Nossa pesquisa de laboratório é apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH, Instituto Nacional de Abuso do Álcool e Alcoolismo.

<html> I. Preparação para a injecção Esta seção descreve as etapas de preparação que precisam ser tomadas antes da injeção de cDNA para o núcleo dos neurônios. O procedimento de isolamento para os neurônios está além do escopo deste artigo, mas é importante ter neurônios dissociados em células individuais e aderir bem à superfície inferior de 35 mm pratos de cultura de células (veja a discussão para dicas úteis para conseguir isso). Embora uma variedade de diferentes neurônios podem potencialmente ser usados, gânglios periféricos, como o gânglio cervical superior (GCS), ou os gânglios da raiz dorsal são os preferidos para dissecção porque são convenientemente acessível e produzir um grande número de neurônios. Vantagens adicionais do uso de neurônios SCG é que eles são uma população relativamente homogênea de células e bem caracterizados 1,2,3,4. A. Preparação de plasmídeo cDNA para injecção <ol><li> Para evitar a contaminação ou degradação do DNA, devem ser usadas luvas durante a preparação. </li><li> DNA que codifica a proteína de interesse é subclonado em um vetor de expressão adequado de mamíferos, como o PCI (Promega, Madison, WI), sob a regulação do altamente e constitutivamente ativa por citomegalovírus promotor (CMV). Se a proteína não é rotulado, um plasmídeo repórter, EGFP codificação por exemplo (pEGFP-N1, BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA), é co-injetados para confirmar a injeção de sucesso e de expressão. DNA é isolado usando uma coluna de separação de alta qualidade (por exemplo, QIAfilter Midi-prep kit, Qiagen, Chatsworth, CA) e mais purificada usando uma unidade centrífuga de filtro com um filtro de PVDF (0,1 mícron, Millipore, Bedford, MA) para remover partículas no preparação plasmídeo, que podem obstruir pipetas de injeção durante o processo de injeção. Plasmídeos são armazenadas a -20 ° C em uma concentração de aproximadamente 1 mg / mL em tampão apropriado DNA de armazenamento (por exemplo, tampão TE: 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0). </li><li> Imediatamente antes da microinjeção, cDNAs plasmídeo são diluídos e misturados à concentração final desejada em tampão TE ou 2 H O. Tipicamente, 5-10 ng / mL do gene repórter é suficiente para rotular células injetadas, ea concentração total de cDNA a ser injetado não deve exceder 200 ng / mL desde DNA é viscoso em altas concentrações e pode obstruir pipetas de injeção. Um pequeno volume de cDNA injectável (mL 5-10) é preparado por mistura gotas de solução sobre a superfície limpa de um pequeno pedaço de Parafilm (lado debaixo do suporte em papel). Misture as gotas de solução em conjunto por pipetagem cima e para baixo várias vezes com um pipetor e evitar a introdução de bolhas de ar durante a mistura. </li><li> Usando a ponta da pipeta microloader (Eppendorf, Brinkmann Instruments, Westbury, NY), transferir a solução para um tubo de cDNA hematócrito especialmente preparado (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Consulte a secção de materiais para obter instruções sobre como preparar tubos de hematócrito (Tabela de Materiais). Coloque o tubo de hematócrito contendo solução injectável cDNA em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Centrifugar o tubo por 15-30 min a 10 000 g em microcentrífuga equipado com um rotor balde de ângulo fixo ou oscilante (Eppendorf), em temperatura ambiente (20-24 ° C) a partículas de sedimento na solução de cDNA que possam bloquear a microinjeção pipeta. A solução injectável cDNA pode ser mantido em temperatura ambiente durante a sessão de injeção. </li></ol> B. Fabricação de injeção de pipetas <ol><li> Pipetas de vidro descartáveis ​​microinjeção estão comercialmente disponíveis (Femtotips por exemplo, Eppendorf), que são convenientes, mas caro (US $ 10 por pipeta de microinjeção). Pipetas de injeção podem ser fabricados em laboratório, utilizando um P-97 programáveis ​​extrator pipeta Flaming Brown (Sutter Instrument Company, Novato, CA) e filamentosas, de paredes finas tubos de vidro de borosilicato capilar (Instrumentos de Precisão Mundial, Sarasota, FL). Esta opção é mais rentável e permite o controle de forma microinjeção pipeta e tamanho. </li><li> Um programa de dois estágios é usado para puxar pontas de pipeta estreita microinjeção. Desde a abertura do pipetas de microinjeção é demasiado estreita para examinar sob um microscópio de luz, a qualidade de pipetas de injeção tem que ser avaliada diretamente pela injeção de algumas células antes de as configurações do programa são finalizadas. A seguir estão as configurações aproximado para ajustes do calor, puxe, velocidade e tempo: (pull 1) 600, 115, 15, 250; (pull 2) 640, 130, 65, 200. Essas configurações variam de acordo com diferentes lotes de vidro e pela condição do filamento de aquecimento no extrator, e deve ser ajustado conforme a necessidade. Para mais detalhes veja 5. </li><li> Puxe várias pipetas (2-5) de injeção por prato de neurônios a ser injetado, em caso de danos ou problemas durante a sessão de injeção. Pipetas de injeção armazenar em um recipiente coberto para evitar a entrada de poeira a ponta da pipeta de microinjeção. </li></ol> II. Microinjeção intranucleares tenda &quot;&gt; Esta seção detalha o processo de injeção de cDNA para o núcleo dos neurônios. microinjeção A configuração básica inclui um microscópio de contraste de fase invertido (eg Nikon DTM Diaphot, Nikon, Melville, NY) para visualizar o processo, micromanipulador (eg Eppendorf 5171) para controlar o movimento da pipeta de injeção e uma pressão de injeção (por exemplo, Eppendorf FemtoJet Express) para expulsar a solução cDNA da pipeta. Conectando a pressão injector ao micromanipulador permite a sincronização dos dois últimos processos durante as injeções. Outros opcional, mas altamente recomendado, componentes incluem um sistema de monitoramento montada de vídeo (câmera CCD, Cohu Inc., San Diego, CA, preto e branco para monitores de vídeo, a Sony Corporation, Tóquio, Japão). Este sistema não é um requisito absoluto para injectáveis; No entanto, o monitor preto e branco oferece alto contraste para melhor visualização do núcleo da célula e oferece uma experiência de visualização mais confortável durante longas sessões de injecção. Além disso, um computador portátil que executa o software para operar um controlador de mão pode ser utilizada para semi- automatizar o processo de injecção (ver discussão para detalhes). O tempo ideal para injetar neurônios SCG é de 3-6 horas pós-dissociação. Nesta fase, as células são esféricas, fortemente ligado ao fundo do prato, eo núcleo é claramente visível, sob um microscópio de contraste de fase, como uma central rodada organela com uma membrana escura, contendo uma nucléolos únicos ou múltiplos (Figura 1A). <ol><li> Coloque um prato de neurônios dissociados no centro do palco microscópio. Ajustar o foco e otimizar a ótica de contraste de fase do microscópio para os núcleos de neurônios são claramente visíveis. </li><li> Pipete 2 de solução de cDNA preparado em uma pipeta de microinjeção usando uma ponta da pipeta microloader. Evitar a elaboração de solução perto do