This work was funded by a Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Canada grant to MGM. JR is a NSERC-Vanier student fellow.

The authors have nothing to disclose.

השלב הקריטי ביותר של כל ניסוי מערכת שיתוף תרבות כנס למעשה שוכן בבחירת הכנס הראוי לשימוש. גודל נקבובי וחומר קרום חייבים להילקח בחשבון יסודי, מבלי לשכוח לקחת בחשבון את הסוג של תא יהיה זורע ואת מטרת הניסוי. לדוגמה, מבחני chemotaxic עשויים להשתמש באותו סוג של קרום מ שיתוף תרבו?...

המחקר של רקמות, איברים או מערכות במבחנה הוא ניסיון לפשט את היחסים המורכבים מאוד הקיים בין תת הסלולר מספר המרכיבות יצורים רב-תאיים. ואכן, מחקרים במבחנה מאפשרים לרכוש הבנה מפורטת של אוכלוסיות תא בודדות. ישנם שני יתרונות גדולים של עורכת ניסויים במבחנה: 1) מופחתים אינטראקציות הסלולר, ו -2) את היכולת לתפעל את הסביבה התאית בקלות. לפיכך, שני יתרונות אלה מדענים מותר לחזות את ההתנהגות של סוגי תאים מסוימים in vivo, שמוביל את היכולת לווסת תוצאות של השפעות חיצוניות באורגניזמים כולו. במובן זה, תרבית תאים במבחנה בדרך כלל עובדת כגשר מחבר מדעי חיים בסיסיים ויישומים. עם זאת, ישנם גם כמה חסרונות של עבודה במבחנה, אחד החשוב ביותר להיות כי הזמנה מסוימת עשויה לשכון הפיזיולוגיאל הרלוונטיות של פנוטיפים שנצפו. ואכן, כאשר סוג תא בודד הוא גדל בתוך סיר, התרבות מאבדת במידה שונה, קשרים בין התאים עם סוגי תאים אחרים, תרומתה לסביבת הלחות מן רקמות האורגניזם מוצא, ואת העוגנים בתוך הרקמה, שאיפשרה לו לקיים מבנה תלת ממדי בפרט לפעמים חיוני לתפקוד התא. שאל יחסים בין תאים טופל על ידי הפיתוח של טכניקות תרבות מעורבות. בשיטה זו, שתיים או יותר אוכלוסיות תאים גדלות יחד באותו כלי התרבות. עם זאת, תרבויות המעורבות אלה לשאת טרדות חשובות. מצד אחד, תת תא מסוים אינו אינטראקציה פיזית עם אחד אחר בתוך הרקמה ממוצא ולהסתמך אך ורק על תקשורת paracrine שנגרמה גורמים מסיסים מופרשים קולטנים סמוכים. זהו המקרה במשך כמה תהליכים דלקתיים שתלויים איתות ציטוקינים הפרוקסימלי. ב- C מעורבתultures, אינטראקציות פיסיות הם בלתי נמנעות ולעשות את זה אי אפשר ללמוד תקשורת paracrine בהעדר קשר תאי תאים שיכולים להניב תוצאות שינו. מצד שני, השגת פרשנויות תא ספציפי מתוך אוכלוסייה מעורבת הופך ישים ללא שימוש בטכניקות הפרדה קשים שיש בהם כדי להשפיע באופן משמעותי תוצאות. כדי לפתור סוגיות חשובות אלה, השימוש בתקשורת מותנית פותח כטכניקה המאפשרת תרבויות ממודרות וחקר האיתות אוטוקריני. שיטה זו דורשת העברת supernatant של סוג תא אחד, ובכך בשם בינוני מותנה, כדי בארות המכילות אוכלוסייה אחרת של תאים. עם זאת, חיסרון שחשוב זה מולקולות קצרת אינם שורדים מספיק זמן במדיום מותנה שיועברו הבארות של האוכלוסייה השנייה של תאים. גם מולקולות האריכה ימים ידוללו באופן משמעותי לאורך זמן עקב דיפוזיה. יתר על כן, הן תאאוכלוסיות להשתתף רק בתקשורת paracrine חד כיווני ולא בתקשורת דו-כיוונית פעילה. זה מוביל בהעדר איתות כי משוב הוא חיוני מחדש יחסים רב-תאיים מדויק ככל שהם קיימים in vivo. כתוצאה מכך מונע על ידי הצורך לדמות את המקורי טוב יותר בתנאי vivo בסביבת הסלולר במבחנה, כמה התקדמות טכניקות תרבית תאים הושגה במהלך השנים. אחד הפיתוחים המשמעותיים ביותר כבר בשימוש תומך חדיר עם ממברנות microporous עבור מידור בתרביות תאים, השתמשו בפעם הראשונה על ידי Grobstein בשנת 1953 1. תומך חדיר כאלה כבר מותאם לאורך השנים כדי להתאים סוגי תאים רבים כדי לשמש בכמה יישומים שונים. כיום, עזרה כזאת להתקיים כתוספות חלולות אשר נועדו לנוח בבארות מתוך צלחת תרבות multiwell רקמות או circuמנות Lar. במערכת שיתוף תרבות, את הכנס מכיל סוג תא אחד ואילו הבאר או צלחת מכילה האוכלוסייה התאית האחרת, מה שמאפשר ללמוד את התרומה של שתי אוכלוסיות שונות של תאים על סביבת הלחות שלהם (איור 1). כתוצאה מכך, קוטביות הסלולר (basolateral vs הפרשת פסגה או קבלת אות) נשמרה, ובכך מקנה מערכות שיתוף תרבות כנס יתרון חשוב על פני תרבויות מעורבות וטכניקות בינוניות מותנות. ישנם מספר סוגים של חומרי קרום זמינים, אלה הנפוצים ביותר פוליאסטר להיות (PET), פוליקרבונט (PC) או מצופה קולגן polytetrafluoroethylene (PTFE), והם קיימים בגדלים נקבוביים שונים הנעים בין 0.4 מיקרומטר 12.0 מיקרומטר. אלו סוגים של חומרים וגדלים נקבוביים מציעים קשת של הוסיף הפעלת תכונות משתנות רלוונטיות תכונות אופטיות, עובי קרום ודבק תא שהופכים אותם מעשיות ברמות שונות עבור השימושים הבאים לא מוגבלים ל: -studyingהתמיינות תאים, התפתחות עוברית, גרורות של גידולים ותיקון פצע על ידי מבחני chemotaxic דרך ממברנות חדירות; -evaluating חדירה התרופה על ידי הערכת התחבורה שלהם באמצעות monolayers אפיתל או אנדותל בתרבית על תומך חדיר, ו; תא שיתוף תרבויות -ביצוע לנתח מודולציות התנהגות התא הנגרמת על ידי גורמים מסיסים מופרש בהעדר מגע תאים תאים. מטרת מאמר זה היא לתאר שיקולים מתודיים הרחב למלא את הפונקציה השלישית כאמור לעיל, כי היא להעריך שינויים הסלולר בתיווך גורמים מסיסים מופרש בהעדר מגע תאים תאים באמצעות מערכת שיתוף תרבות הכנס. שדות שונים של מחקר לעשות שימוש במערכות שיתוף תרבות הכנס על מנת לענות על שאלות רלוונטיות שפעת גורמים מסיסים המופרשים על אוכלוסיות של תאים. ואכן, איתות אוטוקריני כי מודולציה התנהגות הסלולר ברמות שונות היא רלוונטית בכל הרקמותומערכות, מה שהופך מערכות שיתוף תרבות הכנס הכרחית כדי להבטיח התקדמות בתחומים אלה. לעומת זאת, השימוש מוסיף יכול לאשר כי תמרת אות על ידי מגע תאי תאים ישיר ולא על ידי גורמים מופרשים. אחד השימושים החשובים ביותר של מוסיף הוא במחקרי דלקת 2-14 בם ההשפעה של ציטוקינים מופרשים מוערכת ב שחקנים הסלולר שונים של חסינות. בפרט, המחקר של דלקת במערכת העצבים המרכזית (CNS) הרוויח מאוד ממחקרי שיתוף תרבות כנס, אשר אפשרו עדיפה בהגדרת תפקידי paracrine הברור של נוירונים המיקרוגליאה נהיגת neuroinflammation 15-21. מערכות אלו תוכננו גם ללמוד את הפוטנציאל האנטי-דלקתיות של מולקולות המסתמכת על יכולתם להפחית או למנוע את הפרשת גורמים פרו-דלקתיים 22-26. מחקר הנוגע סרטן 27-31, בפרט מנגנוני אנגיוגנזה 32-34 ו inflammatiעל 35-42 ב tumorigenesis, נהנה גם מערכות שיתוף תרבות הכנס. יתר על כן, גורמים מסיסים הם בעלות חשיבות עליונה בתהליכים שמניעי הבידול מספר מחקרים השתמשו מוסיף לענות על שאלות בדרך מסוימת שדה 43-50. במערכת העצבים המרכזית, כמו לראות רקמה עצבית יש פוטנציאל התחדשות מוגבלת מאוד, חקר neurotrophism ו neuroprotection הוא יסודי כבר הבטיחו נרחב על ידי שימוש בתאי גזע במערכות שיתוף התרבות 51-56. בנוסף, מוסיף גם מנוצלים בתחומים מגוונים כמו נפרולוגיה 57,58, אינטראקציות האנדותל אנגיוגנזה 59-62, אפופטוזיס איתות 63-65, דלקת השמנה ותסמונת מטבולית 22,23,66-67, אוזן פנימית הגנה על תאי שיער 68,69, ואפילו ארסי פטריית 70,71 ופרזיטולוגיה 72,73. מאמר זה מציע קווים מנחי מתודולוגיים כללי כדי להקים experimאף אוזן גרון לאור הערכת שינויים הסלולר בתיווך גורמים מסיסים מופרשים באמצעות מערכת שיתוף תרבות הכנס. בפרט, נוכל למקד את תשומת הלב שלנו על תרבויות-שיתוף תא העצב ואת השימושים שלהם בלימוד תהליך neuroinflammatory. בהתחשב הספקטרום רחב מאוד של ניסויים מוסיף לאפשר לטייס, זה בלתי נסבל לכסות כל היבט של טכניקת תרבית תאים זה. כדוגמא, פרוטוקול ספציפי כדי למדוד את ההשפעות של ציטוקינים המופרשים על ידי lipopolysaccharide (LPS) -activated microglia N9 על תאי PC12 עצביים שיפורט, מציע הבנה בטון של המתודולוגיה שיתוף תרבות כנס.

