פרויקט זה מומן על ידי מחלקת אילינוי לבריאות הציבור של הקרן הלאומית למדע (DBI-0852416).

1. התקן פונקציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המכשיר להכניס hypoxic מכיל 6 עמודים כי קן לתוך צלחת 6-היטב סטנדרטי. הגז זורם לתוך העמוד, ברשת microfluidic בבסיס העמוד, זורם בחזרה מתוך המכשיר. בבסיס העמוד להרכיב את הקיר התחתון של microchannel הוא קרום עבה 100 מיקרומטר גז חדיר PDMS המאפשר דיפוזיה חמצן בין הגז microchannel והתקשורת והתרבות. לכן, המכשיר פועל על ידי יצירת שיפוע הריכוז שמניע את ריכוז החמצן התקשורת לקראת הערך הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המכשיר מציע מספר יתרונות על פני החדר hypoxic אחרים חמצון מערכות תאים: 1) ממזער את דיפוזיה חמצן נתיב המאפשר שליטה הזמני מהר יותר, 2) משפר את השליטה במרחב מעל חמצון, כמו תלויים על עיצוב עמוד microchannel, 3) הוא בעל טביעת מעבדה קטנות תפוקה גבוהה יותר כדי להגביר את יעילות הניסוי, ו 4) מסתגל נפוץ בתרבות כלים התא (לדוגמא צלחת multiwell) ללא צורך בידע ציוד מיוחדים. </li></ol> 2. התקן ייצור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית מערך האומנה היא העתק יצוק עם PDMS בדפוס Delran במכונה בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבא הגז microchannel בתחתית כל עמוד הוא מפוברק באמצעות תקן SU-8 photolithography דפוס PDMS העתק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גז קרום חדיר הוא מפוברק על ידי ספינינג מוגדרת של PDMS על פרוסות סיליקון כדי להגיע לעובי הרצוי. בדוגמה זו אנו משתמשים קרום 100 מיקרומטר עבה אשר היה מפוברק ספינינג 500 סל&quot;ד למשך 10 שניות ולאחר מכן 900 סל&quot;ד למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הרכיבים מחוברים יחד לאחר טיפול חמצן פלזמה עם מכשיר פלזמה כף יד (דגם BD-20, אלקטרו טכני מוצרים). </li></ol> 3. התקן ההתקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס בעדינות לתוך הצלחת המכשיר, ולוודא כדי למנוע בועות. Angling את המכשיר במהלך הכניסה עוזר לגרש את בועות צד אחד. עבור מבוססי תאים ניסויים בפועל, צעד זה חייב להיעשות בתוך ברדס זרימה למינרית סטרילי. הסיכויים הם זיהום מופחת במידה ניכרת פעם את המכשיר מוכנס, כך ההרכבה יכולה להתבצע מעל החממה בסביבה לא סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור צינור הגז מטנק מקור ליציאות מפרצון ו לשקע של המכשיר. עבור מבוססי תאים ניסויים, בחממה תרבות צריכה חור כדי לאפשר כניסה צינורות, צינורות צריך להיות מחובר לאחר שנשא את המכשיר ומעמידים אותו לתוך החממה. היזהר, כדי למנוע הפעלת לחץ עודף על המכשיר, אשר יכול לעוות PDMS מספיק כדי למחוץ את התאים הבסיסית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא וסת זרימה דיוק סגור לפני פתיחת הרגולטור גופייה להימנע גדותיו את המכשיר. הפעל את זרימת הגז. בעדינות דיוק לפתוח זרימת הרגולטור על קצב הזרימה הרצוי (5-10 mL / min). צפה ערך מקרוב בשעה הקרובה ולבצע התאמות כנדרש, שכן ירידה בלחץ ישתנה בזמן שהמערכת המאזן, לשנות את קצב הזרימה. כדי למנוע היווצרות של בועות בתקשורת, להקטין את קצב זרימת דקות בין 10-20 מ&quot;ל / אחרי משך 15 דקות הראשונית איזון עם קצב זרימה גבוה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הניסוי הרצוי, לעצור זרימת הגז, להסיר את צלחת, ותאי תהליך בהתאם (למשל lyse, כתם, לספור וכו &#39;). </li></ol> 4. התקן אימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את מספר ומיקום עמדות על החמצן פלורסנט (שועלי) להחליק חיישן (בהתאם לדרישות אימות) אשר ישמשו למדידת חמצן. שקופית מכיל רותניום פלורסנט צבע ציפוי כי הוא הרווה על ידי חמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף שקופית ישירות 0, 10, חמצן 21% מטנק גז לצלם תמונות אחרי 5 דקות של איזון נאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצוא עוצמת התמונה מתכוון לכל תפקיד ואת חמצון ריכוז העלילה כמו תלויה בעוצמת ניאון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת עקומת כיול על ידי עקומות ליניארי מתאים לקו 0-10% ו קו 10-21%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטרוגניות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקמת מספר רב של נקודות פורש את רוחב הערוץ במרווח מוגדר (למשל, כל 1 מ&quot;מ). שים לב כי ייתכן שיש חפיפה של תמונות בהתאם המרווח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את ריכוז החמצן על פני השטח גם דרך המכשיר </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר שלוש נקודות בשקופית שועלי בו כדי למדוד את ריכוז החמצן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר לכידת התמונה הראשונה ברמות החמצן הסביבה, לפתוח את זרימת דיוק הרגולטור כדי להתחיל לזרום גז לתוך המכשיר. צלמו תמונות בהפרש המתאים כדי להעריך את משך הזמן והיקף concentr חמצןאיזון ation (למשל כל 10 שניות