אנו מודים לחברים במעבדה או &#39;האלורן להערות על כתב היד. אנו מודים לג&#39;ורג&#39; וושינגטון אוניברסיטת המחלקה למדעי ביולוגיה וקולומביאני המכללה לאמנויות ומדעים למימון לד &#39;האלורן.

1. מקומי יישור כלי חיפוש בסיסי (תפציץ): באינטרנט ממשק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על קישור זה לבקר בשרת האינטרנט תפציץ 1 במרכז הארצי למידע ביוטכנולוגיה (צמח השדה). - <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">Http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלט רצף FASTA מעוצב טקסט (ראה איור 2 לדוגמא) לתוך תיבת השאילתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על התכנית המתאימה תפציץ ומסד נתונים רלוונטיים או מינים בודדים של עניין להשתמש בחיפוש, ולאחר מכן לחץ על &quot;פיצוץ&quot;. הערה: רצף FASTA מעוצב מתחיל בשורת תיאור מצויינים על ידי סימן &quot;&gt;&quot;. התיאור חייב לעקוב מייד אחרי הסימן &quot;&gt;&quot;, הרצף (כלומר. נוקלאוטידים או חומצות אמינו) בצעו את תיאורו בשורה הבאה. הפלט מחיפוש הפיצוץ מוצג כ-HTML, טקסט רגיל, XML, או ta פגעBles (טקסט או csv) עם ברירת המחדל שנקבע ל-HTML (איור 3). </li></ol> 2. מקומי יישור כלי חיפוש בסיסי (תפציץ): הרצה מקומית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד את ההרצה של שורת הפקודה האחרונה תפציץ תפציץ מהקישור הזה: <a href="ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/">ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</a> - </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ פעמיים על קובץ win32.exe הפיצוץ האחרון ולקבל את הסכם הרישיון ולחץ על התקנה: em&gt; למשתמשי ה-PC. הערה: מדריך התקנת ברירת המחדל הוא C: + צמח השדה-פיצוץ 2.2.27. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את משתנה סביבת המחשב באופן הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על המחשב &quot;התחל&quot; כפתור, ולאחר מכן לחץ לחיצה ימנית על &quot;מחשב&quot;, </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;מאפיינים&quot; ובמוקפץ לחץ על הלשונית &quot;המתקדמת&quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;משתני הסביבה&quot; ובקופץ החדשים לחץ על לחצן &quot;החדש&quot; תחת ה&quot;משתני משתמש למשתמש&quot; סעיף ה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במוקפץ להוסיף את השם המשתנה &quot;נתיב&quot; וערך משתנה &quot;C: צמח השדה-פיצוץ 2.2.27 + bin. הערה: בספריית bin מכילה את קובץ ההפעלה (כלומר blastp, וכו &#39;.).. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> em&gt; למשתמשי מקינטוש: פתח את יישום המסוף (לעשות &quot;Finder&quot; רק פתוח זה ולחפש &quot;טרמינל&quot; וזה יציג את הסמל &quot;מסוף&quot;). לסוג חלון המסוף: &gt; Ftp <a href="ftp://ftp.ncbi.nih.gov">ftp.ncbi.nih.gov</a> הערה: ניתן גם להקליד את כתובת האתר בשימוש מעל בדוגמא למחשב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לגשת לסוג אתר FTP צמח השדה &quot;בעילום שם&quot; לשם וסיסמא, ולאחר מכן סוג: &gt; פיצוץ cd / הרצה / האחרון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשימת ההרצה על ידי הקלדה: &gt; Ls </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבל את הגרסה האחרונה על ידי הקלדת הפקודה הבאה (או מה הגרסה האחרונה הוא כרגע): 2; לקבל צמח השדה פיצוץ-2.2.7-macosx.tar.gz </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצאת מאתר צמח השדה שרת FTP על ידי הקלדה &quot;יציאה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשחרר לחץ הקבצים שהורדו על ידי הקלדה: &gt; זפת xzf צמח השדה פיצוץ-2.2.7-macosx.tar.gz </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את המיקום של הקבצים בינאריים להפעלת הפיצוץ לנתיב שלך, כך שהקליפה יכולה לחפש דרך ספרייה זו כאשר מחפשת פקודות על ידי הקלדה: &gt; PATH = $ PATH: new_folder_location </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק אם זה הוסיף את המיקום לנתיב שלך על ידי הקלדה: &gt; PATH הד $ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד מסדי נתונים מעוצבים מראש תפציץ (אשר מתעדכנים מדי יום) על ידי לחיצה כאן: <a href="ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/">ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מסד הנתונים לתיקייה &quot;DB&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> em&gt; במחשב: פתח את שורת הפקודה של MS-DOS (לעשות קליק זה &quot;התחל&quot; והקלד &quot;cmd&quot; בשורת החיפוש) ולשנות את הספרייה לתיקיית צמח השדה הפיצוץ על ידי הקלדה: C: Users&gt; cd .. [מהלכיםעד תיקייה אחת] C: cd &gt; צמח השדה-פיצוץ 2.2.27 + זה יהיה לשנות את הספרייה: C: צמח השדה-פיצוץ 2.2.27 +&gt; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליצור את מסד הנתונים בעזרת הפקודה &quot;makedb&quot; הבאה: &gt; Makedb-בdb / db prot-out briggsae.fasta-dbtype / briggsae הערה: בדוגמא הבאה (איור 4) מסד נתונים בשם &quot;briggsae&quot; ומורכב מקבוצת הצמדה אחד מן האורגניזם Caenorhabditis briggsae. