وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل وزارة إلينوي للصحة العامة والمؤسسة الوطنية للعلوم (DBI - 0852416).

1. وظيفة الجهاز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجهاز يحتوي على إدراج ميتة 6 الركائز التي تعشش في لوحة 6 - جيدا القياسية. يتدفق الغاز إلى عمود ، عبر شبكة ميكروفلويديك عند قاعدة العمود ، وتدفقات التراجع عن الجهاز. في قاعدة العمود تشكيل الجدار أسفل متناهية هو 100 ميكرون سميكة غشاء PDMS الغاز نفاذية الأكسجين الذي يسمح نشرها بين متناهية الغاز ووسائل الإعلام الثقافة. وبالتالي ، فإن الجهاز يعمل عن طريق إنشاء الانحدار الذي يدفع التركيز على تركيز الأكسجين وسائل الإعلام من أجل التوصل إلى القيمة المطلوبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجهاز يوفر عددا من المزايا على الحجرة نقص الأوكسجين وغيرها من أنظمة تهوية الخلية : 1) يقلل المسار نشر أوكسجين السماح التحكم أسرع الزمانية ، 2) من شأنه أن يعزز السيطرة المكانية على الأوكسجين ، كما يعتمد على تصميم عمود متناهية ، 3) تمتلك أصغر البصمة المختبر والتعليم العالي لزيادة الكفاءة الإنتاجية التجريبية ، و 4) تتكيف مع الأدوات المشتركة ثقافة خلية (على سبيل المثال لوحة multiwell) دون الحاجة إلى المعرفة المتخصصة والمعدات. </li></ol> 2. جهاز تلفيق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أول مجموعة متماثلة هو الركيزة مع مصبوب في قالب PDMS Delran تشكيله من قبل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المقبل الغاز ملفقة متناهية في أسفل كل عمود باستخدام معيار SU - 8 ضوئيه وPDMS صب متماثلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غير ملفقة الغاز نفاذية الغشاء عن طريق الدوران محددة من PDMS على رقاقة السيليكون لتحقيق سمك المطلوب. في هذا المثال نستخدم غشاء 100 ميكرون سميكة التي كانت ملفقة من خلال الدوران 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثانية ثم 900 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مستعبدين جميع المكونات معا بعد العلاج البلازما الأوكسجين مع جهاز محمول البلازما (النموذجي BD - 20 ، تكنيك الكهربائية والمنتجات). </li></ol> 3. الجهاز الإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف إدراج الجهاز في لوحة ، مع التأكد من تجنب الفقاعات. الصيد الجهاز أثناء الإدراج يساعد على طرد فقاعات من جانب واحد. للتجارب خلية مقرها الفعلي ، لا بد من القيام بهذه الخطوة داخل غطاء تدفق الصفحي العقيمة. وتقلص إلى حد كبير من فرص تلوث مرة يتم إدراج الجهاز ، لذلك يمكن أن يتم التجميع عبر إلى حاضنة في بيئة غير معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توصيل أنابيب من خزان الغاز المصدر إلى منافذ مدخل ومخرج الجهاز. لخلية مقرها التجارب ، ينبغي أن يكون حاضنة للثقافة حفرة لتأشيرة دخول ، وينبغي أن أنابيب توصيل الأنابيب بعد تحمل الجهاز ووضعه في الحاضنة. نتوخى الحذر لتجنب الضغط الزائد على الجهاز ، الذي يمكن أن تشوه PDMS يكفي لسحق الخلايا الكامنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من إغلاق منظم التدفق الدقة قبل فتح المنظم الأعلى للدبابات لتجنب فيضان الجهاز. بدء تدفق الغاز. بلطف تدفق الدقة فتح المنظم لمعدل التدفق المطلوب (50-100 مل / دقيقة). يراقب عن كثب على مدى قيمة ساعة المقبلة ، وإجراء التعديلات حسب الحاجة ، حيث أن انخفاض الضغط في حين سيتم تغيير النظام equilibrates ، تغيير معدل التدفق. لتجنب تشكيل فقاعات في وسائل الإعلام ، والحد من معدل التدفق الى ما بين 10-20 دقيقة / مل بعد أولية مدتها 15 دقيقة مع موازنة ارتفاع معدل التدفق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة تجريبية المطلوب ، ووقف تدفق الغاز ، وإزالة