저희 실험실의 연구는 NIH의 교내 연구 프로그램, 알코올 남용과 알코올 중독에 국립 연구소에 의해 지원됩니다.

<html> 주사 I. 준비 이 섹션에서는 뉴런의 핵으로 cDNA 주입하기 전에 이동해야하는 준비 단계를 설명합니다. 뉴런에 절연 절차는이 문서의 범위를 벗어나지만, 그것은 각각의 세포에 dissociated 뉴런을 가지고 있으며 (이것을 달성하기위한 유용한 정보에 대한 토론 참조) 35mm의 세포 배양 접시의 바닥 표면에 잘 준수하는 것이 중요합니다. 다른 뉴런의 다양한 잠재적으로 사용될 수 있지만 그들이 편리하게 이용할 수 있으며, 뉴런의 다수를 얻을 수 있기 때문에, 그러한 우수한 경추 신경 (SCG) 또는 지느러미 루트 신경으로 말초 신경은 해부 선호하고 있습니다. SCG 뉴런을 사용하는 추가적인 장점들은 세포의 비교적 동질적인 인구 것을하고 1,2,3,4를 잘 묘사. 주사에 대한 cDNA 플라스미드의 A. 준비 <ol><li> 오염이나 DNA의 고장을 방지하기 위해, 장갑은 준비 기간 동안 착용해야합니다. </li><li> 관심의 단백질을 인코딩 DNA는 고도와 constitutively 활성 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 발기인의 규정에 따라 이러한 PCI (Promega, 매디슨, WI)와 같은 적당한 포유 동물 발현 벡터,에 subcloned입니다. 단백질이 표시되지 않는 경우, 플라스미드 기자 예를 들어, 인코딩 EGFP는 (pEGFP - N1, BD Biosciences Clontech, 팔로 알토, CA), 성공적인 분사와 표현을 확인하는 공동 주입이다. DNA은의 입자를 제거하는 PVDF 필터 (0.1 μm의, Millipore, 베드 포드, MA)와 원심 필터 장치를 사용하여 고품질의 분리 칼럼 (예 : QIAfilter 미디 준비 키트, Qiagen, 챗스워스, CA)와 더 정화를 사용하여 격리 사출 과정에서 사출 pipets 방해가 될 수 있습니다 플라스미드 준비. Plasmids는 적절한 DNA 저장 버퍼 (: 10 MM 트리스, 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 산도 8.0 예 : TE 버퍼)에 약 1 μg / μl의 농도에서 -20 ° C에 저장됩니다. </li><li> microinjection 즉시 이전, 플라스미드 cDNAs는 TE 버퍼 또는 H 2 O.에서 원하는 최종 농도로 희석 및 혼합 일반적으로 50-10 NG / 리포터 유전자의 μl가 주입된 세포를 분류하기 위해 충분하고, DNA가 높은 농도에서 점성이며 사출 pipets을 방해할 수 있기 때문에 주입하는 cDNA의 총 농도는 200 NG / μl를 초과해서는 안됩니다. 분사에 대한 cDNA의 작은 볼륨 (5-10 μl)가 Parafilm (종이 후원 아래 쪽)의 작은 조각의 깨끗한 표면에 솔루션의 혼합 방울에 의해 준비가되어 있습니다. pipetor로 여러 번을 pipeting 아래에서 함께 솔루션의 방울을 혼합하고 혼합하는 동안 공기 방울을 도입하지 마십시오. </li><li> microloader의 pipet 팁을 (Eppendorf, Brinkmann 인 스트 루먼트, 베리, NY)를 사용하여, 특별히 준비 혈소판 튜브 (피셔 과학, 피츠버그, PA)에 cDNA 솔루션을 전송합니다. 혈소판 튜브 (자료 표) 준비에 대한 지침 자료 섹션을 참조하십시오. 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 cDNA 사출 솔루션을 포함하고있는 혈소판 튜브를 놓습니다. </li><li> 실내 온도 (20-24 ° C) 침전 입자로 cDNA 솔루션을 차단할 수에서 고정 각도 또는 스윙 버킷 로터 (Eppendorf)이 장착된 microcentrifuge 10 000g에 15-30 분 튜브를 원심 분리기 microinjection pipet. cDNA 분사 솔루션은 사출 세션 동안 실온에서 보관하실 수 있습니다. </li></ol> 사출 pipets의 B. 제작 <ol><li> 일회용 유리 microinjection의 pipets은 (microinjection의 pipet 당 $ 10) 편리하지만 비싼되는 (예 : Femtotips, Eppendorf) 상업적으로 사용할 수 있습니다. 사출 pipets는 프로그램 P - 97 플라밍 브라운 pipet의 풀러 (서터 악기 회사 노바토, CA)와 filamented, 얇은 벽으로 borosilicate 유리 모세관 튜브 (세계 정밀 계측기, 사라소타, 플로리다)를 사용하여 실험실에서 제조 수 있습니다. 이 옵션은 더 비용 효율적인 있으며, microinjection의 pipet의 모양과 크기의 제어를위한 수 있습니다. </li><li> 2 단계 프로그램은 좁은 microinjection의 pipet 팁 당겨하는 데 사용됩니다. microinjection의 pipets의 개통은 가벼운 현미경 검사가 너무 좁은 것이므로 분사 pipets의 품질은 프로그램 설정이 완료되기 전에 몇 가지 세포를 주사하여 직접 평가해야합니다. 다음은 열, 당겨, 속도 및 시간 설정에 대한 대략적인 설정은 다음과 같습니다 (당기 1) 600, 115, 15, 250, (당겨 2) 640, 130, 65, 200. 이러한 설정은 유리의 다른 일괄와 풀러의 가열 필라멘트의 상태에 따라 다를 수 있으며 필요에 따라 조정해야합니다. 5 참조 자세한 내용은을 보려면. </li><li> 사출 세션 중에 손상이나 문제의 경우, 주입하는 뉴런의 요리마다 여러 가지 (2-5) 사출 pipets을 당기세요. 스토어 사출 microinjection의 pipet 팁 입력에서 먼지를 방지하기 위해 대상 컨테이너에 pipets. </li></ol> II. Intranuclear microinjection 십t &quot;&gt;이 섹션에서는 세부 뉴런의 핵으로 cDNA 주입의 과정. 기본 microinjection은 설정 프로세스를 시각화하기 위해 거꾸로 위상 대비 현미경 (예 : 니콘 Diaphot TMD, 니콘, 멜빌, NY), micromanipulator를 (포함 예 pipet에서 cDNA 솔루션을 추방하기 위해 분사 pipet의 움직임과 압력 주입기 (예 : Eppendorf FemtoJet 익스프레스)를 제어할 수 Eppendorf 5171)가. micromanipulator에 압력 주입기를 연결 주사 중 후자의 두 프로세스의 동기화를위한 수 있습니다. 기타 옵션지만, 추천, 구성 요소가 장착된 비디오 모니터링 시스템 (CCD 카메라, Cohu 주식 회사, 샌디에고, CA, 흑백 비디오 모니터, 소니 주식 회사, 도쿄, 일본)가 있습니다.이 시스템은 주사에 대한 절대적인 요구하지 않습니다; 그러나, 흑백 모니터는 세포 핵의 개선 시각화를위한 높은 콘트라스트를 제공하며 긴 사출 세션 동안 더 편안하게 볼 수 경험을 제공합니다. 또한, 휴대용 컨트롤러를 작동하는 소프트웨어를 실행하는 노트북 컴퓨터에 세미 활용할 수 (자세한 내용은 토론 참조) 사출 과정을 자동화합니다. SCG 뉴런를 삽입하는 이상적인 시간은 3~6시간 이후 해리이다. 이 단계에서는 세포가 단단히 접시의 바닥에 붙어하고, 핵이 하나 또는 여러 개의 nucleoli (그림을 포함하는, 어두운 막과 중앙 둥근 organelle으로 위상 대비 현미경으로, 명확하게 볼 수 있습니다, 구형 아르 1A). <ol><li> 현미경 단계의 중앙에 dissociated 뉴런 한 접시를 놓습니다. 초점을 조절하고 신경의 핵이 명확하게 볼 수 있도록 현미경의 위상 콘트라스트 광학을 최적화합니다. </li><li> microloader의 pipet 팁을 사용하여 microinjection의 pipet으로 준비 cDNA 솔루션의 Pipet 2 μl. 이 원심 분리하는 동안 정착 입자를 저어 수 있으므로 혈소판 튜브 하단의 솔루션을 그리기하지 마십시오. microinjection의 pipets의 필라멘트 끝에 솔루션을 그리기에 도움이 있지만, 작은 기포가 발생하면 부드럽게 그들을 이동시키다하는 유리의 측면 버려해야합니다. </li><li> 압력 주입기의 모세관 홀더에 microinjection의 pipet를 삽입하고 다음 micromanipulator에 홀더를 확보. 