fundo do tubo de hematócrito pois isso pode atiçar partículas que se instalaram durante a centrifugação. O filamento da microinjeção pipetas devem ajudar na elaboração solução para a ponta, mas se pequenas bolhas de ar persistirem, suavemente dê pequenos toques do lado do vidro para desalojá-los. </li><li> Inserir a pipeta de microinjeção no suporte da pressão capilar injector e depois segura o titular ao micromanipulador. O titular é fixada em um ângulo de 45 °. </li><li> Abaixe a pipeta de microinjeção no prato. Como a pipeta entra no meio de cultura, um menisco é formado que afeta a refração da luz e reduz a qualidade da imagem dos neurônios. Para aliviar este problema, a torre do anel de fase pode ser levemente deslocada até os núcleos de neurônios são claramente visíveis novamente. </li><li> Alguns sistemas de injeção de pressão têm uma função &quot;clean&quot;, que aplica uma pressão de ar máxima da ponta da pipeta de microinjeção de curta duração. Use esta função para limpar a pipeta de detritos antes do início e durante as injeções se a ponta aparece entupidos. Se o líquido dissipado não é visível na tela ao mesmo tempo utilizando esta função, substitua com uma pipeta nova injecção. </li><li> Centro de pipeta a microinjeção no monitor de visualização e alinhe a ponta ao lado de um neurônio e no mesmo plano focal como o nucléolo. Defina esta posição como o limite inferior do eixo z na micromanipulador. Esta posição é a profundidade da pipeta de microinjeção vai avançar para durante as injeções. Agora a posição da ponta de aproximadamente 30 mm acima deste ponto para que a microinjeção pipeta limpa o top dos neurônios. </li><li> O &quot;injetar&quot; modo de um micromanipulador Eppendorf 5171 pode ser definido com as seguintes configurações para realizar injeções intranuclear. A função é definida em injetar, enquanto a função é empalar parou. Um caminho de injeção diagonal (ao longo do x e eixo z) produz o mínimo de danos às células e, portanto, o modo axial deve ser usado para injeções. Uma velocidade de injeção de 300 mm / s é suficiente, e sincronizar acúmulo de pressão quando a pipeta de microinjeção atinge o conjunto de eixo z limite. </li><li> A pressão de injeção controla a quantidade de solução cDNA injetada no núcleo. No modo de injeção &quot;automático&quot;, a entrega de DNA é controlada por tempo e iniciado pelo micromanipulador conectado. A pressão de injeção (Pi) deve ser definido entre 100 a 200 hectopascais (hPa; 1 hPa ~ 0,015 psi); altas pressões de injeção não melhorar as taxas de sucesso ou qualidade de injeções e podem indicar outros problemas com o tamanho da ponta da pipeta de microinjeção de DNA ou pureza . Uma duração de injeção (TI) de 0,3 s e uma pressão de compensação (Pc), de 30 hPa, que fornece uma pressão positiva constante para evitar a entrada de oclusão partículas do meio de cultura para a ponta da pipeta, deve ser usado. </li><li> Posição do neurônio para ser injetado sob a ponta da pipeta de microinjeção usando o controle do microscópio estágio xy eixo. Alinhe a ponta da pipeta acima do centro do núcleo, concentrando-se para trás e para frente entre tele a ponta e os nucléolos. </li><li> Injetar o núcleo, pressionando o botão injetar (no micromanipulador). Para a etapa de injeção, o movimento da pipeta de microinjeção e da libertação de solução de cDNA são controlados pelo micromanipulador. É difícil confirmar sucesso injeções intranuclear por olho, mas a injeção da solução de viscosidade relativamente baixa cDNA (em comparação com o ambiente viscoso nuclear), muitas vezes aparece como uma pluma branca sob a óptica de contraste de fase e pode ser usado como um indicador da injeção para o núcleo. Às vezes, a pipeta de microinjeção não penetrar a membrana nuclear e simplesmente cutuca o núcleo. Uma tentativa segunda injeção na mesma posição pode levar a uma injeção bem-sucedida de DNA no núcleo. Inchaço da célula é normalmente indicativo de injeção citoplasmática não intencional. Além disso, o inchaço nuclear significativo não é bem tolerado pelos neurônios e geralmente resulta em morte celular logo depois, assim, a pressão de injeção e duração não deve exceder os valores sugeridos. </li><li> Continue injetando neurônios reposicionando o estágio do microscópio para alinhar o neurônio seguinte de acordo com a pipeta de microinjeção. Sistematicamente navegar através do prato para injetar cerca de 5-10 núcleos antes de devolver o prato de neurônios para a incubadora para a incubação durante a noite. Neurônios injetou com sucesso podem ser identificados no dia seguinte pela expressão do gene repórter. </li></ol> III. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/1614/1614fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: Superior gânglio cervical (SCG) neurônios. Imagem de contraste de fase da SCG neurônios três horas pós-dissociação (A). Nesta fase, o núcleo é claramente visível que auxilia o alinhamento da ponta da pipeta de microinjeção. O núcleo aparece no centro de neurônios com um único (à esquerda) ou múltiplos nucléolos (direita) escura. SCG neurônios 16 horas após a injeção de EGFP cDNA para o núcleo (B). Esquerda, SCG neurônios visto sob iluminação de contraste de fase. Direito, a imagem de epifluorescência dos neurônios mesmo mostrando injeção bem sucedido e resultando expressão EGFP em um neurônio. Branco barra de escala é de 20 mM. <img src="/files/ftp_upload/1614/1614figure2tmb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /> Figura 2: Whole-cell gravações de correntes através heterologously-expressa proteína G acoplada internamente retificar K + (GIRK) canais de SCG neurônios. GIRK correntes (I GIRK) foram evocados por uma rampa de tensão 200 ms de -140 a +40 mV a partir de um potencial de realização de -60 mV (inset de A) ativação seguintes endógenos α 2-adrenérgicos por norepinefrina (NE, 10 mM) . Traços sobrepostos são gravações a partir do mesmo neurônio e indicar, antes (preto) e após a aplicação de qualquer NE sozinho (azul) ou NE, acrescido de 10 mM Ba 2 + (vermelho). Linhas tracejadas indicam o nível zero de corrente. Para gravar eu GIRK, a solução externa contida (em mM) 130 NaCl, 5,4 KCl, 10 HEPES, 10 CaCl 2, 0,8 MgCl 2, 15 de glicose, 15, sacarose e 0,0003 TTX, pH ajustado para 7,4 com NaOH. A solução de gravação interna contida (em mM) 135 KCl, 11 EGTA, um CaCl 2, MgCl 2 2, 10 HEPES, 4 MgATP, e 0,3 Na 2 GTP, ajustada para pH 7,2 com KOH. A falta de corrente provocada pela rampa de tensão na presença do NE em neurônios uninjected SCG (A) demonstra que os neurônios SCG não expressam canais GIRK endógena. Injeção de sucesso de codificação cDNA plasmídeo funcional GIRK canal 11 dá origem a grandes correntes durante a rampa de tensão quando expostos à NE (B, esquerda). Correntes têm as características típicas das correntes através de canais GIRK: ativação por um agonista do receptor acoplado à proteína G (NE), retificação para dentro, e bloco de correntes pelo bloqueador putativa GIRK canal, Ba 2 + (B, traço vermelho à direita). Círculos abertos e cheios representam Eu GIRK na exploração e corrente de pico, respectivamente. Por favor, <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1614/1614figure2.jpg">clique aqui</a> para ver uma versão ampliada da figura 2.