لوحة ، وخلايا العملية وفقا لذلك (مثل ليز ، وصمة عار ، والعد ، الخ.) </li></ol> 4. الجهاز التحقق من صحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد ومكان وجود مواقع على الأوكسجين الفلورسنت (ماكر) شريحة استشعار (اعتمادا على شروط المصادقة) التي سيتم استخدامها لقياس الأوكسجين. الشريحة تحتوي على صبغة الفلورسنت الروثينيوم طلاء التي تطفئ بواسطة الأوكسجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعرض الشريحة مباشرة إلى 10 ، 0 ، والأكسجين 21 ٪ من خزان الغاز والتقاط الصور بعد 5 دقائق للموازنة سليمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصدير صورة كثافة يعني لكل موقف وتركيز الأوكسجين مؤامرة كما تعتمد على كثافة الفلورسنت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء منحنى المعايرة منحنيات خطية من المناسب أن خط 00-10 ٪ ، وسطر 10-21 ٪. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدم التجانس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء مراكز متعددة تغطي عرض القناة عند فاصل زمني محدد (على سبيل المثال كل 1 مم). علما أنه قد يكون هناك تداخل الصور اعتمادا على التباعد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تركيز الأوكسجين في السطح بشكل جيد من خلال الجهاز </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موازنة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار ثلاث نقاط على الشريحة التي ماكر لقياس تركيز الأوكسجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مباشرة بعد التقاط الصورة الأولى في مستويات الأكسجين المحيطة ، وفتح منظم التدفق الدقيق لبدء تدفق الغاز في الجهاز. التقاط الصور على فترات مناسبة لتقييم مدى ومدة الأوكسجين concentrموازنة العنصر (مثلا كل 10 ثانية لمدة 30 دقيقة). </li></ol></li></ol> 5. تطبيقات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التئام الجروح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقبل يوم من التجربة ، ونقع في إدراج PDMS معقمة خالية من مصل المتوسطة للحد من الغاز تمنع تشكيل فقاعة في البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الخلايا إلى 100 ٪ في لوحة confluency 6 - جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء خدوش على التوالي في monolayers مع طرف P200 ماصة لمحاكاة الجروح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وسائل الإعلام الخلية ، وشطف مع وسائل الإعلام 5 مل ، ونضح مرة أخرى. من المهم أن لا تخل أحادي الطبقة من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الملء مع 4 آبار متوسطة خالية مل مصل للحد من انتشار الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان إدراج في الآبار وتوصيل كل بئر إلى تركيز الأوكسجين المقابلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6 مكان جيد لوحة مع إدراج ساخنة على خشبة المسرح في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التقاط الصور الفاصل الزمني للخلايا عند الفاصل الزمني المطلوب والمدة الإجمالية. ويمكن استخدام T_Scratch MATLAB ، وهي خوارزمية قياس الجرح ، لتحليل مساحة الدامي. </li></ol></li></ol> 6. ممثل النتائج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجهاز التحقق من صحة يسلك جهاز ادخال تحسينات كبيرة على مدى نقص الأوكسجين في الغرفة ميتة من حيث الوقت ومدى موازنة الأكسجين ، الأمر الذي يتطلب أقل من 2 دقيقة لتحقيق الاستقرار للأوكسجين 0.5 ٪. كان غشاء الجهاز جيدا حجم الفجوة السفلية العامل الحاسم في تحديد كفاءة موازنة ، مع أحجام أكبر من الفجوة التي تتطلب المزيد من الوقت للوصول إلى حالة استقرار قيم تركيز الأوكسجين. يسمح الجهاز أيضا قدرا كبيرا من السيطرة على