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת רצף חלבון שאילתה שנקרא &quot;מבחן&quot; על ידי החדרת רצף טקסט FASTA מעוצב חלבון לתוך התיקייה &quot;DB&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחקור את מסד הנתונים באמצעות חיפוש blastp ידי הקלדת הפקודה הבאה: &gt; Db blastp השאילתה / db test.txt-db / briggsae החוצה text.txt </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> em&gt; במקינטוש: להוריד מסד הנתונים עבור חיפושי פיצוץ מקומיים על ידי גישה לאתר האינטרנט של ה-FTP צמח השדה בהתאם להוראות לעיל (שלב 2.4) וסוג n: &gt; LCD .. / מסדי נתונים / </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד את הגנום או רצף של עניין על ידי הקלדה: &gt; לקבל NC_ [# הצטרפות]. FNA הערה: &quot;. FNA&quot; מתייחס לרצף נוקליאוטידים FASTA המעוצב ו&quot; ה-FAA. &quot;מתייחסת לרצפי חומצות אמינו FASTA מעוצבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סוג &quot;לפרוש&quot; כדי לצאת מאתר FTP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך את מסד הנתונים על ידי הקלדה: &gt; Makeblastdb-ב/ db prot עכבר dbtype mouse.faa-out </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס רצף שאילתה מעוצב FAST לתוך התיקייה &quot;הסל&quot; ולחקור את מסד הנתונים עם את הפקודה הבאה: results.txt blastp השאילתה &quot;query.fasta&quot;-db &quot;מסד הנתונים שלך&quot; החוצה&gt; </li></ol> 3. יצירת יישור רצף מרובה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הקישורים הבאים כדי לגשת למערך תוכניות נפוצות מרובות רצף (MSA): ClustalW 6 <a href="http://www.clustal.org/">http://www.clustal.org/</a> קאליGN 7 <a href="http://msa.sbc.su.se/cgi-bin/msa.cgi">http://msa.sbc.su.se/cgi-bin/msa.cgi</a> MAFFT 8,9 <a href="http://mafft.cbrc.jp/alignment/software/">http://mafft.cbrc.jp/alignment/software/</a> שרירים 10 <a href="http://www.drive5.com/muscle/">http://www.drive5.com/muscle/</a> 11 T-קפה <a href="http://www.tcoffee.org/Projects/tcoffee/">http://www.tcoffee.org/Projects/tcoffee/</a> 12 PROBCONS <a href="http://toolkit.tuebingen.mpg.de/probcons">http://toolkit.tuebingen.mpg.de/probcons</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על קישור זה - <a href="http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:regular">http://tcoffee.crg.cat/apps/tcoffee/do:regular</a> - ונתוני רצף מעוצבים FASTA הקלט לתוך תיבת השאילתה הערה: פלט לדוגמא מ-T-קפה שניתן לראות בתרשים 5, שאריות דומות מקודד לפי צבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד את ה-MSA Clustal כגרסת שורת הפקודה (ClustalW) או v גרפיersion (ClustalX) על ידי לחיצה על קישור זה: <a href="http://www.clustal.org/clustal2/">http://www.clustal.org/clustal2/</a> - ואז ללחוץ על ההפעלה המתאימה (כלומר נצחון, לינוקס, Mac OS X). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעלות את הנתונים כטקסט רצף FASTA מעוצב וליישר (איור 6). </li></ol> 4. קביעת מודלים הטוב ביותר בכושר של אבולוציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ כאן כדי להוריד את תכנית ProtTest 13: <a href="http://darwin.uvigo.es/our-software/">http://darwin.uvigo.es/our-software/</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שProtTest מורד, לחץ פעמיים על קובץ ProtTest.jar </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שProtTest הוא הושק, לחץ על &quot;בחר קובץ&quot; ולטעון את נתוני הרצף (איור 7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן לחץ על &quot;התחל&quot; והתכנית תתחיל (איור 8). הערה: לאחר השלמת הריצה (איור 8), התכנית תציין את המודל הטוב ביותר על פי קריטריונים כגון:<html> &quot;המודל הטוב ביותר על פי המרכז לאינפורמציה אלטרנטיבית: לכשכש + I G +&quot; </li></ol> 5. הסיק phylogenies רצף בהתבסס על ידי נראה מקסימלית או הסקה בייס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורדתי 4 PhyML כאן: <a href="https://code.google.com/p/phyml/">https://code.google.com/p/phyml/</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את קובץ ההפעלה על ידי לחיצה כפולה על היישום המתאים (כלומר phyml Windows, phyml לינוקס, וכו &#39;.) ואת חלון ממשק יצוץ (איור 9). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את רצף הקלט כרצף PHYLIP מעוצב על ידי הקלדה: &gt; &quot;שם קובץ&quot;. PHY הערה: כדי להמיר בין פורמטי רצף, השתמש בתכנית &quot;Readseq&quot; האינטרנט זמינה ב - <a href="http://iubio.bio.indiana.edu/cgi-bin/readseq.cgi">http://iubio.bio.indiana.edu/cgi-bin/readseq.cgi.</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התכנית על ידי הקלדה &quot;Y&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד MrBayes 5 כאן: rceforge.net / download.php &quot;&gt; http://mrbayes.sourceforge.net/download.php </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפעיל את התכנית בלחיצה על קובץ ההפעלה ולקרוא את נתוני רצף NEXUS מעוצבים לתכנית על ידי הקלדה: &gt; הוצאת להורג &quot;שם קובץ&quot;. NEX </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המודל האבולוציוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מספר הדורות המנוהל על ידי הקלדה: &gt; Mcmcp NGEN = 1000000 [זה מגדיר את מספר הדורות ל1000000] &gt; עוקה Burnin = 10,000 [זה מגדיר את Burnin ל10000] </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את אורכי הסניף בקובץ התוצאות על ידי הקלדה: &gt; Mcmcp savebrlens = כן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הניתוח על ידי הקלדה: &gt; המרק&quot;ם </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סכם את העצים באמצעות הפקודה &quot;sumt&quot;. </li></ol> 6. חזותי phylogenies <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג רשימה של תוכניות הצופה עץ כאן: <a href="http://www.treedyn.org/overview/editors.html">http://www.treedyn.org/overview/editors.html</a> </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הורד את progr 14 TreeViewהנני כאן: <a href="http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html">http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html</a> </li></ol>