<ol>
	<li>Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+action+potential+of+the+superior+cervical+ganglion.">The action potential of the superior cervical ganglion.</a> J Physiol. 85, 179-206 (1935).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+modulation+of+N-type+calcium+channels+by+G-protein+&#x03B2;&#x03B3;+subunits.">Voltage-dependent modulation of N-type calcium channels by G-protein &#x03B2;&#x03B3; subunits.</a> Nature. 380, 255-258 (1996).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Potassium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Brain Res. 485, 205-214 (1989).</li><li>Schofield, G. G., Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+and+calcium+currents+of+acutely+isolated+adult+rat+superior+cervical+ganglion+neurons.">Sodium and calcium currents of acutely isolated adult rat superior cervical ganglion neurons.</a> Pflugers Arch. 411, 481-490 (1988).</li><li>Dean, D. A., Goldman, R. D., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+4.">Chapter 4.</a> Live Cell Imaging: a Laboratory Manual. 1, 51-66 (2005).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+receptors+and+signaling+proteins+in+adult+mammalian+sympathetic+neurons+by+microinjection.">Heterologous expression of receptors and signaling proteins in adult mammalian sympathetic neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 83, 191-202 (1997).</li><li>Ikeda, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+G-protein+signaling+components+in+adult+mammalian+neurons+by+microinjection.">Expression of G-protein signaling components in adult mammalian neurons by microinjection.</a> Methods Mol Biol. 259, 167-181 (2004).</li><li>Ikeda, S. R., Jeong, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+RGS-insensitive+G&#x03B1;+subunits+to+study+endogenous+RGS+protein+action+on+G-protein+modulation+of+N-type+calcium+channels+in+sympathetic+neurons..">Use of RGS-insensitive G&#x03B1; subunits to study endogenous RGS protein action on G-protein modulation of N-type calcium channels in sympathetic neurons..</a> Methods Enzymol. 389, 170-189 (2004).</li><li>Washbourne, P., McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+for+gene+transfer+into+neurons.">Techniques for gene transfer into neurons.</a> Curr Opin Neurobiol. 12, 566-573 (2002).</li><li>Zhang, Y., Yu, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+microinjection+technology+in+cell+biology.">Single-cell microinjection technology in cell biology.</a> Bioessays. 30, 606-610 (2008).</li><li>Vivaudou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+G-protein+regulation+of+GIRK1+and+GIRK4,+the+two+subunits+of+the+KACh+channel,+using+functional+homomeric+mutants.">Probing the G-protein regulation of GIRK1 and GIRK4, the two subunits of the KACh channel, using functional homomeric mutants.</a> J Biol Chem. 272, 31553-31560 (1997).</li></ol>