الأوكسجين المكانية في بئر واحدة ، مما يسمح بتشكيل ظروف متعددة ، وتوليد الأوكسجين حتى التشكيل دوري عبر سطح البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التئام الجروح تعرضت monolayers الخلية إلى 10 ٪ أو 21 ٪ أكسجين ومساحة الجرح تم تحليل أكثر من مرة. مغلق الخدوش تتعرض للأوكسجين 21 ٪ أبطأ و 10 ٪ أسرع. الشكل 1 يبين صورا لنقطة الصفر على مدار 17 ساعة. الرسوم البيانية في الشكل 5 تظهر في المئة من مساحة الجرح مفتوحا أمام كل من تركيز الأوكسجين لمدة التجربة. </li></ol> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig1.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig1tmb.jpg" alt="الشكل 1" border="0" /></a> الشكل 1. التخطيطي والمخططات التي توضح ميزات الجهاز. غير ملفقة الجهاز إدراج الأكسجين ضوئيه التقليدية (شبكة ميكروفلويديك) ، صب متماثلة (شبكة ميكروفلويديك وسقالة إدراج) ، وتعريف الغزل PDMS (الغاز نفاذية الغشاء). أ) جهاز الاوكسجين المتداخلة في لوحة 6 - جيدا. ب) أمثلة على 24 و 96 - جيدا صفائف العمود. ج) التخطيطي مستعرضة عمود. الأوكسجين يتدفق الجهاز من خلال مدخل ويسافر عبر شبكة ميكروفلويديك في الجزء السفلي من العمود. يمكن الأوكسجين منتشر بحرية عبر الغشاء PDMS الغاز نفاذية في الجزء السفلي من العمود ، ويذوب في وسائل الإعلام الثقافة. D) صورة المجهر إظهار ملامح مختلفة من عمود واحد من قناة أعلاه ، مع زجاج المشاركات المستعبدين للدراسات موازنة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig2.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig2tmb.jpg" alt="الشكل 2" border="0" /></a> الشكل 2. التحقق من صحة الجهاز مع أجهزة استشعار الأوكسجين. تميزت توتر الأوكسجين داخل كل بئر باستخدام الأكسجين الروثينيوم مستو الاستشعار. يتضمن كل الخلائط الأكسجين النيتروجين متوازنة و 5 ٪ CO 2 للالمؤقت وسائل الإعلام. أ) رسم يوضح تأثير ارتفاع آخر ، وبالتالي الأكسجين بعد نشرها بين الغشاء والخلايا ، في الوقت موازنة والفعالية. المرتفعات التي أنشئت قطع الزجاج المشاركات متجهة إلى أسفل الجهاز. كل ثلاثة أضعاف موازنة العائد أحجام آخر تحسنت كثيرا خلال غرفة ميتة. علما بأن الوقت على نطاق السجل. ب) رسم تصور موازنة الأكسجين زمن الاستجابة السريعة للجهاز الفجوة مم 0.2. كما اتخذت C) موقف متعدد linescans عبر البئر تحت متناهية لضمان تجانس تركيز الأوكسجين الذي قدمه الجهاز. رسم بياني يصور قياس تركيز الأوكسجين بعد غرس 0 ٪ ، 10 ٪ ، والأكسجين 21 ٪ لمدة 10 دقيقة. D) يحتفظ الجهاز بفعالية الأكسجين 10 ٪ على مدى 5 أيام. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig3.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig3tmb.jpg" alt="الشكل 3" border="0" /></a> الشكل 3. التجريب مع تصاميم أكثر تعقيدا الأكسجين متناهية. أ) الإعداد المزدوجة حالة مستقرة متناهية غلة 0 ٪ و 21 ٪ أكثر من ملف الأكسجين 14 يوما. ب) نمط interdigitated والمتعرجة من 500 ميكرومتر microchannels عرض تمتد عبر الالنتائج دعامة ه في التشكيل الأكسجين بصفة دورية. علما بأن البيانات يصور ممثل واحد فقط المحاكمة كما كان من الصعب محاذاة متناهية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig5.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig5tmb.jpg" alt="الشكل 4" border="0" /></a> الشكل 4. الصور Timelapse اغلاق الجرح 0 ، 7 ، و 17 ساعة بعد الصفر الأولي. تم تسليم الخلايا الأوكسجين 21 ٪ طوال مدة التجربة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1695/1695fig6.jpg"><img src="/files/ftp_upload/1695/1695fig6tmb.jpg" alt="الشكل 5" border="0" /></a> الشكل 5. تأثير على معدل تركيز الأوكسجين في التئام الجروح مقايسة الصفر.