<ol>
	<li>Altschul, S. F., Carroll, R. J., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Weights+for+data+related+by+a+tree.">Weights for data related by a tree.</a> J. Mol. Biol. 207 (4), 647-653 (1989).</li><li>Akaike, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+look+at+the+statistical+model+identification.">A new look at the statistical model identification.</a> IEEE Trans. Automat. Contr. 19 (6), 706-723 (1974).</li><li>Schwarz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+dimension+of+a+model.">Estimating the dimension of a model.</a> Ann. Stat. 6 (2), 461-464 (1978).</li><li>Guindon, S., Gascuel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+fast,+and+accurate+algorithm+to+estimate+large+phylogenies+by+maximum+likelihood.">A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood.</a> Syst. Biol. 52 (5), 696-704 (2003).</li><li>Huelsenbeck, J. P., Ronquist, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRBAYES:+Bayesian+inference+of+phylogenetic+trees.">MRBAYES: Bayesian inference of phylogenetic trees.</a> Bioinformatics. 17 (8), 754-755 (2001).</li><li>Thompson, J. D., Higgins, D. G., Gibson, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLUSTAL+W:+Improving+the+sensitivity+of+progressive+multiple+sequence+alignment+through+sequence+weighting,+position-specific+gap+penalties+and+weight+matrix+choice.">CLUSTAL W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice.</a> Nucleic Acids Res. 22 (22), 4673-4680 (1994).</li><li>Lassmann, T., Sonnhammer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kalign--an+accurate+and+fast+multiple+sequence+alignment+algorithm.">Kalign--an accurate and fast multiple sequence alignment algorithm.</a> BMC Bioinformatics. 6, 298 (2005).</li><li>Katoh, K., Kuma, K., Toh, H., Miyata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAFFT+version+5:+Improvement+in+accuracy+of+multiple+sequence+alignment.">MAFFT version 5: Improvement in accuracy of multiple sequence alignment.</a> Nucleic Acids Res. 33 (2), 511-518 (2005).</li><li>Katoh, K., Misawa, K., Kuma, K., Miyata, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAFFT:+A+novel+method+for+rapid+multiple+sequence+alignment+based+on+fast+fourier+transform.">MAFFT: A novel method for rapid multiple sequence alignment based on fast fourier transform.</a> Nucleic Acids Res. 30 (14), 3059-3066 (2002).</li><li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUSCLE:+Multiple+sequence+alignment+with+high+accuracy+and+high+throughput.">MUSCLE: Multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput.</a> Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).</li><li>Notredame, C., Higgins, D. G., Heringa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-coffee:+A+novel+method+for+fast+and+accurate+multiple+sequence+alignment.">T-coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment.</a> J. Mol. Biol. 302 (1), 205-217 (2000).</li><li>Do, C. B., Mahabhashyam, M. S., Brudno, M., Batzoglou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProbCons:+Probabilistic+consistency-based+multiple+sequence+alignment.">ProbCons: Probabilistic consistency-based multiple sequence alignment.</a> Genome Res. 15 (2), 330-340 (2005).</li><li>Darriba, D., Taboada, G. L., Doallo, R., Posada, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProtTest+3:+Fast+selection+of+best-fit+models+of+protein+evolution.">ProtTest 3: Fast selection of best-fit models of protein evolution.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1164-1165 (2011).</li><li>Page, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TreeView:+An+application+to+display+phylogenetic+trees+on+personal+computers.">TreeView: An application to display phylogenetic trees on personal computers.</a> Comput. Appl. Biosci. 12 (4), 357-358 (1996).</li><li>Darriba, D., Taboada, G. L., Doallo, R., Posada, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=jModelTest+2:+More+models,+new+heuristics+and+parallel+computing.">jModelTest 2: More models, new heuristics and parallel computing.</a> Nat. Methods. 9 (8), 772 (2012).</li><li>Chevenet, F., Brun, C., Banuls, A. L., Jacq, B., Christen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TreeDyn:+Towards+dynamic+graphics+and+annotations+for+analyses+of+trees.">TreeDyn: Towards dynamic graphics and annotations for analyses of trees.</a> BMC Bioinformatics. 7, 439 (2006).</li></ol>

יש לנו מה למסור.