Problemas comuns encontrados e sugestões: Como mencionado anteriormente, sucesso injeções nuclear dependem de células aderentes com placas de cultura de tecidos. Adiando o início das injeções de algumas horas após o procedimento de dissociação celular permite que os neurônios para aderir ao fundo de pratos. Além disso, pratos revestimento com 0,1 mg / ml de alto peso molecular de poli-L-lisina (Sigma, St. Louis, MO) auxiliares de adesão de neurônios para a superfície inferior de pratos. Bloqueio de pipetas de microinjeção, especialmente quando se tenta injetar uma alta concentração de DNA, pode ser um problema freqüente. Utilizando colunas de separação de alta qualidade para isolar e purificar DNA plasmídeo, e executar as etapas de purificação adicional mencionado (filtros de spin, girando em tubos de hematócrito) pode ajudar a remover partículas antes da injeção. Durante as injeções, a função &quot;clean&quot; da pressão de injeção pode ser usado (por 0,2 s é suficiente), mas se isso não resolver o problema, uma pipeta nova injecção deve ser usado. Se a maioria das pipetas de microinjeção ficar obstruídos durante uma sessão de injeção, considere alterar as configurações do extrator pipeta de vidro para produzir pontas de pipeta de microinjeção, com uma maior abertura. Outra questão que surge durante as injeções nuclear é a irregularidade da superfície do fundo de pratos de cultura de tecidos. Essa variabilidade afeta diretamente a precisão da focalização de pontas de pipeta de injeção para o núcleo desde a profundidade da pipeta atravessa durante as injeções é fixo. Portanto, este limite eixo z deve ser ajustada durante o curso de injeções dentro do mesmo prato. Torna-se evidente quando um ajuste é necessário: não haverá indicação de injeção nuclear (sem pluma branca no núcleo ou célula está totalmente perdida), ou a ponta da pipeta de injeção vem perto do fundo do prato (comprimindo a célula ou mesmo bater a ponta da pipeta no fundo do prato). Vidro clonagem cilindros (. OD 10 mm, Cat. 2090-01010, Bellco Glass, Vineland, NJ) pode ser usado durante o revestimento dos neurônios limitá-los em uma área menor, mais confinados; minimizando assim a distância necessária para mover a pipeta de injeção entre as injecções. Estes cilindros clonagem são removidos antes de executar microinjeções. Desvantagens da técnica: Microinjeções intranucleares são tecnicamente exigente, que requer paciência e um alto grau de destreza manual pelo operador. Proficiência com esta técnica, como com qualquer outra habilidade, vem com a prática. Assim, é aconselhável a prática de injeções nuclear do gene repórter sozinho antes de tentar experimentos reais. Para ajudar ainda mais o processo de injeção, pode ser possível consolidar os passos do micromanipulador e pressão injector em um programa de computador. Programas como o Pro Igor (WaveMetrics, Lake Oswego, OR) pode ser utilizado para armazenar as configurações microinjeção e programar controladores multifuncional (ShuttlePRO, Contour Design, Windham, NH) para semi-automatizar o processo de injecção (ver 6,7,8 para detalhes). Outra desvantagem da técnica de microinjeção intranuclear é a baixa taxa de sucesso. Aproximadamente 10-20% das tentativas de injeções nuclear levar a expressão da proteína. Embora essa eficiência pode ser suficiente para aplicações que não requerem um grande número de células que expressam, eletrofisiologia, por exemplo, por vários ensaios bioquímicos isso pode não ser suficiente. Aplicações da técnica: Apesar de suas desvantagens, intranuclear microinjeção de DNA é uma técnica extremamente útil para heterologously expressando proteínas em neurônios. Altos níveis de expressão da proteína são alcançados com microinjeções nuclear por causa do grande número de plasmídeos lançado para dentro do núcleo durante as injeções, uma altamente ativo promotor CMV regulação da transcrição de genes, e estabilidade a longo de plasmídeos no núcleo. Proteína sobre-expressão é especialmente útil em dominante negativo experimentos onde os altos níveis de proteínas heterólogas são obrigados a sobrecarregar a proteína endógena. Outra vantagem do intranuclear injeções é a capacidade de realizar uma parte consistente de construções de cDNA para o núcleo quando constrói múltiplas são injetados. Com os métodos de transfecção outro, é difícil reproducibly introduzir a mesma proporção de cada DNA em células de construir diferentes dentro do mesmo prato e entre transfections. Injeção direta de solução de cDNA para o núcleo elimina essa fonte de variabilidade e permite que a proporção de proteínas expressas a ser tituladas de forma eficaz. Métodos de transfecção tradicionais têm eficácia limitada em células pós-mitóticas por causa da baixa incorporação de DNA no núcleo 9 e toxicidade química associada Reag transfecçãoents 10. Microinjeções nuclear superar esses problemas através da introdução de material genético mecanicamente para o núcleo. Embora esta técnica é mais envolvidos, a capacidade de estudar o efeito de uma proteína em um sistema funcional biológico, com vias de sinalização endógena, mais do que compensa a natureza laboriosa desta técnica. Todos os procedimentos experimentais em animais foram realizados de acordo com os Institutos Nacionais de Saúde Diretrizes para a Animal Care e Utilização.