وملفقة من قبل جهاز ضوئيه SU - 8 القياسية ، صب المتماثلة ، وتعريف الغزل ومصنوع بالكامل من polydimethylsiloxane. يتم إدخال الغاز في الجهاز لإنشاء معامل تركيز عمود متناهية بين وسائل الإعلام والثقافة ، ونظام القيادة نحو تركيز الأوكسجين التوازن المطلوب. وقد تبين أن الجهاز لتعدل على نحو فعال الأوكسجين الزمانية والمكانية داخل البئر ، وكذلك تعدل السلوك الخلوية بشكل مناسب. يتم تعريف الزخرفة المكاني للالأوكسجين من قبل متناهية على قاعدة العمود ، لذلك يمكن أن تنفذ مجموعة متنوعة من التصاميم في صياغة والضوئية الرئيسية. بالإضافة إلى ذلك ، من المتوقع ضخ الغاز المطلوب في مرحلة الغاز من البئر لتحسين وقت موازنة ومدى نقص الأكسجة. ويمكن تكييف شبكة ميكروفلويديك الاختلاط إلى الجهاز لتوفير وسيلة لإنتاج الغاز مخاليط الرواية من الأسهم فقط من الدبابات الغاز قليلة. أخيرا ، فإن آلية لتبادل وسائل الاعلام للقضاء على الحاجة لإزالة الجهاز من لوحة multiwell ، التي قد تستجيب الخلايا. الجهاز له تطبيقات في أي السابقين في المختبر أو التجربة الحية التي تتطلب السيطرة على تركيز الأوكسجين. والأكسجين هو متغير مهم الفسيولوجية التي تؤثر على الغالبية العظمى من مسارات الإشارات ، من محدودية مجالات البحوث التي من شأنها أن تستفيد من الابتكار لدى الباحث. بعض المجالات التي يمكن أن تستفيد من السيطرة على الزماني تعزيز تركيز الأوكسجين الانبثاث تشمل السرطان وتوقف التنفس أثناء النوم ، ونقص التروية القلبية الاصابة ضخه ، ضمن أشياء أخرى كثيرة. على سبيل المثال ، ارتبط نقص الأكسجة المتقطعة مع أكثر أنواع السرطان الغازية ، upregulating عددا من الجينات المرتبطة metastastis النسبية لنقص الأكسجة المستمر وnormoxia. السيطرة المكانية المهم أيضا ، كما هي التدرجات الأكسجين حاسما في التنمية ، وتحديد مناطق الكبد وسمية الدواء ، والخلايا الجذعية المتخصصة. سيقوم الجهاز المعروضة في هذه المقالة يستفيد عدد من المجالات البحثية من خلال توفير نظام البصمة مع أصغر المختبر ، والاحتياجات التشغيلية بسيطة نسبيا ، والسيطرة على أكبر بكثير التعرض الاوكسجين الى الخلايا.