홀더는 45 °의 각도로 고정됩니다. </li><li> 그릇에 microinjection의 pipet를 낮춥니다. pipet는 문화 매체를 입력으로 초승달 모양은 그 빛의 굴절에 영향을 주며 뉴런의 이미지 품질을 절감 형성됩니다. 뉴런의 핵이 다시 명확하게 표시되기 전까지는이 문제를 완화하려면 위상 링 터렛은 약간 오프셋 수 있습니다. </li><li> 일부 압력 분사 시스템은 짧은 기간 동안 microinjection의 pipet 팁에서 최대 공기 압력을 적용하는 &quot;깨끗한&quot;기능이 있습니다. 팁이 막혀 나타나는 경우에는 시작하기 전에 주사 중에 파편의 pipet을 지우려면이 기능을 사용하십시오. 이 기능을 사용하면서 무너 뜨 리신 액체가 화면에 표시되지 않으면, 새로운 사출 pipet로 바꿉니다. </li><li> 센터 microinjection의 모니터에서 보는 pipet과 신경 옆에와 nucleolus 같은 초점 비행기의 제보를 맞춥니다. micromanipulator에 낮은 Z 축 제한으로 위치를 설정합니다. 이 위치는 microinjection의 pipet은 주사하는 동안에 진출하게됩니다 깊이입니다. microinjection의 pipet은 뉴런의 맨 위에를 지우는 그래서 지금 약 30 μm의이 시점 위의 팁을 위치. </li><li> Eppendorf 5171 micromanipulator의 &quot;삽입&quot;모드는 intranuclear 주사를 수행하기 위해 다음과 같은 설정으로 정의할 수 있습니다. 주입 기능에 대한 설정, 찌르려고 기능이 해제 남아 반면. 대각선 주입 경로는 (X와 Z - 축을 따라) 세포 손상의 최소 금액을 생산하고, 따라서 축 모드는 주사에 사용해야합니다. 300 μm의 / s의 주사 속도가 충분하고, microinjection의 pipet는 Z 축 제한 설정에 도달하면 압력을 빌드 - 업 동기화할 수 있습니다. </li><li> 압력 주입기는 핵에 주입 cDNA 솔루션의 수량을 제어합니다. &quot;자동&quot;분사 모드에서, DNA의 전달 시간을 제어하고 연결 micromanipulator에 의해 시작됩니다. 사출 압력 (PI)는 100-200 hectopascals (, 1 고전력 증폭기 ~ 0.015 PSI 고전력 증폭기); 사이에 설정해야 높은 사출 압력 주사의 성공 속도 또는 품질을 개선하지 않으며 microinjection의 pipet 팁 크기 또는 DNA 순도 다른 문제를 나타낼 수 있습니다 . 0.3 s의 주입 기간 (TI)와 pipet 팁에 배지에서 입자 occluding의 항목을 피하기 위해 지속적으로 긍정적인 압력을 공급 30 고전력 증폭기의 보상 압력 (PC)를, 사용해야합니다. </li><li> 현미경의 XY 축 스테이지 컨트롤을 사용하여 microinjection의 pipet의 일각에 따라 주입하는 신경 세포를 놓습니다. t 사이에서 앞뒤로 초점에 의해 핵의 중앙 위에 pipet의 팁을 정렬그는 팁 및 nucleoli. </li><li> 주입 단추 (micromanipulator)에 눌러 핵을 주입. 사출 단계에 대한, microinjection의 pipet과 cDNA 솔루션의 릴리스의 움직임은 micromanipulator에 의해 제어됩니다. 그것은 눈으로 성공 intranuclear 주사를 확인하기 어렵지만, 상대적으로 낮은 점도 cDNA 용액의 주입 (점성 원자력 환경에 비해)는 종종 위상 대비 광학 아래 흰 깃털로 표시하고 주입의 지표로 사용될 수 핵으로. 가끔 microinjection의 pipet는 핵 막에 침투하지 않고 단순히 핵을 nudges. 같은 위치에서 두 번째 주입 시도가 핵에 DNA의 성공적인 주사가 발생할 수 있습니다. 세포의 팽창하는 것은 신성 모독이 세포질 주입 대개 나타내는 것입니다. 또한, 중요한 핵 붓기는 물론 곧 이후에 세포 죽음에 신경 일반적으로 결과가 용납하지 않습니다, 따라서 분사 압력과 기간은 제안된 값을 넘지 않아야합니다. </li><li> microinjection의 pipet에서 다음 신경 세포를 정렬하기 위해 현미경의 무대를 재배치하여 뉴런를 넣고 계속합니다. 체계적으로 하룻밤 배양을위한 인큐베이터로 뉴런의 요리를 제공하기 전에 약 50-100 핵을 삽입하기 위해 요리를 통해 이동합니다. 성공적으로 주입 뉴런은 기자의 유전자 표현하여 다음날 확인할 수 있습니다. </li></ol> III. 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/1614/1614fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 : 우수 자궁 경부 신경절 (SCG) 뉴런. 뉴런을 SCG의 위상 대비 영상 삼시간 후 분리 (A). 이 단계에서는 핵은 microinjection의 pipet 팁의 정렬 에이즈있는 명확하게 볼 수 있습니다. 핵은 단일 (왼쪽) 또는 여러 (오른쪽) 어두운 nucleoli와 뉴런의 중심에 나타납니다. 핵 (B)로 cDNA EGFP의 주입에 따라 뉴런 16 시간 SCG. 왼쪽, 위상 콘트라스트 조명 아래에 많이 신경을 SCG. 맞아, 성공적인 주사를 보여주는 하나의 신경 세포에서 EGFP 표현을 발생하는 동일한 뉴런의 epifluorescent 이미지. 화이트 규모 표시줄은 20 μm의 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1614/1614figure2tmb.jpg" alt="그림 2" border="0" /> 그림 2 : 전류를 통해 전체 세포 녹음 heterologously - 표현 G - 단백질 내심 신경을 SCG에서 K + (GIRK) 채널을 정류 결합. GIRK 전류 (I GIRK)는 -140에서 -60 뮤직 비디오의 개최 가능성에서 40 뮤직 비디오에 200 MS 전압 램프 (중 삽입된 페이지) norepinephrine에 의해 내생 α 2 - adrenoceptors 중 다음과 활성화 (NE, 10 μm의)에 의해 evoked되었습니다 . 겹쳐 흔적 전에 (검은색)와 NE 혼자 (파란색) 또는 NE 중 하나의 응용 프로그램에 추가로 10 MM 바 2 + (적색) 후 동일한 신경 세포에서 녹음되고 있음을 나타냅니다. 점선 라인은 제로 현재 수준을 나타냅니다. I GIRK, 포함된 외부 솔루션 (MM)를 130 NaCl, 5.4 KCl, 10 HEPES, 10 CaCl 2, 0.8 MgCl 2, 15 포도당, 15 자당과 NaOH로 pH의 7.4 조정 0.0003 TTX를 기록하십시오. 내부 녹음 솔루션 (MM)를 135 KCl, 11 EGTA, 1 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 HEPES, 4 MgATP, 그리고 코와 산도 7.2 조정 0.3 나 2 GTP를 포함. 현재의 부족이 uninjected SCG의 뉴런에서 NE의 존재에 전압 램프에 의해 elicited (A)는 SCG 뉴런은 내생 GIRK 채널을 표현하지 보여줍니다. NE (B, 왼쪽)에 노출되면 플라스미드 cDNA 인코딩 기능 GIRK 11 번 채널의 성공적인 주입은 전압 램프 중에 큰 전류에 상승을 제공합니다. G - 단백질 결합 수용체 작용제 (NE), 내면 정류 및 putative GIRK 채널 차단, 바 2 + (B, 오른쪽 붉은 추적)에 의해 전류 차단에 의해 활성화 : 해류가 GIRK 채널을 통해 전류의 전형적인 특성을합니다. 열고 채워진 동그라미가 나는 각각 잡고 정상 전류에 GIRK 나타냅니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1614/1614figure2.jpg">여기를 클릭</a> 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