התקווה שלנו למאמר זה היא שזה ישמש כנקודת התחלה כדי להנחות את החוקרים או סטודנטים כי הם חדשים phylogenetics. פרויקטים לקביעת רצף הגנום הפכו פחות יקרות בשנים האחרונות, וכתוצאה מכך הביקוש למשתמש עבור טכנולוגיה זו הולך וגדל, ועכשיו הייצור של מערכי נתונים רצף גדולים הוא דבר שבשגרה במעבדות קטנות. מערכי נתונים אלה לעתים קרובות לספק לחוקרים עם קבוצות של גנים שדורשים מסגרת פילוגנטי כדי להתחיל להבין את תפקידם. יתר על כן, בגלל phylogenetics הוא למצוא בית במספר גדל והולך של מעבדות מחקר, אנחנו גם מתכוונים למאמר זה כדי לשמש כמכשיר חינוכי לתלמידים המעוניינים בהרחבה במחקר ביולוגי. על ידי מתן מידע למשתמש על &quot;למה&quot;, &quot;איך&quot;, ו &quot;שבו&quot; לכלים עץ בנייה נפוצות, אנו מספקים מסגרת לקורא להתחיל להכיר את עצמם עם יישומים אלה וכיצד הם פועלים. However, אנו ממליצים לקורא לשחק עם כל ההגדרות בתוך כל אחד מכלים, בניסיון להבין כיצד הפרמטרים השונים יכולים להשפיע על נתוני הרצף שלהם, ועל מנת להבטיח תאימות בין פלטפורמה ותוכנה בכל מקרה ומקרה. הניתוח שתואר לעיל היה מתקבל באמצעות Dell Optiplex 990 עם מעבד Core i7 של אינטל ומחשב נייד MacBook עם מעבד Intel Core 2 Duo, עם זאת, את המהירות של ניתוח וגם הקבצים בינאריים הספציפיים (למשל. 32 ביט או 64 ביט) יהיו תלויים על הפלטפורמה של המשתמש. אתגר כאשר הרכיב מדריך למשתמש כמו זה לphylogenetics, הוא שתחום phylogenetics וביואינפורמטיקה בכללותו, הוא אזור המתרחב במהירות של מחקר שמשחרר תוכנה חדשה כל הזמן שמטרתה לספק מערכים טובים יותר, תחזיות דמיון, או עצי פילוגנטי . כדי למתן בעיה זו, ניסינו להתמקד בתוכניות שהסביבה כבר מספר שנים ועדיין פופולריים על חשבון of כמה טוב הם עובדים. עם זאת, אנו רוצים לציין כי ישנם כלים רבים אחרים זמינים כדי להתמודד עם הבעיות שתוארנו במאמר זה, וכך לעודד את הקורא לנצל זאת ולשלב מספר רב של יישומים לניתוח שלהם.