<table><tbody><tr><td>PDMS-Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Planar FOXY sensor</td><td>Ocean Optics</td><td>FOXY-SGS-M</td><td>Coated microscope slide</td></tr><tr><td>Gas regulator</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>FL-1472-G</td><td></td></tr><tr><td>Gas</td><td>Airgas</td><td>Custom mixes</td><td>All have 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>SU-8 2150</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MDCK Growth Medium w/ L-Glutamine</td><td>SAFC Global</td><td>M3803</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr></tbody></table>

fabrication and operation of an oxygen insert for adherent cellular cultures

الأكسجين هو المغير الرئيسية للمسارات الخلوية كثيرة ، ولكن الأجهزة الحالية التي تسمح<em&gt; في المختبر</em&gt; تعديل الأكسجين تفشل في تلبية الاحتياجات من البحوث الطبية الحيوية. غرفة ميتة يوفر نظام بسيط للسيطرة على الأوكسجين في أوعية الثقافة القياسية ، لكنه يفتقر تحكم دقيق الزمانية والمكانية على مدى تركيز الأوكسجين على سطح الخلية ، ومنع تطبيقه في دراسة مجموعة من الظواهر الفسيولوجية. وقد تحسنت نظم أخرى على غرفة ميتة ، ولكنها تتطلب المعرفة المتخصصة والمعدات اللازمة لتشغيلها ، مما يجعلها مخيفة للباحث في المتوسط. وقد تم وضع لوحات ادخال microfabricated multiwell على نحو أكثر فعالية التحكم في تركيز الأوكسجين الزماني والمكاني للظواهر وجدت أفضل نموذج الفسيولوجية<em&gt; في الجسم الحي</em&gt;. منصة تتألف من ادخال polydimethylsiloxane أن أعشاش إلى لوحة multiwell القياسية ويعمل كشبكة الغاز ميكروفلويديك السلبي مع غشاء الغاز نفاذية الرامية لتعديل تسليم الاوكسجين الى خلايا ملتصقة. الجهاز سهل الاستخدام ومرتبط اسطوانات الغاز التي توفر لضغوط لتقديم تركيز الأوكسجين المطلوب في النظام الأساسي. تلفيق ينطوي على مزيج من ضوئيه SU - 8 القياسية ، صب المتماثلة ، وتعريف PDMS الغزل على رقاقة السيليكون. مستعبدين مكونات الجهاز بعد المعالجة السطحية باستخدام نظام البلازما باليد. ويتم إنجاز التحقق من صحة مع جهاز استشعار الأوكسجين الفلورسنت مستو. الوقت هو موازنة بناء على أمر من دقيقة ، ويمكن التوصل إلى تشكيلة واسعة من التشكيلات الأكسجين على أساس تصميم الجهاز ، مثل ملف دوري يتحقق في هذه الدراسة ، وحتى التدرجات الاوكسجين الى تقليد تلك التي وجدت<em&gt; في الجسم الحي</em&gt;. ويمكن للجهاز تعقيم للثقافة الخلية باستخدام الأساليب الشائعة دون فقدان وظيفة. الجهاز لدراسة انطباق<em&gt; في المختبر</emسيظهر&gt; ردا التئام الجروح.

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures at JoVE.com

Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

تلفيق والتحقق من منصة الإضافية التي توفر تعزيز الرقابة على الأوكسجين المكاني والزماني في صفيحة 6 - جيدا. الجهاز قابل للتكيف لعدد من النظم والثقافة ، ويمكن استخدامها للتحقق من آثار الأوكسجين على التئام الجروح.

تصنيع وتشغيل إدخال الأوكسجين للثقافات الخلوية منتسب

Oxygen is a key modulator of many cellular pathways, but current devices permitting in vitro oxygen modulation fail to meet the needs of biomedical ...

fabrication-operation-an-oxygen-insert-for-adherent-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

9.7K Views.  University of Illinois. تلفيق والتحقق من منصة الإضافية التي توفر تعزيز الرقابة على الأوكسجين المكاني والزماني في صفيحة 6 - جيدا. الجهاز قابل للتكيف لعدد من النظم والثقافة ، ويمكن استخدامها للتحقق من آثار الأوكسجين على التئام الجروح.