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	<li>Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential+of+the+superior+cervical+ganglion.">The action potential of the superior cervical ganglion.</a> J Physiol. 85, 179-206 (1935).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+modulation+of+N-type+calcium+channels+by+G-protein+&#x03B2;&#x03B3;+subunits.">Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein &#x03B2;&#x03B3; subunits.</a> Nature. 380, 255-258 (1996).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Brain Res. 485, 205-214 (1989).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+and+calcium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Pflugers Arch. 411, 481-490 (1988).</li><li>Dean, D. A., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Live Cell Imaging: a Laboratory Manual. 1, 51-66 (2005).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+receptors+and+signaling+proteins+in+adult+mammalian+sympathetic+neurons+by+microinjection.">Heterologous expression of receptors and signaling proteins in adult mammalian sympathetic neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 83, 191-202 (1997).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+G-protein+signaling+components+in+adult+mammalian+neurons+by+microinjection.">Expression of G-protein signaling components in adult mammalian neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 259, 167-181 (2004).</li><li>Ikeda, S. R., Jeong, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGS-insensitive+G&#x03B1;+subunits+to+study+endogenous+RGS+protein+action+on+G-protein+modulation+of+N-type+calcium+channels+in+sympathetic+neurons..">Use of RGS-insensitive G&#x03B1; subunits to study endogenous RGS protein action on G-protein modulation of N-type calcium channels in sympathetic neurons..</a> Methods Enzymol. 389, 170-189 (2004).</li><li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+gene+transfer+into+neurons.">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Curr Opin Neurobiol. 12, 566-573 (2002).</li><li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology.">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30, 606-610 (2008).</li><li>Vivaudou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+G-protein+regulation+of+GIRK1+and+GIRK4,+the+two+subunits+of+the+KACh+channel,+using+functional+homomeric+mutants.">Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants.</a> J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).</li></ol>