למשך 30 דקות). </li></ol></li></ol> 5. יישומים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריפוי פצעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום לפני הניסוי, להשרות את הכנס מעוקרים PDMS במדיום סרום ללא לצמצם את לדכא היווצרות בועות הגז בבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות התאים 100% confluency בצלחת 6 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור שריטות ישר monolayers עם טיפ פיפטה p200 לדמות פצעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב התקשורת הסלולרי, לשטוף עם 5 מ&quot;ל התקשורת, ואת לשאוב שוב. חשוב לא להפריע monolayer של תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מילוי בארות בינוני עם 4 בסרום ללא מ&quot;ל כדי להפחית שגשוג תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום להכניס לתוך בארות ולהתחבר כל טוב ריכוז החמצן המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 6 גם להוסיף צלחת עם על הבמה מחומם על 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכידת זמן לשגות תמונות של התאים במרווח הרצוי משך מוחלט. T_Scratch של MATLAB, אלגוריתם למדידת הפצע, ניתן להשתמש בהם כדי לנתח את פני השטח נרפאו. </li></ol></li></ol> 6. נציג תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן אימות המכשיר להכניס hypoxic תערוכות שיפורים גדולים מעל תא hypoxic במונחים של זמן חמצן איזון וההיקף, הדורשים פחות מ 2 דקות כדי לייצב לחמצן 0.5%. קרום גם מכשיר בגודל הפער בתחתית היה גורם מכריע בקביעת יעילות איזון, עם פער גדול בגדלים הדורשים יותר זמן כדי להגיע היציב ריכוז חמצן ערכים. המכשיר גם מאפשר מידה רבה של שליטה על חמצון המרחבי היטב יחיד, ומאפשר היווצרות של מספר תנאים, ואף יצירת פרופיל חמצן מחזורית פני הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ריפוי פצע Monolayers Cell נחשפו חמצן 10% או 21% ואת שטח הפנים של הפצע נותח במשך הזמן. שריטות נחשף לחמצן 21% סגר את האיטי ביותר ו -10% בקצב המהיר ביותר. איור 1 מציג תמונות של שריטה במשך 17 שעות. הגרפים באיור 5 מראים את אחוז השטח פצע פתוח לשני ריכוזי חמצן למשך הניסוי. </li></ol> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig1tmb.jpg" alt="איור 1" border="0" /></a> באיור 1. סכמטי ודיאגרמות הממחישות תכונות המכשיר. המכשיר להכניס חמצן הוא מפוברק על ידי photolithography קונבנציונאלי (רשת microfluidic) דפוס העתק (רשת microfluidic והכנס הפיגום), ומוגדר ספינינג של PDMS (גז קרום חדיר). א) מכשיר חמצן מקוננות לתוך צלחת 6 באר. ב) דוגמאות של 24 ו 96, גם מערכים העמוד. ג) סכמטית חתך של עמוד. חמצן זורם לתוך המכשיר דרך כניסת ונוסע ברשת microfluidic בתחתית העמוד. חמצן יכול באופן חופשי מפוזר על פני קרום חדיר PDMS גז בתחתית העמוד ולפרוץ התקשורת והתרבות. ד) תמונת מיקרוסקופ מראה את התכונות השונות של עמוד ערוץ אחד מלמעלה, עם הודעות זכוכית מלוכדות עבור מחקרים איזון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig2tmb.jpg" alt="איור 2" border="0" /></a> איור 2. אימות של המכשיר עם חיישני חמצן. מתח חמצן היטב בתוך כל התאפיינה באמצעות חיישן חמצן מישוריים רותניום. כל התערובות הכילו חמצן וחנקן מאוזנת 5% CO 2 עבור חציצה התקשורת. א) מגרש הממחישות את ההשפעה של גובה לפרסם, מרחק דיפוזיה חמצן וכך בין קרום ותאים, על הזמן איזון ויעילות. הייטס הוקמו על ידי בדולח ההודעות כבול אל החלק התחתון של המכשיר. כל שלושת הגדלים לפרסם תשואה פעמים איזון משופר הרבה מעל חדר היפוקסי. שים לב כי הזמן הוא בקנה מידה יומן. ב) עלילה המתארת ​​את החמצן מהיר איזון זמן תגובה של המכשיר 0.2 מ&quot;מ הפער. ג) Multi-עמדת linescans נלקחו גם תחת microchannel ברחבי היטב כדי להבטיח הומוגניות של ריכוז החמצן הוצג על ידי המכשיר. גרף המתאר את ריכוז החמצן שנמדד לאחר יציקת 0%, 10%, חמצן 21% עבור 10 דקות. ד) התקן ביעילות שומרת חמצן 10% על פני 5 ימים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig3tmb.jpg" alt="איור 3" border="0" /></a> איור 3. ניסויים עם עיצובים מורכבים יותר חמצן microchannel. א) הגדרת מצב Dual-microchannel מניב יציב 0% ופרופיל חמצן 21% לעומת 14 ימים. ב) דפוס interdigitated ומפותלת של 500 מיקרומטר רוחב microchannels הארכת ברחבי הדואר תוצאות עמוד הפרופיל חמצן מחזורית. שים לב כי הנתונים רק משפט אחד מתאר נציג כמו יישור microchannel היה קשה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig5tmb.jpg" alt="איור 4" border="0" /></a> איור 4. תמונות Timelapse סגירת הפצע 0, 7, ו - 17 שעות לאחר שריטה הראשונית. תאים נמסרו חמצן 21% לאורך משך הניסוי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig6.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig6tmb.jpg" alt="איור 5" border="0" /></a> איור 5. השפעת ריכוז החמצן על קצב ריפוי הפצע assay שריטה.