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		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ultrafree-MC Filter Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>UFC30VV00</td>
<td>Durapore PVDF filter; 0.1 &mu;m pore-size</td>
</tr>
<tr>
<td>TE buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Quality Biological, Inc</td>
<td>351-010-131</td>
<td>10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0</td>
</tr>
<tr>
<td>Micro-hematocrit capillary tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>22-362-574</td>
<td>Unheparinized Preparation: 
Soak in 100% ethanol overnight. Wash thoroughly with deionized water three times and dry bake glass in an oven (95&deg;C). Cut the cleaned hematocrit tubes into 3-4 cm length pieces using a diamond-tipped scriber, and seal one end closed with a flame and forceps to hold the glass. Store in a clean glass beaker and cover to prevent dust build-up. </td>
</tr>
<tr>
<td>Microcentrifuge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5417 R</td>
<td>With a fixed angle or swinging-bucket rotor</td>
</tr>
<tr>
<td>Microloader 20 &mu;l pipet tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5242 956.003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection capillary glass</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW120F-4</td>
<td>Thin-walled with filament, 1.2 mm outer-diameter, 0.9 mm inner-diameter, 100 mm length</td>
</tr>
<tr>
<td>Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instrument Co.</td>
<td>P-97</td>
<td>With platinum-iridium box filament (part # FB330B)</td>
</tr>
<tr>
<td>Nikon Diaphot TMD Inverted Microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>20x and 40x phase-contrast objective lenses, mounted on a vibration isolation table</td>
</tr>
<tr>
<td>Charge-coupled device (CCD) camera </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cohu Inc.</td>
<td>6410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Video monitor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sony Corporation</td>
<td>PVM-122</td>
<td>Black and White, 9&#x201D; screen </td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>5171</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection Unit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>FemtoJet Express</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microinjection controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Contour Design</td>
<td>S-PROV2</td>
<td>Programmable multimedia controller</td>
</tr>
<tr>
<td>Igor Pro</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WaveMetrics</td>
<td>Version 4.05A</td>
<td>Command program to control the microinjection controller written by S. Ikeda</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