Video: Fabrication and Operation of an Oxygen Insert for Adherent Cellular Cultures

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events leading to stromal activation and establishment of the tumor microenvironment (TME). Several in vitro and in vivo models of the TME have been developed; however, in general these models do not readily permit isolation of individual cell populations, under non-perturbing conditions, for further study. To circumvent this difficulty, we have employed an in vitro TME model using a cell growth substrate consisting of a permeable microporous membrane insert that permits simple generation of highly enriched cell populations grown intimately, yet separately, on either side of the insert&#39;s membrane for extended co-culture times. Through use of this model, we are capable of generating greatly enriched cancer-associated fibroblast (CAF) populations from normal diploid human fibroblasts following co-culture (120 hr) with highly metastatic human breast carcinoma cells, without the use of fluorescent tagging and/or cell sorting. Additionally, by modulating the pore-size of the insert, we can control for the mode of intercellular communication (e.g., gap-junction communication, secreted factors) between the two heterotypic cell populations, which permits investigation of the mechanisms underlying the development of the TME, including the role of gap-junction permeability. This model serves as a valuable tool in enhancing our understanding of the initial events leading to cancer-stroma initiation, the early evolution of the TME, and the modulating effect of the stroma on the responses of cancer cells to therapeutic agents.

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

وتقليد من المكروية ورم: طريقة بسيطة لتوليد بالسكان خلية المخصب والتحقيق بين الخلايا الاتصالات

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

Cancer Research

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor cells with a natural matrix and continual flow of nutrients, as well as a model that shows the interaction of tumor cells with normal cellular components and a natural matrix. The acellular ex vivo lung model is created by isolating a rat heart-lung block and removing all the cells using the decellularization process. The right main bronchus is tied off and tumor cells are placed in the trachea by a syringe. The cells move and populate the left lung. The lung is then placed in a bioreactor where the pulmonary artery receives a continual flow of media in a closed circuit. The tumor grown on the left lung is the primary tumor. The tumor cells that are isolated in the circulating media are circulating tumor cells and the tumor cells in the right lung are metastatic lesions. The cellular ex vivo lung model is created by skipping the decellularization process. Each model can be used to answer different research questions.

Here, we present a protocol for an ex vivo lung cancer model that mimics the steps of tumor progression and helps to isolate a primary tumor, circulating tumor cells, and metastatic lesions.

نموذج الرئة اللاخلوي والخلوية لدراسة ورم خبيث

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Operation of a Benchtop Bioreactor

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to carefully control temperature, pH, and dissolved oxygen concentrations in particular makes them essential to efficient large scale growth and expression of fermentation products. This video will briefly describe the advantages of the fermentor over the shake flask. It will also identify key components of a typical benchtop fermentation system and give basic instruction on setup of the vessel and calibration of its probes. The viewer will be familiarized with the sterilization process and shown how to inoculate the growth medium in the vessel with culture. Basic concepts of operation, sampling, and harvesting will also be demonstrated. Simple data analysis and system cleanup will also be discussed.

Fermentors are used to increase culture yield and productivity of bioengineered cells. After screening multiple microbial or animal cell culture candidates in shake flasks, the next logical step is to increase the selected culture&#x2019;s biomass with the fermentor. This video demonstrates the setup and operation of a typical benchtop bioreactor system.

تشغيل الفوق تفاعلات الاحيائية

Fermentation systems are used to provide an optimal growth environment for many different types of cell cultures. The ability afforded by fermentors to ...