המכשיר הוא מפוברק על ידי photolithography SU-8 סטנדרטי, דפוס העתק, ומוגדר ספינינג עשוי כולו polydimethylsiloxane. הגז מוחדר מכשיר להקים שיפוע הריכוז בין העמוד microchannel והתקשורת תרבות, הנהיגה את המערכת לכיוון ריכוז החמצן הרצויה שיווי משקל. המכשיר הוכח ביעילות לווסת את החמצון של זמן ומרחב בתוך היטב, וכן לווסת התנהגות הסלולר בהתאם. דפוסים מרחביים של חמצון מוגדר על ידי microchannel בבסיס העמוד, כך מגוון רחב של עיצובים יכול להיות מיושם ב crafting photomask. בנוסף, עירוי של גז הרצוי לשלב גז הבאר צפוי לשפר את זמן איזון וההיקף של היפוקסיה. רשת ערבוב microfluidic יכול להיות מותאם המכשיר כדי לספק אמצעי כדי לייצר תערובות גז הרומן של רק כמה מיכלי גז המניות. לבסוף, מנגנון התקשורת החליפין היה מבטל את הצורך להסיר את המכשיר מהצלחת multiwell, אשר התאים עשויים להגיב. המכשיר כולל יישומים בכל במבחנה או ניסוי לשעבר vivo הדורשים שליטה על ריכוז החמצן. כמו חמצן הוא משתנה פיזיולוגי חשוב המשפיע על רוב רובם של מסלולי איתות, תחומי המחקר שתועיל מוגבל על ידי יצירה של החוקר. כמה שדות ירוויחו השליטה הזמני משופרת של ריכוז החמצן כוללים גרורות סרטן, דום נשימה בשינה, פגיעה לבבית reperfusion איסכמיה, בקרב רבים אחרים. לדוגמה, היפוקסיה לסירוגין כבר בקורלציה עם סרטן פולשני יותר, upregulating מספר metastastis הקשורים גנים ביחס היפוקסיה normoxia רציפה. השליטה במרחב חשוב גם, כפי הדרגתיים חמצן הם קריטיים בהתפתחות, zonation כבד, רעילות התרופה, ואת הנישה בתאי גזע. המכשיר שהוצג במאמר זה ייהנו מספר תחומים של מחקר על ידי מתן מערכת עם טביעת רגל קטנה מעבדה, דרישות מבצעיות פשוטות יחסית, וכן שליטה רבה יותר על חשיפה חמצן לתאים.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PDMS-Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Planar FOXY sensor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ocean Optics</td>
<td>FOXY-SGS-M</td>
<td>Coated microscope slide</td>
</tr>
<tr>
<td>Gas regulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Omega</td>
<td>FL-1472-G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gas</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Airgas</td>
<td>Custom mixes</td>
<td>All have 5% CO2</td>
</tr>
<tr>
<td>SU-8 2150</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Microchem</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SAFC Biosciences</td>
<td>M3803</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ATCC</td>
<td>30-2020</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trypsin-EDTA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T4049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-Glutamine solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>G7513</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fabrication and operation of an oxygen insert for adherent cellular cultures 