일반적인 문제가 발생하여 제안 : 언급했듯이 이전, 성공적인 핵 주사는 조직 문화 판에 점착 성의 세포를 필요에 따라 달라집니다. 주사의 시작을 연기 세포 분리 절차를 따라 몇 시간이 뉴런은 요리의 하단을 준수 할 수 있습니다. 또한, 0.1 MG / 고분자량 폴리 - L - 라이신 (시그마, 세인트 루이스, MO) 요리의 하단 표면에 뉴런의 에이즈 접착력의 ML과 코팅 요리. DNA의 높은 농도를 삽입하려고 시도하는 특히 microinjection의 pipets의 차단은, 자주 문제가 될 수 있습니다. 플라스미드 DNA를 분리하고 정화 고품질의 분리 컬럼을 사용하고, (스핀 필터, 혈소판 튜브의 회전) 언급된 추가 정화 단계를 수행하면 이전에 주입하는 입자를 제거하는 데 도움이 될 수 있습니다. 주사하는 동안 압력 주입기의 &quot;깨끗한&quot;함수는 (0.2 s에 대한 충분합니다) 사용할 수 있지만 그 문제가 해결되지 않으면, 새로운 사출 pipet을 사용해야합니다. microinjection의 pipets의 대부분이 사출 세션 동안 막힌 될 경우, 더 큰 개방과 microinjection의 pipet 도움말을 생산하는 유리 pipet의 풀러의 설정을 변경 고려하십시오. 핵 주사하는 동안 발생 또 다른 문제는 조직 문화 요리의 바닥 표면의 얼룩이다. 이 변화는 바로 깊이 이후 주사하는 동안 pipet 탐색이 고정되는 핵에 주입 pipet 팁의 타겟팅 정확성에 영향을 미칩니다. 따라서,이 Z 축 제한은 같은 접시 내에 주사하는 과정 중에 조정해야합니다. 조정이 필요한 때 명백한 것입니다 (이 핵 주입에 대한 표시 (핵이나 세포가 완전히 놓친 것입니다에 없음 흰색 깃털) 없다, 또는 사출 pipet 팁 가까이 접시의 바닥에 오는 될 세포 압축 혹은) 접시의 바닥에 pipet 팁을 충돌. 유리 - 복제 실린더가 (. OD 10mm, 캣 번호 2090-01010, Bellco 유리, 바인랜드, 뉴저지)보다 작은 밀폐된 공간에서 그들을 제한하는 뉴런의 도금을하는 동안 사용할 수 있으므로 이동하는 데 필요한 거리를 최소화 주사 사이 사출 pipet. 이러한 복제 실린더는 microinjections를 수행하기 전에 제거됩니다. 기술의 단점 : Intranuclear microinjections은 기술적으로 인내와 운영자가 수동 손재주의 높은 수준을 요구하는, 요구하고 있습니다. 이 기술 능력, 다른 기술과 마찬가지로, 연습과 함께 제공됩니다. 그러므로, 그것은 실제 실험을 시도하기 전에 혼자 리포터 유전자의 핵 주사 연습 좋습니다. 더 사출 과정을 돕기 위해, 그것은 컴퓨터 프로그램에 micromanipulator과 압력 주입기의 단계를 통합하는 것이 가능해 질 수 있습니다. 이러한 이고르 프로 (WaveMetrics, 레이크 오스 베고, OR)와 같은 프로그램은 (대한 6,7,8 참조 microinjection 설정을 저장하고 반 자동화 사출 과정 다기능 컨트롤러 (ShuttlePro, 컨투어 디자인, 윈더험, NH) 프로그램에 활용할 수 세부 사항). intranuclear microinjection 기법의 또 다른 단점은 낮은 성공률이다. 시도 핵 주사의 약 10-20% 단백질 표현식로 이어집니다. 이 효율이 표현 세포의 많은 예를 들어, 전기 생리학, 다양한 생화학 assays이 충분하지 않을 수 있습니다 필요하지 않은 애플 리케이션을위한 충분히있을 수 있습니다 반면. 기술의 응용 : 그 결점에도 불구하고, DNA의 intranuclear microinjection은 heterologously 뉴런의 단백질을 표현하는 매우 유용한 기술입니다. 단백질 표현의 높은 수준 때문에 주사, 유전자 전사, 그리고 핵의 plasmids 긴 안정성을 조절 높은 활성 CMV 프로 모터 동안 핵에 출시 plasmids의 다수의 핵 microinjections 함께 얻을 수 있습니다. 표현 이상의 단백질은 단백질 heterologous 높은 수준의이 내생 단백질을 압도하는 데 필요한 지배 - 부정적인 실험에 특히 유용합니다. intranuclear 주사의 또 다른 장점은 여러 구성을 주입 때 핵으로 cDNA 구성의 일관성 비율을 제공하는 능력입니다. 다른 transfection 방법으로, 그것은 reproducibly 같은 접시 이내에 transfections 사이의 서로 다른 세포로 구성 각 DNA의 동일한 비율을 소개하기가 어렵습니다. 핵으로 cDNA 솔루션의 직접 분사는 다양성의 원인을 제거하고 표현 단백질의 비율이 효과적으로 titered 수 있습니다. 전통 transfection 방법 때문에 transfection의 reag과 관련된 핵 9 화학 독성에 DNA의 낮은 정관의 사후 mitotic 세포의 제한된 효과를 가지고엔트 10. 핵 microinjections는 핵에 기계적으로 유전 물질을 도입하여 이러한 문제를 극복합니다. 이 기술이 더 관련되어 있지만, 기능적인 생물 학적 시스템에서 단백질의 효과를 연구하는 능력,이 기술의 힘드는 자연에 대한 보상보다, 내생 신호 경로와 함께 완료되었습니다. 동물의 모든 실험 절차는 애니멀 케어 및 사용을위한 건강의 지침 국립 연구소에 따라 수행되었다.