Bioengineering

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized medicine innovations. However, translating these advances into therapeutic applications will require in vitro systems that allow for robust, flexible, and cost effective bioreactor systems. There are several bioreactor systems currently utilized in research and commercial settings; however, many of these systems are not optimal for establishing, expanding, and monitoring the growth of different cell types. The culture parameters most challenging to control in these systems include, minimizing hydrodynamic shear, preventing nutrient gradient formation, establishing uniform culture medium aeration, preventing microbial contamination, and monitoring and adjusting culture conditions in real-time. Using a pneumatic single-use bioreactor system, we demonstrate the assembly and operation of this novel bioreactor for mammalian cells grown on micro-carriers. This bioreactor system eliminates many of the challenges associated with currently available systems by minimizing hydrodynamic shear and nutrient gradient formation, and allowing for uniform culture medium aeration. Moreover, the bioreactor&#8217;s software allows for remote real-time monitoring and adjusting of the bioreactor run parameters. This bioreactor system also has tremendous potential for scale-up of adherent and suspension mammalian cells for production of a variety therapeutic proteins, monoclonal antibodies, stem cells, biosimilars, and vaccines.

Using a pneumatic bioreactor, we demonstrate the assembly, operation, and performance of this single-use bioreactor system for the growth of mammalian cells.

زراعة خلايا الثدييات عن طريق استخدام المفرد نظام هوائي تفاعلات الاحيائية

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.

Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture

The functional behavior of cells in culture can be improved by culturing in more in vivo-like 3-dimensional culture environments16-21. This manuscript describes the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for in vivo-like mammalian tissue culture.

المفاعلات الحيوية الألياف المجوفة ل<em&gt; في فيفو</em&gt; تشبه الثدييات زراعة الأنسجة

Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage ...

Polydimethylsiloxane-polycarbonate Microfluidic Devices for Cell Migration Studies Under Perpendicular Chemical and Oxygen Gradients

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under combinations of chemical and oxygen gradients. Both chemical and oxygen gradients can greatly affect cell migration in vivo; however, due to technical limitations, very little research has been performed to investigate their effects in vitro. The device developed in this research takes advantage of a series of serpentine-shaped channels to generate the desired chemical gradients and exploits a spatially confined chemical reaction method for oxygen gradient generation. The directions of the chemical and oxygen gradients are perpendicular to each other to enable straightforward migration result interpretation. In order to efficiently generate the oxygen gradients with minimal chemical consumption, the embedded PC thin film is utilized as a gas diffusion barrier. The developed microfluidic device can be actuated by syringe pumps and placed into a conventional cell incubator during cell migration experiments to allow for setup simplification and optimized cell culture conditions. In cell experiments, we used the device to study migrations of adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells, A549, under combinations of chemokine (stromal cell-derived factor, SDF-1&#945;) and oxygen gradients. The experimental results show that the device can stably generate perpendicular chemokine and oxygen gradients and is compatible with cells. The migration study results indicate that oxygen gradients may play an essential role in guiding cell migration, and cellular behavior under combinations of gradients cannot be predicted from those under single gradients. The device provides a powerful and practical tool for researchers to study interactions between chemical and oxygen gradients in cell culture, which can promote better cell migration studies in more in vivo-like microenvironments.

The control of chemical and oxygen gradients is essential for cell cultures. This paper reports a polydimethylsiloxane-polycarbonate (PDMS-PC) microfluidic device capable of reliably generating combinations of chemical and oxygen gradients for cell migration studies, which can be practically utilized in biological labs without sophisticated instrumentation.

ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان البولي أجهزة ميكروفلويديك لخلية دراسات الهجرة تحت عمودي الكيميائية والتدرجات الأوكسجين

This paper reports a microfluidic device made of polydimethylsiloxane (PDMS) with an embedded polycarbonate (PC) thin film to study cell migration under ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

مغلق الثقافة خلية بروتوكول النظام باستخدام السفن HYPERStack مع تقنية الغاز مادة نافذ

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Affordable Oxygen Microscopy-Assisted Biofabrication of Multicellular Spheroids

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue assembling units for biofabrication. While the main power of the spheroid model is in mimicking physical-chemical gradients at the tissue microscale, the real physiological environment (including dynamics of metabolic activity, oxygenation, cell death, and proliferation) inside the spheroids is generally ignored. At the same time, the effects of the growth medium composition and the formation method on the resulting spheroid phenotype are well documented. Thus, characterization and standardization of spheroid phenotype are required to ensure the reproducibility and transparency of the research results. The analysis of average spheroid oxygenation and the value of O2 gradients in three dimensions (3D) can be a simple and universal way for spheroid phenotype characterization, pointing at their metabolic activity, overall viability, and potential to recapitulate in vivo tissue microenvironment. The visualization of 3D oxygenation can be easily combined with multiparametric analysis of additional physiological parameters (such as cell death, proliferation, and cell composition) and applied for continuous oxygenation monitoring and/or end-point measurements. The loading of the O2 probe is performed during the stage of spheroid formation and is compatible with various protocols of spheroid generation. The protocol includes a high-throughput method of spheroid generation with introduced red and near-infrared emitting ratiometric fluorescent O2 nanosensors and the description of multi-parameter assessment of spheroid oxygenation and cell death before and after bioprinting. The experimental examples show comparative O2 gradients analysis in homo- and hetero-cellular spheroids as well as spheroid-based bioprinted constructs. The protocol is compatible with a conventional fluorescence microscope having multiple fluorescence filters and a light-emitting diode as a light source.

The protocol describes high-throughput spheroid generation for bioprinting using the multi-parametric analysis of their oxygenation and cell death on a standard fluorescence microscope. This approach can be applied to control the spheroids viability and perform standardization, which is important in modeling 3D tissue, tumor microenvironment, and successful (micro)tissue biofabrication.

التصنيع الحيوي بمساعدة الأكسجين بمساعدة الأكسجين بأسعار معقولة للكرويات متعددة الخلايا

Multicellular spheroids are important tools for studying tissue and cancer physiology in 3D and are frequently used in tissue engineering as tissue ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

تطوير نظام إدراج المشارك ثقافة نوعين الخلوية في غياب خلية خلية الاتصال

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of conditioned media remains time-consuming and far from physiological and pathological conditions. Although a few models of co-culture are commercially available, they remain restricted to specific assays and are mostly for two types of cells. 
Here, 3D-printed inserts are used that are compatible with numerous functional assays. The insert allows the separation of one well of a 6-well plate into four compartments. A wide range of combinations can be set. Moreover, windows are designed in each wall of the compartments so that potential intercellular communication between every compartment is possible in the culture medium in a volume-dependent manner. For example, paracrine intercellular communication can be studied between four cell types in monolayer, in 3D (spheroids), or by combining both. In addition, a mix of different cell types can be seeded in the same compartment in 2D or 3D (organoids) format. The absence of a bottom in the 3D-printed inserts allows the usual culture conditions on the plate, possible coating on the plate containing the insert, and direct visualization by optical microscopy. The multiple compartments provide the possibility to collect different cell types independently or to use, in each compartment, different reagents for RNA or protein extraction. In this study, a detailed methodology is provided to use the new 3D-printed insert as a co-culture system. To demonstrate several capacities of this flexible and simple model, previously published functional assays of cell communication were performed in the new 3D-printed inserts and were demonstrated to be reproducible. The 3D-printed inserts and the conventional cell culture using conditioned media led to similar results. In conclusion, the 3D-printed insert is a simple device that can be adapted to numerous models of co-cultures with adherent cell types.

In this paper, a newly designed 3D-printed insert is presented as a model of co-culture and validated through the study of the paracrine intercellular communication between endothelial cells and keratinocytes.

ملحق مبتكر مطبوع ثلاثي الأبعاد مصمم لتمكين ثقافات الخلايا 2D و 3D المباشرة

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...