intranuclear microinjection of dna into dissociated adult mammalian neurons

Principal as culturas de células neuronais são ferramentas valiosas para o estudo da função das proteínas, já que representam um sistema biologicamente mais relevantes em comparação com linhagens de células imortalizadas. No entanto, o carácter pós-mitóticas de neurônios primários impede a expressão da proteína heteróloga efetiva utilização de procedimentos comuns, tais como eletroporação ou quimicamente mediadas transfecção. Assim, outras técnicas devem ser empregadas de forma eficaz para expressar proteínas nestas células não-divisão. Neste artigo, descrevemos os passos necessários para realizar injeções intranuclear de construções de cDNA em dissociada adulto neurônios simpáticos. Esta técnica, que tem sido aplicado a diferentes tipos de neurônios, pode conseguir induzir a expressão da proteína heteróloga. O equipamento essencial para o procedimento de microinjeção inclui um microscópio invertido para visualizar as células, uma pipeta de injeção de vidro preenchidos com solução de cDNA que é conectado a um sistema de entrega de 2 N (g) de pressão, e um micromanipulador. O micromanipulador coordena o movimento injeção de pipeta de microinjeção, com um breve pulso de N 2 pressurizado para ejetar solução cDNA a partir da ponta da pipeta. Esta técnica não tem a toxicidade associada a muitos outros métodos de transfecção e permite construções de DNA múltipla para ser expressa em uma relação consistente. O baixo número de células injetadas torna o procedimento microinjeção adequado para estudos de única célula, tais como gravações eletrofisiológicas e de imagem óptico, mas pode não ser ideal para os ensaios bioquímicos que exigem um maior número de células e uma maior eficiência de transfecção. Apesar de microinjeções intranuclear exigir um investimento de equipamentos e de tempo, a capacidade de atingir altos níveis de expressão de proteínas heterólogas em um ambiente fisiologicamente relevantes torna esta técnica uma ferramenta muito útil para investigar a função da proteína.