<table><tbody><tr><td>Ultrafree-MC Filter Unit</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC30VV00</td><td>Durapore PVDF filter; 0.1 &amp;#x03BC;m pore-size</td></tr><tr><td>TE buffer</td><td>Quality Biological, Inc.</td><td>351-010-131</td><td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0</td></tr><tr><td>Micro-hematocrit capillary tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-574</td><td>Unheparinized Preparation:&lt;br/&gt;Soak in 100% ethanol overnight. Wash thoroughly with deionized water three times and dry bake glass in an oven (95&amp;#x00B0;C). Cut the cleaned hematocrit tubes into 3-4 cm length pieces using a diamond-tipped scriber, and seal one end closed with a flame and forceps to hold the glass. Store in a clean glass beaker and cover to prevent dust build-up. </td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5417 R</td><td>With a fixed angle or swinging-bucket rotor</td></tr><tr><td>Microloader 20 &amp;mu;l pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection capillary glass</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW120F-4</td><td>Thin-walled with filament, 1.2 mm outer-diameter, 0.9 mm inner-diameter, 100 mm length</td></tr><tr><td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>With platinum-iridium box filament (part # FB330B)</td></tr><tr><td>Nikon Diaphot TMD Inverted Microscope</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>20x and 40x phase-contrast objective lenses, mounted on a vibration isolation table</td></tr><tr><td>Charge-coupled device (CCD) camera </td><td>Cohu Inc.</td><td>6410</td><td></td></tr><tr><td>Video monitor</td><td>Sony Corporation</td><td>PVM-122</td><td>Black and White, 9&amp;#8221; screen </td></tr><tr><td>Micromanipulator system</td><td>Eppendorf</td><td>5171</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection Unit</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet Express</td><td></td></tr><tr><td>Microinjection controller</td><td>Contour Design</td><td>S-PROV2</td><td>Programmable multimedia controller</td></tr><tr><td>Igor Pro</td><td>WaveMetrics</td><td>Version 4.05A</td><td>Command program to control the microinjection controller written by S. Ikeda</td></tr></tbody></table>