על מנת להבין כיצד שני (או יותר) מינים התפתחו, יש צורך קודם כל להשיג רצף או נתונים מורפולוגיים מכל מדגם, נתונים אלה מייצגים כמויות שאנחנו יכולים להשתמש בו כדי למדוד את מערכת היחסים שלהם בחלל אבולוציוני. בדיוק כמו כאשר מדידת מרחק לינארי, שיש יותר נתונים זמינים (למשל קילומטרים, סנטימטרים, מיקרון) יהיו שווים ל מדידה מדויקת יותר. Ergo, הדיוק שבה חוקר יכול להסיק מרחק האבולוציוני מושפע מאוד את נפח הנתונים אינפורמטיבי זמינים למדוד מערכות יחסים. יתר על כן, מכיוון שמדגמים שונים להתפתח בקצב שונה ועל ידי מנגנונים שונים, השיטה שאנו משתמשים כדי למדוד את היחסים בין שני מינים גם משפיעה ישירות על הדיוק של מדידות אבולוציוני. לכן, בגלל יחסים האבולוציוניים אינם ישירות שנצפו אך במקום זאת הם להסיק מרצף או נתונים מורפולוגיים, הבעיה של הסקה אבולוציוניתמערכות יחסים הופכים לאחד מהנתונים סטטיסטיים. Phylogenetics הוא הענף של ביולוגיה העוסקת ביישום מודלים סטטיסטיים לדפוסים של אבולוציה כדי לשחזר את ההיסטוריה האבולוציונית בין מינים בצורה אופטימלית. שחזור זה בין המינים המכונה תולדות הגזע של קטגוריות המיון. כדי לסייע לגשר על הפער במומחיות בין ביולוגים מולקולריים וביולוגים אבולוציוניים שאנו מתארים כאן צעד אחר צעד צינור כדי להסיק מסקנה, phylogenies מסט של רצפים. ראשית, אנחנו פירוט השלבים הכרוכים בחקירת מסד נתונים באמצעות מקומי יישור כלי חיפוש הבסיסי (תפציץ 1) אלגוריתם באמצעות הממשק מבוסס האינטרנט וגם באמצעות הרצה מקומית, זה הוא לעתים קרובות הצעד הראשון בהשגת רשימה של רצפים דומים למזוהה שאילתה, למרות שחלקם חוקרים עשויים להתעניין גם באיסוף נתונים עבור קבוצה אחת באמצעות ממשקי אינטרנט כגון Phylota (http://www.phylota.net/). פיצוץ הוא אלגוריתם לגomparing חומצת אמינו עיקרי או נתונים רצף נוקליאוטידים מול מסד נתונים של רצפים כדי לחפש את &quot;להיטים&quot; המזכירים את רצף השאילתה. התכנית תפציץ תוכננה על ידי סטיבן אלטשול et al. במכון הלאומי לבריאות (NIH) 1. השרת תפציץ מורכב ממספר התוכניות שונות, והנה רשימה של חלק מתוכניות תפציץ הנפוצות ביותר: i) תפציץ נוקלאוטיד נוקלאוטיד (blastn): תכנית זו דורשת קלט רצף ה-DNA ומחזירה את רצפי ה-DNA הדומה ביותר ממאגר ה-DNA שמציין המשתמש (לדוגמה לאורגניזם ספציפי). ii) פיצוץ חלבונים (blastp): כאן משתמש תשומות רצף חלבון והתכנית מחזירה את רצפי חלבונים דומים ביותר ממאגר החלבון שהמשתמש מציין. iii) תפציץ תפקיד ספציפי איטרטיבי (PSI-BLAST) (blastpgp): הקלט מהמשתמש הוא הגנה של מחזורברצף שמחזיר קבוצה של חלבונים הקשורים באופן הדוק, וממערך נתונים זה נשמר בפרופיל שנוצר. הבא שאילתה חדשה שנוצרה רק באמצעות אלה &quot;מוטיבים&quot; נשמרים בו נעשה שימוש כדי לחקור את מסד הנתונים של חלבון וזה מחזיר את קבוצה גדולה יותר של חלבונים שממנה הסט חדש של &quot;מוטיבים&quot; שימור מחולץ ולאחר מכן נעשה שימוש כדי לחקור את מסד הנתונים של חלבון עד קבוצה גדולה עוד יותר של חלבונים retuned ופרופיל אחר מופק והתהליך חוזר ונשנה. על ידי כולל חלבונים הקשורים לשאילתא בכל שלב בתכנית זו מאפשרת למשתמש לזהות רצפים שהם מסתעף יותר. iv) נוקלאוטיד תרגום חלבון 6-מסגרת (blastx): כאן המשתמש מספק קלט רצף נוקליאוטידים אשר מומר מוצרי שש מסגרת מושגית תרגום (כלומר שני גדילים) מול מסד נתוני רצף חלבון.. v) נוקלאוטיד תרגום נוקלאוטיד 6 מסגרתתרגום 6 מסגרת (tblastx): תכנית זו לוקחת קלט רצף נוקליאוטידים DNA ומתרגמת את הקלט לכל מוצרי התרגום הרעיוניים של שש המסגרת שבה משווה מול תרגומי שש מסגרת של מסד הנתונים רצף נוקליאוטידים. vi) תרגום חלבון נוקלאוטיד 6 מסגרת (tblastn): תכנית זו משתמשת קלט רצף חלבון להשוואה מול כל שש מסגרות הקריאה של מסד הנתונים רצף נוקליאוטידים. בשלב בא, אנו מתארים תוכניות נפוצות ליצירת רצף יישור מרובה (MSA) מבסיס נתוני רצף, וזה מלווה במדריך למשתמש לתוכניות שקובעות את הדגמים הטובים ביותר בכושר של אבולוציה לבסיס נתוני רצף. שחזור פילוגנטי הוא בעיה סטטיסטית, ובגלל זה, שיטות פילוגנטי צריכים לשלב מסגרת סטטיסטית. מסגרת סטטיסטית זה הופכת להיות מודל האבולוציוני שמשלב שינוי רצף בתוך בסיס הנתונים. מו האבולוציוני הזהדל מורכב מסט של הנחות לגבי התהליך של החלפות נוקלאוטיד או חומצה אמינית, והמודל הכי המתאים למערך נתונים מסוימים ניתן לבחור באמצעות בדיקה סטטיסטית. נכון לנתונים של דגמים שונים ניתן להשוות באמצעות בדיקות יחס סבירות (LRTs) או קריטריוני מידע כדי לבחור את המודל הטוב ביותר להתאמה בתוך קבוצה של אפשריים אלה. שני קריטריוני מידע משותפים הם קריטריון Akaike המידע (AIC) 2 והקריטריון בייס המידע (BIC) 3. ברגע יישור אופטימלי שנוצר, יש שיטות רבות ושונות ליצירת תולדות הגזע מהנתונים המיושרים. ישנן שיטות רבות של הסקת יחסים האבולוציוניים; רחב, הם יכולים להיות מחולקים לשתי קטגוריות: שיטות המבוסס על מרחק ושיטות המבוסס על רצף. שיטות המבוסס על מרחק לחשב מרחקי pairwise מרצפים, ולאחר מכן להשתמש במרחקים אלה כדי להשיג את העץ. שיטות המבוסס על רצף להשתמש ביישור הרצף באופן ישיר, ובדרך כלל לחפש tחלל רי באמצעות קריטריון אופטימלי. אנו מתארים שתי שיטות המבוסס על רצף לשיקום יחסים פילוגנטי: אלה הם 4 PhyML אשר מיישמת את מסגרת הסבירות המרבית, וMrBayes 5 אשר עושה שימוש בהיקש בייס שרשרת מרקוב מונטה קרלו. סבירות ושיטות בייס לספק מסגרת סטטיסטית לשחזור פילוגנטי. על ידי מתן מידע משתמש בכלים עץ בנייה נפוץ, אנחנו מציגים בפני הקורא את הנתונים הדרושים כדי להסיק יחסי פילוגנטי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="713">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BLAST webpage&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BLAST executables&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/">ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Preformatted BLAST databases</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/">ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clustal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.clustal.org/">http://www.clustal.org/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kalign</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://msa.sbc.su.se/cgi-bin/msa.cgi">http://msa.sbc.su.se/cgi-bin/msa.cgi</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MAFFT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://mafft.cbrc.jp/alignment/software/">http://mafft.cbrc.jp/alignment/software/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MUSCLE</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.drive5.com/muscle/">http://www.drive5.com/muscle/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-Coffee</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.tcoffee.org/Projects/tcoffee/">http://www.tcoffee.org/Projects/tcoffee/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PROBCONS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://toolkit.tuebingen.mpg.de/probcons">http://toolkit.tuebingen.mpg.de/probcons&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Se-Al&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://tree.bio.ed.ac.uk/software/seal/">http://tree.bio.ed.ac.uk/software/seal/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSEdit&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.bsedit.org/">http://www.bsedit.org/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JalView</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.jalview.org/">http://www.jalview.org/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SeaView</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://pbil.univ-lyon1.fr/software/seaview.html">http://pbil.univ-lyon1.fr/software/seaview.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProtTest&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:447px;"><a href="https://code.google.com/p/prottest3/">https://code.google.com/p/prottest3/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Java Runtime&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.java.com/en/download/chrome.jsp">http://www.java.com/en/download/chrome.jsp</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Readseq</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://iubio.bio.indiana.edu/cgi-bin/readseq.cgi">http://iubio.bio.indiana.edu/cgi-bin/readseq.cgi</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">jModelTest</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:447px;"><a href="https://code.google.com/p/jmodeltest2/">https://code.google.com/p/jmodeltest2/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PhyML</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="https://code.google.com/p/phyml/">https://code.google.com/p/phyml/</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MrBayes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://mrbayes.sourceforge.net/download.php">http://mrbayes.sourceforge.net/download.php</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TreeView</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a href="http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html">http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/treeview.html</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TreeDyn</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:447px;"><a href="http://www.treedyn.org/">http://www.treedyn.org/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a practical guide to phylogenetics for nonexperts