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Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Intranuclear injeção direta de cDNA é uma técnica eficaz para transfecção células pós-mitóticas. Este método oferece altos níveis de expressão da proteína heteróloga a partir de uma ou várias construções de cDNA e permite que a função da proteína a ser estudada em um ambiente fisiologicamente relevantes com uma variedade de ensaios única célula.

Intranucleares microinjeção de DNA em Dissociated neurônios de mamíferos adultos

Primary neuronal cell cultures are valuable tools to study protein function since they represent a more biologically relevant system compared to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

16.8K visualizações.  National Institutes of Health (NIH). Intranuclear injeção direta de cDNA é uma técnica eficaz para transfecção células pós-mitóticas. Este método oferece altos níveis de expressão da proteína heteróloga a partir de uma ou várias construções de cDNA e permite que a função da proteína a ser estudada em um ambiente fisiologicamente relevantes com uma variedade de ensaios única célula.

Vídeo: Intranuclear Microinjection of DNA into Dissociated Adult Mammalian Neurons

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

Preparação de Dissociated rato Culturas Neuron Cortical

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Biologia

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant variants) in order to investigate their endogenous distribution and functional relevance. An interesting approach that has been implemented to fulfill this objective in fully differentiated cells is the in vivo transfection of plasmids by various methods into specific tissues such as liver1, skeletal muscle2,3, and even the brain4. We present here a detailed description of the steps that must be followed in order to efficiently transfect genetic material into fibers of the flexor digitorum brevis (FDB) and interosseus (IO) muscles of adult mice using an in vivo electroporation approach. The experimental parameters have been optimized so as to maximize the number of muscle fibers transfected while minimizing tissue damages that may impair the quality and quantity of the proteins expressed in individual fibers. We have verified that the implementation of the methodology described in this paper results in a high yield of soluble proteins, i.e. EGFP and ECFP3, calpain, FKBP12, &beta;2a-DHPR, etc. ; structural proteins, i.e. minidystrophin and &alpha;-actinin; and membrane proteins, i.e. &alpha;1s-DHPR, RyR1, cardiac Na/Ca2+ exchanger , NaV1.4 Na channel, SERCA1, etc., when applied to FDB, IO and other muscles of mice and rats. The efficient expression of some of these proteins has been verified with biochemical3 and functional evidence5. However, by far the most common confirmatory approach used by us are standard fluorescent microscopy and 2-photon laser scanning microscopy (TPLSM), which permit to identify not only the overall expression, but also the detailed intracellular localization, of fluorescently tagged protein constructs. The method could be equally used to transfect plasmids encoding for the expression of proteins of physiological relevance (as shown here), or for interference RNA (siRNA) aiming to suppress the expression of normally expressed proteins (not tested by us yet). It should be noted that the transfection of FDB and IO muscle fibers is particularly relevant for the investigation of mammalian muscle physiology since fibers enzymatically dissociated from these muscles are currently one of the most suitable models to investigate basic mechanisms of excitability and excitation-contraction coupling under current or voltage clamp conditions2,6-8.

DNA Transfection of Mammalian Skeletal Muscles using In Vivo Electroporation

We describe detailed procedures for the efficient transfection of plasmid DNA into the fibers of foot muscles of live mice using electroporation and the subsequent visualization of protein expression using fluorescence microscopy.