intranuclear microinjection of dna into dissociated adult mammalian neurons

기본의 연결을 세포 문화는 그들이 영원히 세포 라인에 비해보다 생물학적으로 관련 시스템을 나타내는 이후 단백질 기능을 연구하기 위해 귀중한 도구입니다. 그러나, 기본 뉴런의 포스트 mitotic 자연은 electroporation 또는 화학적 - 중재 transfection과 같은 일반적인 절차를 사용하여 효과적인 heterologous 단백질 발현을 방지합니다. 따라서, 다른 기술은 효과적이 아닌 나누어 세포의 단백질을 표현하기 위해 채용해야합니다. 이 문서에서는, 우리는 dissociated 성인 동정 뉴런으로 cDNA 구성의 intranuclear 주사를 수행하는 데 필요한 단계를 설명합니다. 뉴런의 다른 유형에 적용되어이 기술은, 성공적으로 heterologous 단백질 발현을 유도하실 수 있습니다. microinjection 절차에 필수적인 장비는 세포, N 2 (g) 압력 전달 시스템에 연결된 cDNA 용액 가득한 유리 사출 pipet 및 micromanipulator을 시각화하기 위해 거꾸로 현미경을 포함합니다. micromanipulator은 pipet 팁로부터 cDNA 솔루션을 꺼낼 수 가압 N 2의 간단한 펄스로 microinjection의 pipet의 사출 움직임을 조정합니다. 이 기술은 다른 많은 transfection 방법과 관련된 독성을 가지고 일관된 비율로 표현되는 여러 DNA 구조를 가능하게하지 않습니다. 주입된 세포의 낮은 숫자는 물론 같은 electrophysiological 녹음 및 광학 이미징과 같은 단일 세포 연구에 적합 microinjection 절차를 만들지만, 세포 높은 transfection 효율의 큰 숫자를 요구 생화학 assays 적합하지 않을 수 있습니다. intranuclear microinjections는 장비와 시간 투자를 필요로하지만, 생리학 관련 환경에서 heterologous 단백질 표현의 높은 수준을 달성하는 능력이 기술에게 단백질 기능을 조사하기 위해 매우 유용한 도구를합니다.

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Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

cDNA의 직접 intranuclear 주사 후 mitotic 세포에 대한 효과적인 transfection 기술입니다. 이 방법은 하나 또는 여러 개의 cDNA 구조에서 heterologous 단백질 표현의 높은 수준을 제공하고 단일 셀 assays의 다양한 생리학 관련 환경에서 공부하는 단백질 기능을 수 있습니다.

Dissociated 성인 포유류의 뉴런으로 DNA의 Microinjection Intranuclear

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.8K 조회수.  National Institutes of Health (NIH). cDNA의 직접 intranuclear 주사 후 mitotic 세포에 대한 효과적인 transfection 기술입니다. 이 방법은 하나 또는 여러 개의 cDNA 구조에서 heterologous 단백질 표현의 높은 수준을 제공하고 단일 셀 assays의 다양한 생리학 관련 환경에서 공부하는 단백질 기능을 수 있습니다.

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Studying the Integration of Adult-born Neurons

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the hippocampal dentate gyrus throughout life. Previous reports have shown that adult hippocampal neurogenesis is associated with diverse brain disorders, including epilepsy, schizophrenia, depression and anxiety (1). Deciphering the process of normal and aberrant adult-born neuron integration may shed light on the etiology of these diseases and inform the development of new therapies.
SGZ adult neurogenesis mirrors embryonic and post-natal neuronal development, including stages of fate specification, migration, synaptic integration, and maturation. However, full integration occurs over a prolonged, 6-week period. Initial synaptic input to adult-born SGZ dentate granule cells (DGCs) is GABAergic, followed by glutamatergic input at 14 days (2). The specific factors which regulate circuit formation of adult-born neurons in the dentate gyrus are currently unknown.
Our laboratory uses a replication-deficient retroviral vector based on the Moloney murine leukemia virus to deliver fluorescent proteins and hypothesized regulatory genes to these proliferating cells. This viral technique provides high specificity and resolution for analysis of cell birth date, lineage, morphology, and synaptogenesis.
A typical experiment often employs two or three viruses containing unique label, transgene, and promoter elements for single-cell analysis of a desired developmental process in vivo. The following protocol describes a method for analyzing functional newborn neuron integration using a single green (GFP) or red (dTomato) fluorescent protein retrovirus and patch-clamp electrophysiology.