חוקרים רבים, על פני מוקדים מגוונים להפליא, מתראיין phylogenetics לשאלת המחקר שלהם (S). עם זאת, חוקרים רבים חדשים לנושא זה וכך הוא מציג בעיות הטמונות. כאן אנו לקמפל הקדמה מעשית לphylogenetics לnonexperts. אנו מתארים באופן צעד אחר צעד, צינור להפקת phylogenies אמין ממערכי נתוני רצף גן. אנחנו מתחילים עם מדריך למשתמש עבור כלי חיפוש דמיון באמצעות ממשקי האינטרנט, כמו גם הרצה מקומית. בשלב בא, אנו לחקור תוכניות ליצירת מערכי רצף מרובים ואחרי פרוטוקולים לשימוש בתוכנה כדי לקבוע דגמים מיטבית של אבולוציה. לאחר מכן, אנו מתארים פרוטוקולים לשיקום יחסים פילוגנטי באמצעות סבירות המרבית וקריטריונים בייס ולבסוף מתארים את הכלים המאפשרים הדמית עצי פילוגנטי. אמנם זה לא בכל אמצעי תיאור ממצה של גישות פילוגנטי, הוא מספק את הקורא עם informat מתחיל מעשייון ביישומי תוכנת מפתח מנוצלים בדרך כלל על ידי phylogeneticists. החזון למאמר זה יהיה כי זה יכול לשמש ככלי הכשרה מעשי לחוקרים שיצאו ללימודי פילוגנטי וגם לשמש כמשאב חינוכי שיכול להיות משולב בתוך כיתה או במעבדת הוראה.

Watch this Scientific Journal Video about A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts at JoVE.com

A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

כאן אנו מתארים צינור צעד אחר צעד ליצירת phylogenies אמין ממערכי נתוני רצף נוקליאוטידים או חומצות אמינו. מדריך זה נועד לשרת את חוקרים או סטודנטים חדשים לניתוח פילוגנטי.

מדריך מעשי לphylogenetics לNonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this ...

a-practical-guide-to-phylogenetics-for-nonexperts

Google

Research

JoVE Journal

Biology

35.2K Views.  The George Washington University.  כאן אנו מתארים צינור צעד אחר צעד ליצירת phylogenies אמין ממערכי נתוני רצף נוקליאוטידים או חומצות אמינו. מדריך זה נועד לשרת את חוקרים או סטודנטים חדשים לניתוח פילוגנטי. 

Video: A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

The Ladder Rung Walking Task: A Scoring System and its Practical Application.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to elaborate distinct aspects of motor function and to determine even subtle loss of movement capacity. To enhance efficacy and resolution of testing, tests should permit qualitative and quantitative measures of motor function and be sensitive to changes in performance during recovery periods. The present study describes a new task to assess skilled walking in the rat to measure both forelimb and hindlimb function at the same time. Animals are required to walk along a horizontal ladder on which the spacing of the rungs is variable and is periodically changed. Changes in rung spacing prevent animals from learning the absolute and relative location of the rungs and so minimize the ability of the animals to compensate for impairments through learning. In addition, changing the spacing between the rungs allows the test to be used repeatedly in long-term studies. Methods are described for both quantitative and qualitative description of both fore- and hindlimb performance, including limb placing, stepping, co-ordination. Furthermore, use of compensatory strategies is indicated by missteps or compensatory steps in response to another limb&#x2019;s misplacement. 

The ladder rung walking task is a new test to assess skilled walking and measure both forelimb and hindlimb placing, stepping, and inter-limb co-ordination.

שלב בסולם הליכה משימה: שיטת הניקוד ואת היישום המעשי שלה.

Progress in the development of animal models for/stroke, spinal cord injury, and other neurodegenerative disease requires tests of high sensitivity to ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

גישה מעשית מיפוי גנטי ועין מתנהלת הגורל: מדריך חזותי כדי מארק עקוב אחר תאים In vivo</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

A Practical and Novel Method to Extract Genomic DNA from Blood Collection Kits for Plasma Protein Preservation

Laboratory tests can be done on the cellular or fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes determines the portion of the blood that can be analyzed (whole blood, plasma or serum). Laboratories involved in studying the genetic basis of human disorders rely on anticoagulated whole blood collected in EDTA-containing vacutainer as the source of DNA for genetic / genomic analysis. Because most clinical laboratories perform biochemical, serologic and viral testing as a first step in phenotypic outcome investigation, anticoagulated blood is also collected in heparin-containing tube (plasma tube). Therefore when DNA and plasma are needed for simultaneous and parallel analyses of both genomic and proteomic data, it is customary to collect blood in both EDTA and heparin tubes. If blood could be collected in a single tube and serve as a source for both plasma and DNA, that method would be considered an advancement to existing methods. The use of the compacted blood after plasma extraction represents an alternative source for genomic DNA, thus minimizing the amount of blood samples processed and reducing the number of samples required from each patient. This would ultimately save time and resources.
The BD P100 blood collection system for plasma protein preservation were created as an improved method over previous plasma or serum collection tubes1, to stabilize the protein content of blood, enabling better protein biomarker discovery and proteomics experimentation from human blood. The BD P100 tubes contain 15.8 ml of spray-dried K2EDTA and a lyophilized proprietary broad spectrum cocktail of protease inhibitors to prevent coagulation and stabilize the plasma proteins. They also include a mechanical separator, which provides a physical barrier between plasma and cell pellets after centrifugation. Few methods have been devised to extract DNA from clotted blood samples collected in old plasma tubes2-4. Challenges from these methods were mainly associated with the type of separator inside the tubes (gel separator) and included difficulty in recovering the clotted blood, the inconvenience of fragmenting or dispersing the clot, and obstruction of the clot extraction by the separation gel.
We present the first method that extracts and purifies genomic DNA from blood drawn in the new BD P100 tubes. We compare the quality of the DNA sample from P100 tubes to that from EDTA tubes. Our approach is simple and efficient. It involves four major steps as follows: 1) the use of a plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) tube with mechanical separator for blood collection, 2) the removal of the mechanical separator using a combination of sucrose and a sterile paperclip metallic hook, 3) the separation of the buffy coat layer containing the white cells and 4) the isolation of the genomic DNA from the buffy coat using a regular commercial DNA extraction kit or a similar standard protocol.