Transfecção de DNA de mamíferos usando músculos esqueléticos In Vivo Eletroporação

 A growing interest in cell biology is to express transgenically modified forms of essential proteins (e.g. fluorescently tagged constructs and/or mutant ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

Análise de DNA dupla fita-Break Repair (DSB) em células de mamíferos

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

Injeção intraperitoneal em Zebrafish Adulto

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Análise de Cinética mRNA Nuclear Exportação em células de mamíferos por microinjeção

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Analyzing the Function of Small GTPases by Microinjection of Plasmids into Polarized Epithelial Cells

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces the 'free' surfaces and the basolateral membrane is in contact with the substrate and neighboring cells. Both membrane domains are separated by tight junctions, which form a diffusion barrier. Apical-basolateral polarization can be recapitulated successfully in culture when epithelial cells such as Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells are seeded at high density on polycarbonate filters and cultured for several days 1 2. Establishment and maintenance of cell polarity is regulated by an array of small GTPases of the Ras superfamily such as RalA, Cdc42, Rab8, Rab10 and Rab13 3 4 5 6 7. Like all GTPases these proteins cycle between an inactive GDP-bound state and an active GTP-bound state. Specific mutations in the nucleotide binding regions interfere with this cycling 8. For example, Rab13T22N is permanently locked in the GDP-form and thus dubbed 'dominant negative', whereas Rab13Q67L can no longer hydrolyze GTP and is thus locked in a 'dominant active' state 7. To analyze their function in cells both dominant negative and dominant active alleles of GTPases are typically expressed at high levels to interfere with the function of the endogenous proteins 9. An elegant way to achieve high levels of overexpression in a short amount of time is to introduce the plasmids encoding the relevant proteins directly into the nuclei of polarized cells grown on filter supports using microinjection technique. This is often combined with the co-injection of reporter plasmids that encode plasma membrane receptors that are specifically sorted to the apical or basolateral domain. A cargo frequently used to analyze cargo sorting to the basolateral domain is a temperature sensitive allele of the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSVGts045) 10. This protein cannot fold properly at 39&deg;C and will thus be retained in the endoplasmic reticulum (ER) while the regulatory protein of interest is assembled in the cytosol. A shift to 31&deg;C will then allow VSVGts045 to fold properly, leave the ER and travel to the plasma membrane 11. This chase is typically performed in the presence of cycloheximide to prevent further protein synthesis leading to cleaner results. Here we describe in detail the procedure of microinjecting plasmids into polarized cells and subsequent incubations including temperature shifts that allow a comprehensive analysis of regulatory proteins involved in basolateral sorting.

This article details the procedures involved in overexpression and analysis of small GTPases in polarized epithelial cells using microinjection technique.

Analisando a função de GTPases Pequenas pela microinjeção de Plasmids em Polarized Células Epiteliais

Epithelial cells polarize their plasma membrane into biochemically and functionally distinct apical and basolateral domains where the apical domain faces ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

Transplante de células diretamente no Rim de Adulto Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

Em Eletroporação vivo de Morpholinos na Retina Zebrafish Adulto

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to screen new drug compounds, and to develop new therapies for motor neuron diseases such as spinal muscular atrophy (SMA) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Many current protocols use a combination of retinoic acid (RA) and sonic hedgehog (Shh) to differentiate mouse embryonic stem (mES) cells into motor neurons1-4. However, the differentiation efficiency of mES cells into motor neurons has only met with moderate success. We have developed a two-step differentiation protocol5 that significantly improves the differentiation efficiency compared with currently established protocols. The first step is to enhance the neuralization process by adding Noggin and fibroblast growth factors (FGFs). Noggin is a bone morphogenetic protein (BMP) antagonist and is implicated in neural induction according to the default model of neurogenesis and results in the formation of anterior neural patterning6. FGF signaling acts synergistically with Noggin in inducing neural tissue formation by promoting a posterior neural identity7-9. In this step, mES cells were primed with Noggin, bFGF, and FGF-8 for two days to promote differentiation towards neural lineages. The second step is to induce motor neuron specification. Noggin/FGFs exposed mES cells were incubated with RA and a Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), for another 5 days to facilitate motor neuron generation. To monitor the differentiation of mESs into motor neurons, we used an ES cell line derived from a transgenic mouse expressing eGFP under the control of the motor neuron specific promoter Hb91. Using this robust protocol, we achieved 51&plusmn;0.8% of differentiation efficiency (n = 3; p &lt; 0.01, Student's t-test)5. Results from immunofluorescent staining showed that GFP+ cells express the motor neuron specific markers, Islet-1 and choline acetyltransferase (ChAT). Our two-step differentiation protocol provides an efficient way to differentiate mES cells into spinal motor neurons.

We developed a new protocol to improve efficiency of in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons. The differentiated ES cells acquired motor neurons features as evidenced by expression of neuronal and motor neuron markers using immunohistochemical techniques.

Diferenciação eficiente de células-tronco embrionárias em neurônios motores

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...