החמצן הוא אפנן המפתח של מסלולים סלולריים רבים, אך המכשירים הנוכחי המתיר<em&gt; במבחנה</em&gt; אפנון חמצן מצליחים לענות על הצרכים של מחקר ביו. חדר היפוקסי מציע מערכת פשוטה לשליטה חמצון בכלי תרבות רגילה, אך חסר שליטה של ​​זמן ומרחב מדויק על ריכוז החמצן על פני השטח של התא, דבר המונע יישומה בלימוד מגוון רחב של תופעות פיזיולוגיות. מערכות אחרות השתפרו על חדר היפוקסי, אך דורשים ידע ציוד מיוחד עבור המבצע שלהם, מה שהופך אותם מאיימת לחוקר הממוצע. הכנס microfabricated עבור צלחות multiwell פותחה כדי לשלוט באופן יעיל יותר את ריכוז החמצן ומרחב לתופעות פיזיולוגיות מצאו מודל טוב יותר<em&gt; In vivo</em&gt;. הפלטפורמה כוללת להוסיף polydimethylsiloxane כי קינים לתוך צלחת multiwell רגיל ומשמש רשת הגז פסיבי microfluidic עם קרום חדיר גז שנועד לווסת את אספקת החמצן לתאים חסיד. המכשיר פשוט לשימוש מחובר מיכלי גז המספקים את הלחץ כדי להציג את ריכוז החמצן הרצויה לתוך הרציף. ייצור כולל שילוב של photolithography SU-8 סטנדרטי, דפוס העתק, ו PDMS מוגדר ספינינג על פרוסות סיליקון. הרכיבים של המכשיר מודבקים לאחר טיפול פני השטח באמצעות מערכת המוחזק ביד פלזמה. אימות מושגת באמצעות חיישן חמצן מישוריים ניאון. זמן איזון הוא בסדר גודל של דקות, מגוון רחב של פרופילים החמצן ניתן להשיג מבוסס על עיצוב המכשיר, כגון פרופיל מחזורית שהושג במחקר זה, ואפילו הדרגתיים חמצן לחקות את אלה שנמצאו<em&gt; In vivo</em&gt;. המכשיר יכול לעקר עבור תרבית תאים באמצעות השיטות הנפוצות ללא אובדן תפקוד. של התקן הישימות ללימוד<em&gt; במבחנה</em&gt; ריפוי הפצע התגובה יהיה הפגינו.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures at JoVE.com