We are describing a new method of isolating genomic DNA from whole blood collected for plasma/serology. After plasma collection, the compacted blood is usually discarded. Our novel method represents a significant improvement over existing methods and makes DNA and plasma available from a single collection, without requesting additional blood.

שיטה מעשית ורומן לחלץ הדנ&quot;א הגנומי מערכות דם אוסף לשימור חלבון פלזמה

Laboratory tests can be done on the cellular or  fluid portions of the blood. The use of different blood collection tubes  determines the portion of the ...

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black box&#34; because an experimentalist does not know if it has been performed successfully until the last of several steps. Moreover, the quality of western blot data is sometimes challenged due to a lack of effective quality control tools in place throughout the western blotting process. Here we describe the V3 western workflow, which applies stain-free technology to address the major concerns associated with the traditional western blot protocol. This workflow allows researchers: 1) to run a gel in about 20-30 min; 2) to visualize sample separation quality within 5 min after the gel run; 3) to transfer proteins in 3-10 min; 4) to verify transfer efficiency quantitatively; and most importantly 5) to validate changes in the level of the protein of interest using total protein loading control. This novel approach eliminates the need of stripping and reprobing the blot for housekeeping proteins such as &#946;-actin, &#946;-tubulin, GAPDH, etc. The V3 stain-free workflow makes the western blot process faster, transparent, more quantitative&#160;and reliable.

V3 workflow is a western blot procedure using stain-free gels. The stain-free technology allows researchers to visualize protein separation quality, to verify the transfer efficiency, and most importantly, to validate the change in the protein of interest using total protein quantification as a reliable loading control.

זרימת עבודה ללא כתמים V3 לבקרת טעינת חלבונים מעשית, נוחה ואמינה ב-Blotting המערבי

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins within complex biological samples. Since then, western blotting methodology has become a common component of the molecular biologists experimental repertoire. A cursory search of PubMed using the term &#8220;western blot&#8221; suggests that in excess of two hundred and twenty thousand published manuscripts have made use of this technique by the year 2014. Importantly, the last ten years have seen technical imaging advances coupled with the development of sensitive fluorescent labels which have improved sensitivity and yielded even greater ranges of linear detection. The result is a now truly Quantifiable Fluorescence based Western Blot (QFWB) that allows biologists to carry out comparative expression analysis with greater sensitivity and accuracy than ever before. Many &#8220;optimized&#8221; western blotting methodologies exist and are utilized in different laboratories. These often prove difficult to implement due to the requirement of subtle but undocumented procedural amendments. This protocol provides a comprehensive description of an established and robust QFWB method, complete with troubleshooting strategies.

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

מדריך למודרני כמותי פלורסנט המערבי סופג עם אסטרטגיות לפתרון בעיות

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Endotracheal Intubation of Rabbits Using a Polypropylene Guide Catheter

Endotracheal intubation in rabbits can be challenging due to their unusual anatomy. Achieving a patent airway during anesthesia is critical for the avoidance of airway obstruction, prevention of gastric tympany, and to allow ventilatory support. Due to the difficulty of intubation, alternative methods such as the use of laryngeal mask airways or laryngeal tubes have been explored. However, these methods do not result in direct access to the trachea and thus may present a risk for development of complications. In addition, lack of direct intubation of the trachea can result in personnel exposure to waste anesthetic gases. Numerous methods for endotracheal intubation have been described, including blind placement, use of a fiberoptic laryngoscope or endoscope, and cricoid placement. Despite these numerous publications, many still struggle to achieve success. Here we provide a detailed description of an intubation technique that can be taught with minimal training with a short time to proficiency. Briefly, after administration of injectable anesthesia and proper positioning of the rabbit, a polypropylene catheter is placed into the trachea by direct visualization using a laryngoscope. The catheter is then used as a guide to direct the endotracheal tube into the trachea. This method allows for intubation without the need for expensive equipment and can be performed by a single individual without the need for an assistant. In conclusion, this technique can be easily taught and performed at very little cost in any clinical or research setting.

Endotracheal intubation in rabbits is challenging due to their unusual anatomy. Here we present a technique for direct intubation of the trachea using a polypropylene catheter as a guide. This method utilizes relatively inexpensive supplies, requires minimal training, and can be easily performed in any clinical setting.

צנרור אנדוטרכאליות ארנבים באמצעות צנתר מדריך פוליפרופילן

Endotracheal intubation in rabbits can be challenging due to their unusual anatomy. Achieving a patent airway during anesthesia is critical for the ...

Practical Use of RNA Interference: Oral Delivery of Double-stranded RNA in Liposome Carriers for Cockroaches

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool operating by disruption of essential gene expression. Although different methods, such as injection, feeding, and soaking, have been reported for successful delivery of double-stranded RNA (dsRNA), the efficiency of RNAi through oral delivery of dsRNA is highly variable among different insect groups. The German cockroach, Blattella germanica, is highly sensitive to the injection of dsRNA, as shown by many studies published previously. The present study describes a method to demonstrate that the dsRNA encapsulated with liposome carriers is sufficient to retard the degradation of dsRNA by midgut juice. Notably, the continuous feeding of dsRNA encapsulated by liposomes significantly reduces the tubulin expression in the midgut, and led to the death of cockroaches. In conclusion, the formulation and utilization of dsRNA lipoplexes, which protect dsRNA against nucleases, could be a practical use of RNAi for insect pest control in the future.