A way to study the integration of newborn dentate granule cells in adult animals is described. This technique uses an engineered retrovirus to label newborn neurons, followed by electrophysiological recordings to determine in vivo functional integration.

성인에서 태어난 뉴런의 통합을 공부

Neurogenesis occurs in adult mammalian brains in the sub-ventricular zone (SVZ) of the lateral ventricle and in the sub-granular zone (SGZ) of the ...

연구

신경과학

Genetic Study of Axon Regeneration with Cultured Adult Dorsal Root Ganglion Neurons

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability to support axon growth and a hostile environment in the mature CNS1,2. In contrast, mature neurons in the peripheral nervous system (PNS) regenerate readily after injuries3. Adult dorsal root ganglion (DRG) neurons are well known to regenerate robustly after peripheral nerve injuries. Each DRG neuron grows one axon from the cell soma, which branches into two axonal branches: a peripheral branch innervating peripheral targets and a central branch extending into the spinal cord. Injury of the DRG peripheral axons results in substantial axon regeneration, whereas central axons in the spinal cord regenerate poorly after the injury. However, if the peripheral axonal injury occurs prior to the spinal cord injury (a process called the conditioning lesion), regeneration of central axons is greatly improved4. Moreover, the central axons of DRG neurons share the same hostile environment as descending corticospinal axons in the spinal cord. Together, it is hypothesized that the molecular mechanisms controlling axon regeneration of adult DRG neurons can be harnessed to enhance CNS axon regeneration. As a result, adult DRG neurons are now widely used as a model system to study regenerative axon growth5-7.
Here we describe a method of adult DRG neuron culture that can be used for genetic study of axon regeneration in vitro. In this model adult DRG neurons are genetically manipulated via electroporation-mediated gene transfection6,8. By transfecting neurons with DNA plasmid or si/shRNA, this approach enables both gain- and loss-of-function experiments to investigate the role of any gene-of-interest in axon growth from adult DRG neurons. When neurons are transfected with si/shRNA, the targeted endogenous protein is usually depleted after 3-4 days in culture, during which time robust axon growth has already occurred, making the loss-of-function studies less effective. To solve this problem, the method described here includes a re-suspension and re-plating step after transfection, which allows axons to re-grow from neurons in the absence of the targeted protein. Finally, we provide an example of using this in vitro model to study the role of an axon regeneration-associated gene, c-Jun, in mediating axon growth from adult DRG neurons9.

An in vitro model for genetic study of axon regeneration using cultured adult mouse dorsal root ganglion neurons is described. The method includes a re-suspension/re-plating step to allow axon re-growth from neurons undergoing genetic manipulation. This approach is especially useful for loss-of-function studies of axon regeneration using RNAi-based protein knockdown.

교양 성인 지느러미 루트 신경절의 신경 세포와 축삭 재생의 유전 연구

It is well known that mature neurons in the central nervous system (CNS) cannot regenerate their axons after injuries due to diminished intrinsic ability ...

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

설치류 Neuroblasts의 Nucleofection는 Neuroblast 마이그레이션을 연구하는<em&gt; 체외</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

제노푸스 laevis 배아에서 눈부안으로 DNA의 미세 주입 및 GFP의 이미징 그대로 광학 축색 아버를 표현, 살아있는 제노푸스 올챙이

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

발생학

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

영구와 광범위한 신경 세포의 형질 도입에 대한 신생아 마우스 뇌의 뇌실 바이러스 감염

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Microinjection하여 포유 동물 세포에서 mRNA 원자력 수출 속도론 분석

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

생물학

Manipulation of Single Neural Stem Cells and Neurons in Brain Slices using Robotic Microinjection

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, manipulate, and follow single cells in the brain tissue with high resolution over time. This task is extremely challenging due to the complexity of tissues in the brain. We have recently developed a robot, that guide a microinjection needle into brain tissue upon utilizing images acquired from a microscope to deliver femtoliter volumes of solution into single cells. The robotic operation increases resulting an overall yield that is an order of magnitude greater than manual microinjection and allows for precise labeling and flexible manipulation of single cells in living tissue. With this, one can microinject hundreds of cells within a single organotypic slice. This article demonstrates the use of the microinjection robot for automated microinjection of neural progenitor cells and neurons in the brain tissue slices. More broadly, it can be used on any epithelial tissue featuring a surface that can be reached by the pipette. Once set up, the microinjection robot can execute 15 or more microinjections per minute. The microinjection robot because of its throughput and versality will make microinjection a broadly straightforward high-performance cell manipulation technique to be used in bioengineering, biotechnology, and biophysics for performing single-cell analyses in organotypic brain slices.