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

ייצור ואימות של פלטפורמת התוספת על המציע שליטה משופרת על חמצון במרחב ובזמן בצלחת 6 באר. המכשיר להתאמה מספר מערכות התרבות יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של חמצן על ריפוי הפצע.

ייצור והפעלת הוספת חמצן עבור תרבויות נייד חסיד

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

fabrication-operation-an-oxygen-insert-for-adherent-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures 

9.6K Views.  University of Illinois. ייצור ואימות של פלטפורמת התוספת על המציע שליטה משופרת על חמצון במרחב ובזמן בצלחת 6 באר. המכשיר להתאמה מספר מערכות התרבות יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעות של חמצן על ריפוי הפצע.

Video: Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, many proteins are present as a freely diffusing population in free exchange with a sub-population that is tightly associated with a particular subcellular domain or structure. In situ subcellular fractionation allows the visualization of protein compartmentalization and can also reveal protein sub-populations that localize to specific structures. For example, removal of soluble cytoplasmic proteins and loosely held nuclear proteins can reveal the stable association of some transcription factors with chromatin. Subsequent digestion of DNA can in some cases reveal association with the network of proteins and RNAs that is collectively termed the nuclear scaffold or nuclear matrix. 
Here we describe the steps required during the in situ fractionation of adherent and non-adherent mammalian cells on microscope coverslips. Protein visualization can be achieved using specific antibodies or fluorescent fusion proteins and fluorescence microscopy. Antibodies and/or fluorescent dyes that act as markers for specific compartments or structures allow protein localization to be mapped in detail. In situ fractionation can also be combined with western blotting to compare the amounts of protein present in each fraction. This simple biochemical approach can reveal associations that would otherwise remain undetected.

In situ Subcellular Fractionation of Adherent and Non-adherent Mammalian Cells

In situ subcellular fractionation of mammalian cells on microscope coverslips allows the visualisation of protein localisation.

ב ההיפוך חלוקה subcellular באתרו של בתאי יונקים חסיד שאינן חסיד

Protein function is intimately coupled to protein localization. Although some proteins are restricted to a specific location or subcellular compartment, ...

