברה למבוגרים

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

ניתוח פונקציה של GTPases קטנים על ידי Microinjection של פלסמידים לתוך תאים אפיתל מקוטב

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

השתלה של תאים ישירות לתוך הכליה של דג הזברה למבוגרים

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

בידול יעיל של תאים עכבר גזע עובריים לתוך הנוירונים המנוע

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic knockdown system, we showed novel functions for HDAC1,2 in replication fork progression and nascent chromatin maintenance in mammalian cells. Additionally, we used a BrdU-ChIP-Slot-Western technique that combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) of bromo-deoxyuridine (BrdU)-labeled DNA with slot blot and Western analyses to quantitatively measure proteins or histone modification associated with nascent DNA.
Actively dividing cells were treated with HDAC1,2 selective inhibitor or transfected with siRNAs against Hdac1 and Hdac2 and then newly synthesized DNA was labeled with the thymidine analog bromodeoxyuridine (BrdU). The BrdU labeling was done at a time point when there was no significant cell cycle arrest or apoptosis due to the loss of HDAC1,2 functions. Following labeling of cells with BrdU, chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone acetylation marks or the chromatin-remodeler was performed with specific antibodies. BrdU-labeled input DNA and the immunoprecipitated (or ChIPed) DNA was then spotted onto a membrane using the slot blot technique and immobilized using UV. The amount of nascent DNA in each slot was then quantitatively assessed using Western analysis with an anti-BrdU antibody. The effect of loss of HDAC1,2 functions on the levels of newly synthesized DNA-associated histone acetylation marks and chromatin remodeler was then determined by normalizing the BrdU-ChIP signal obtained from the treated samples to the control samples.

In this protocol, we describe a novel BrdU-ChIP-Slot-Western technique to examine proteins and histone modifications associated with newly synthesized or nascent DNA.