This manuscript demonstrates the depletion of gene expression in the midgut of the German cockroach through oral ingestion of double-stranded RNA encapsulated in liposomes.

שימוש מעשי של RNA הפרעה: משלוח אוראלי של זוגיות גדילי RNA ב ליפוזום ספקים עבור ג ' וקים

RNA interference (RNAi) has been widely applied for uncovering the biological functions of numerous genes, and has been envisaged as a pest control tool ...

A Sectioning, Coring, and Image Processing Guide for High-Throughput Cortical Bone Sample Procurement and Analysis for Synchrotron Micro-CT

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been studied substantially using traditional two-dimensional techniques. Recent advancements in X-ray imaging technology via desktop micro-computed tomography (&#181;CT) and synchrotron radiation micro-computed tomography (SR&#181;CT) have allowed for the acquisition of high-resolution three-dimensional (3D) scans of a larger field of view (FOV) than other 3D imaging techniques (e.g., SEM) providing a more complete picture of microscopic structures within human cortical bone. The specimen should be accurately centered within the FOV, however, to limit the appearance of streak artifacts known to impact data analysis. Previous studies have reported procurement of irregularly shaped rectilinear bone blocks that result in imaging artifacts due to uneven edges or image truncation. We have applied a geological sampling protocol (coring) to procure consistently sized cortical bone core specimens for SR&#181;CT experiments from the anterior aspect of human femora. This coring method is efficient and minimally destructive to tissue. It creates uniform cylindrical samples that decrease imaging artifacts by nature of being isometric during rotation and providing a uniform path length for X-ray beams throughout scanning. Image processing of X-ray tomographic data of cored and irregularly shaped samples confirms the potential of the technique to improve visualization and analysis of cortical bone microarchitecture. A goal of this protocol is to deliver a reliable and repeatable method for the extraction of cortical bone cores that is adaptable for various types of high-resolution bone imaging experiments. An overarching goal of the work is to create a standardized cortical bone procurement for SR&#181;CT that is affordable, consistent, and straightforward. This procedure may further be adapted by researchers in related fields who commonly evaluate hard composite materials such as in biological anthropology, geosciences, or material sciences.

We employed a geological (coring) sampling protocol to procure cortical bone specimens of uniform size for SR&#181;CT experiments from the anterior aspect of human femora. This method is minimally destructive, efficient, results in cylindrical specimens that minimize imaging artifacts from irregular sample shapes and improves microarchitectural visualization and analysis.

מדריך מקטעים, קורינג ועיבוד תמונה לרכש וניתוח מדגם עצם קליפת המוח בעל תפוקה גבוהה עבור מיקרו-CT של Synchrotron

Bone is a dynamic and mechanically active tissue that changes in structure over the human lifespan. The products of the bone remodeling process have been ...

A Step-by-Step Guide to Mosquito Electroantennography

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when acquiring a blood-meal. To locate a host to feed on, mosquitoes rely on a wide range of sensory cues, including visual, mechanical, thermal, and olfactory. The study details a technique, electroantennography (EAG), that allows researchers to assess whether the mosquitoes can detect individual chemicals and blends of chemicals in a concentration-dependent manner. When coupled with gas-chromatography (GC-EAG), this technique allows to expose the antennae to a full headspace/complex mixture and determines which chemicals present in the sample of interest, the mosquito can detect. This is applicable to host body odors as well as plant floral bouquets or other ecologically relevant odors (e.g., oviposition sites odorants). Here, we described a protocol that permits long durations of preparation responsiveness time and is applicable to both female and male mosquitoes from multiple genera, including Aedes, Culex, Anopheles, and Toxorhynchites mosquitoes. As olfaction plays a major part in mosquito-host interactions and mosquito biology in general, EAGs and GC-EAG can reveal compounds of interest for the development of new disease vector control strategies (e.g., baits). Complemented with behavioral assays, the valence (e.g., attractant, repellent) of each chemical can be determined.

The present article details a step-by-step protocol for successful and low noise electroantennograms in several genera of mosquitoes, including both females and males.

מדריך שלב אחר שלב לאלקטרואנטנוגרפיה של יתושים

Female mosquitoes are the deadliest animals on earth, claiming the lives of more than 1 million people every year due to pathogens they transmit when ...

פיתוח מודל עכבר לכריתת שחלות עם רמת FSH גבוהה

Exploring Independent Effects of Follicle-Stimulating Hormone In Vivo in a Mouse Model

During the transition from a reproductive to a nonreproductive phase (menopause), many women experience significant physiological and pathological changes, including decreased bone mass, increased blood lipids, and increased visceral adiposity. Levels of follicle-stimulating hormone (FSH) rise during the menopausal transition. Many studies have shown that FSH in various extragonadal tissues and organs is associated with the pathogenesis of multiple diseases. Thus, building an animal model that can help study the independent effects of FSH in vivo is particularly important. In this study, C57BL/6 female mice were ovariectomized and supplemented with estradiol valerate (OVX + E2) to eliminate the effect of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. The OVX + E2 mice received solvent (N.S.) or different doses of recombinant FSH via intraperitoneal injection to create a mouse model (OVF) characterized by relatively stable estrogen and rising FSH levels. Thus, we successfully generated an experimental mouse model to mimic the early stage of menopause transition, characterized by elevated serum FSH levels. The OVF model has the advantages of being stable, low cost, and easy to operate, which is suitable for studies to explore the extragonadal actions of FSH. Here, we describe detailed protocols for the mouse OVF model.

מחבר זרקור: חקירת הקשר בין FSH ושינויים פתופיזיולוגיים אצל נשים לפני גיל המעבר - תובנות ממודל עכבר 

Follicle-stimulating hormone (FSH) in various extragonadal tissues and organs is associated with the pathogenesis of multiple diseases. The ovariectomized and FSH-treated mouse model (OVF) can be used to explore the extragonadal actions of FSH.