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

Assay Clonogenic: תאים חסיד

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

כלי אנליטי שמכמת שינויי מורפולוגיה תאיים מתמונות פלואורסצנציה תלת ממדים

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Assay Explant להערכת התנהגות ניידת של mesenchyme הגולגולת

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

איתור, חזותי וquantitating הדור של מינים חמצן תגובתי במערכת מודל אמבה

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

פיתוח של מערכת כנס עמית התרבות שני סוגים סלולריים בהעדר לתקשר Cell-Cell

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and develops most often in the setting of immunosuppression. Despite decades of research, optimal treatment of KS remains poorly defined and clinical outcomes are especially unfavorable in resource-limited settings. KS lesions are driven by pathological angiogenesis, chronic inflammation, and oncogenesis, and various in vitro cell culture models have been developed to study these processes. KS arises from KSHV-infected cells of endothelial origin, so EC-lineage cells provide the most appropriate in vitro surrogates of the spindle cell precursor. However, because EC have a limited in vitro lifespan, and as the oncogenic mechanisms employed by KSHV are less efficient than those of other tumorigenic viruses, it has been difficult to assess the processes of transformation in primary or telomerase-immortalized EC. Therefore, a novel EC-based culture model was developed that readily supports transformation following infection with KSHV. Ectopic expression of the E6 and E7 genes of human papillomavirus type 16 allows for extended culture of age- and passage-matched mock- and KSHV-infected EC and supports the development of a truly transformed (i.e., tumorigenic) phenotype in infected cell cultures. This tractable and highly reproducible model of KS has facilitated the discovery of several essential signaling pathways with high potential for translation into clinical settings.

An In Vitro Model for Studying Cellular Transformation by Kaposi Sarcoma Herpesvirus

Kaposi sarcoma (KS) is a tumor induced by infection with the oncogenic virus human herpesvirus-8/KS herpesvirus (HHV-8/KSHV). The endothelial cell culture model described here is uniquely suited for studying the mechanisms by which KSHV transforms host cells.

מודל במבחנה עבור לימודי טרנספורמציה התאית על ידי ההרפס סרקומה קפוסי

Kaposi sarcoma (KS) is an unusual tumor composed of proliferating spindle cells that is initiated by infection of endothelial cells (EC) with KSHV, and ...

Real-Time Detection of Reactive Oxygen Species Production in Immune Response in Rice with a Chemiluminescence Assay

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen infection or challenge with pathogen-associated chemicals (pathogen-associated molecular patterns [PAMPs]), an array of immune responses, including a ROS burst, are quickly induced in plants, which is called PAMP-triggered immunity (PTI). A ROS burst is a hallmark PTI response, which is catalyzed by a group of plasma membrane-localized NADPH oxidases-the RBOH family proteins. The vast majority of ROS comprise hydrogen peroxide (H2O2), which can be easily and steadily detected by a luminol-based chemiluminescence method. Chemiluminescence is a photon-producing reaction in which luminol, or its derivative (such as L-012), undergoes a redox reaction with ROS under the action of a catalyst. This paper describes an optimized L-012-based chemiluminescence method to detect apoplast ROS production in real-time upon PAMP elicitation in rice tissues. The method is easy, steady, standardized, and highly reproducible under firmly controlled conditions.

Here, we describe a method for the real-time detection of apoplastic reactive oxygen species (ROS) production in rice tissues in pathogen-associated molecular pattern-triggered immune response. This method is simple, standardized, and generates highly reproducible results under controlled conditions.

זיהוי בזמן אמת של ייצור מיני חמצן תגובתי בתגובה חיסונית באורז עם בדיקת כימילומינסנציה

Reactive oxygen species (ROS) play vital roles in a variety of biological processes, including the sensing of abiotic and biotic stresses. Upon pathogen ...