This protocol demonstrates the use of a robotic platform for microinjection into single neural stem cells and neurons in brain slices. This technique is versatile and offers a method of tracking cells in tissue with high spatial resolution.

로봇 미세 주입을 사용하여 뇌 조각의 단일 신경 줄기 세포 및 뉴런 조작

A central question in developmental neurobiology is how neural stem and progenitor cells form the brain. To answer this question, one needs to label, ...

생체공학

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the dorsal root ganglion (DRGs) extends a single axon with two branches. One branch goes to the peripheral nerve (peripheral branch), and the other branch enters the spinal cord through the dorsal root (central branch). After the neural injury, the peripheral branch regenerates robustly whereas the central branch does not regenerate. Due to the high regenerative capacity, sensory axon regeneration has been widely used as a model system to study mammalian axon regeneration in both the peripheral nervous system (PNS) and the central nervous system (CNS). Here, we describe a previously established approach protocol to manipulate gene expression in mature sensory neurons in vivo via electroporation. Based on transfection with plasmids or small RNA oligos (siRNAs or microRNAs), the approach allows for both loss- and gain-of-function experiments to study the roles of genes-of-interests or microRNAs in regulation of axon regeneration in vivo. In addition, the manipulation of gene expression in vivo can be controlled both spatially and temporally within a relatively short time course. This model system provides a unique tool to investigate the molecular mechanisms by which mammalian axon regeneration is regulated in vivo.

Investigating Mammalian Axon Regeneration: In Vivo Electroporation of Adult Mouse Dorsal Root Ganglion

Electroporation is an effective approach to deliver genes of interests into cells. By applying this approach in vivo on the neurons of adult mouse dorsal root ganglion (DRG), we describe a model to study axon regeneration in vivo.

성인 마우스 지 루트 신경 절의 Electroporation Vivo에서 조사 포유류 축 삭 재생:

Electroporation is an essential non-viral gene transfection approach to introduce DNA plasmids or small RNA molecules into cells. A sensory neuron in the ...

In Vivo Direct Reprogramming of Resident Glial Cells into Interneurons by Intracerebral Injection of Viral Vectors

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative cell replacement therapies while also creating tools to study cell fate in situ. To date, it has been possible to obtain neurons via in vivo reprogramming, but the precise phenotype of these neurons or how they mature has not been analyzed in detail. In this protocol, we describe a more efficient conversion and cell-specific identification of the in vivo reprogrammed neurons, using an AAV-based viral vector system. We also provide a protocol for functional assessment of the reprogrammed cells&#8217; neuronal maturation. By injecting flip-excision (FLEX) vectors, containing the reprogramming and synapsin-driven reporter genes&#160;to specific cell types in the brain that serve as the target for cell reprogramming. This technique allows for the easy identification of newly reprogrammed neurons. Results show that the obtained reprogrammed neurons functionally mature over time, receive synaptic contacts and show electrophysiological properties of different types of interneurons. Using the transcription factors Ascl1, Lmx1a and Nurr1, the majority of the reprogrammed cells have properties of fast-spiking, parvalbumin-containing interneurons.

This protocol aims at generating directly reprogrammed interneurons in vivo, using an AAV-based viral system in the brain and a FLEX synapsin-driven GFP reporter, which allows for cell identification and further analysis in vivo.

바이러스 벡터의 intracerebral 주입에 의해 인터뉴런으로 상주 신경교 세포의 생체 내 직접 재프로그래밍

Converting resident glia in the brain into functional and subtype-specific neurons in vivo provides a step forward towards the development of alternative ...

Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is a complicated task, which is particularly difficult in regards to the development of &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic cortical interneurons (CIs). CIs are the main inhibitory neurons in the cerebral cortex, and they play key roles in neuronal networks, by regulating both the activity of individual pyramidal neurons, as well as the oscillatory behavior of neuronal ensembles. They are generated in transient embryonic structures (medial and caudal ganglionic eminences -&#160;MGE and CGE) that are very difficult to efficiently target using in utero electroporation approaches. Interneuron progenitors migrate long distances during normal embryonic development, before they integrate in the cortical circuit. This remarkable ability to disperse and integrate into a developing network can be hijacked by transplanting embryonic interneuron precursors into early post-natal host cortices. Here, we present a protocol that allows genetic modification of embryonic interneuron progenitors using focal ex vivo electroporation. These engineered interneuron precursors are then transplanted into early post-natal host cortices, where they will mature into easily identifiable CIs. This protocol allows the use of multiple genetically encoded tools, or the ability to regulate the expression of specific genes in interneuron progenitors, in order to investigate the impact of either genetic or environmental variables on the maturation and integration of CIs.

Here we present a protocol, designed to use chemogenetic tools to manipulate the activity of cortical interneuron progenitors transplanted into the cortex of early postnatal mice.

화학유전학적으로 조작된 피질 인터뉴런 선조를 출생 후 마우스 뇌로 이식

Neuronal development is regulated by a complex combination of environmental and genetic factors. Assessing the relative contribution of each component is ...