An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of conditioned media remains time-consuming and far from physiological and pathological conditions. Although a few models of co-culture are commercially available, they remain restricted to specific assays and are mostly for two types of cells. 
Here, 3D-printed inserts are used that are compatible with numerous functional assays. The insert allows the separation of one well of a 6-well plate into four compartments. A wide range of combinations can be set. Moreover, windows are designed in each wall of the compartments so that potential intercellular communication between every compartment is possible in the culture medium in a volume-dependent manner. For example, paracrine intercellular communication can be studied between four cell types in monolayer, in 3D (spheroids), or by combining both. In addition, a mix of different cell types can be seeded in the same compartment in 2D or 3D (organoids) format. The absence of a bottom in the 3D-printed inserts allows the usual culture conditions on the plate, possible coating on the plate containing the insert, and direct visualization by optical microscopy. The multiple compartments provide the possibility to collect different cell types independently or to use, in each compartment, different reagents for RNA or protein extraction. In this study, a detailed methodology is provided to use the new 3D-printed insert as a co-culture system. To demonstrate several capacities of this flexible and simple model, previously published functional assays of cell communication were performed in the new 3D-printed inserts and were demonstrated to be reproducible. The 3D-printed inserts and the conventional cell culture using conditioned media led to similar results. In conclusion, the 3D-printed insert is a simple device that can be adapted to numerous models of co-cultures with adherent cell types.

In this paper, a newly designed 3D-printed insert is presented as a model of co-culture and validated through the study of the paracrine intercellular communication between endothelial cells and keratinocytes.

עלון חדשני המודפס בתלת-ממד ונועד לאפשר תרביות תאים דו-ממדיות ותלת-ממדיות פשוטות

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...

כימות פיגמנט רשתית, אפיתל, פגוציטוזה והצטברות ליפופוסצין;

Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging pigment termed lipofuscin. The toxicity of lipofuscin is well established in Stargardt's disease, the most common inherited retinal degeneration, but is more controversial in age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of irreversible blindness in the developed world. Determining lipofuscin toxicity in humans has been difficult, and animal models of Stargardt's have limited toxicity. Thus, in vitro models that mimic human RPE in vivo are needed to better understand lipofuscin generation, clearance, and toxicity. The majority of cell culture lipofuscin models to date have been in cell lines or have involved feeding RPE a single component of the complex lipofuscin mixture rather than fragments/tips of the entire photoreceptor outer segment, which generates a more complete and physiologic lipofuscin model. Described here is a method to induce the accumulation of lipofuscin-like material (termed undigestible autofluorescence material, or UAM) in highly differentiated primary human pre-natal RPE (hfRPE) and induced pluripotent stem cell (iPSC) derived RPE. UAM accumulated in cultures by repeated feedings of ultraviolet light-treated OS fragments taken up by the RPE via phagocytosis. The key ways that UAM approximates and differs from lipofuscin in vivo are also discussed. Accompanying this model of lipofuscin-like accumulation, imaging methods to distinguish the broad autofluorescence spectrum of UAM granules from concurrent antibody staining are introduced. Finally, to assess the impact of UAM on RPE phagocytosis capacity, a new method for quantifying outer segment fragment/tips uptake and breakdown has been introduced. Termed "Total Consumptive Capacity", this method overcomes potential misinterpretations of RPE phagocytosis capacity inherent in classic outer segment "pulse-chase" assays. The models and techniques introduced here can be used to study lipofuscin generation and clearance pathways and putative toxicity.

מחבר זרקור: מודלים משופרים של ליפופוסצין וכימות של יכולת פגוציטוזה של סגמנט חיצוני בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית אנושיות מקוטבות מאוד  

This protocol describes a lipofuscin accumulation model in highly differentiated and polarized human retinal pigment epithelial (RPE) cultures and an improved outer segment (OS) phagocytosis assay to detect the total OS consumption/degradation capacity of the RPE. These methods overcome the limitations of previous lipofuscin models and classical pulse-chase outer segment phagocytosis assays.

מודלים משופרים של ליפופוסצין וכימות של יכולת פגוציטוזה של סגמנט חיצוני בתרביות אפיתל פיגמנט רשתית אנושיות מקוטבות מאוד

The daily phagocytosis of photoreceptor outer segments by the retinal pigment epithelium (RPE) contributes to the accumulation of an intracellular aging ...