<table><tbody><tr><td>RPMI-1640 medium</td><td>Sigma</td><td>R8755</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle&amp;rsquo;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td><td>Sigma</td><td>D6421</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use, must be supplemented with 0.365 gm/L L-glutamine</td></tr><tr><td>Horse serum</td><td>ATCC</td><td>30-2040</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>MultiCell</td><td>80350</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Nerve Growth Factor-7S from murine submaxillary gland</td><td>Sigma</td><td>N0513</td><td>Reconstitute the lyophilized powder in a solution of buffered saline or tissue culture medium containing 0.1&amp;ndash;1.0% bovine serum albumin or 1-10% serum</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Sigma</td><td>T3924</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides from&amp;nbsp;Escherichia coli&amp;nbsp;055:B5</td><td>Sigma</td><td>L2880</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Cell culture inserts for use with 24-well plates</td><td>BD Falcon</td><td>353095</td><td>0.4 &amp;mu;m pores</td></tr><tr><td>24-well plates</td><td>TrueLine</td><td>TR5002</td><td>Coat with collagen before use</td></tr><tr><td>Routine PC12 cell culture medium</td><td></td><td></td><td>Routine N9 cell culture medium</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 85% RPMI medium</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 90% DMEM-F12 medium</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 10% heat-inactivated horse serum</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 10% heat-inactivated horse serum</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 5% heat-inactivated fetal bovine serum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC12 differentiation medium</td><td></td><td></td><td>N9 treatment medium</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 99% RPMI medium</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 99% DMEM-F12 medium</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 1% heat-inactivated fetal bovine serum</td><td></td><td></td><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 1% heat-inactivated fetal bovine serum</td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 50 ng/mL nerve growth factor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PC12 treatment medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 99% RPMI medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 1% heat-inactivated fetal bovine serum</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt to make straightforward the very complex relationships between the several cellular subtypes that compose multicellular organisms, in vitro techniques have been developed to help researchers acquire a detailed understanding of single cell populations. One of these techniques uses inserts with a permeable membrane allowing secreted soluble factors to diffuse. Thus, a population of cells grown in inserts can be co-cultured in a well or dish containing a different cell type for evaluating cellular changes following paracrine signaling in the absence of cell-cell contact. Such insert co-culture systems offer various advantages over other co-culture techniques, namely bidirectional signaling, conserved cell polarity and population-specific detection of cellular changes. In addition to being utilized in the field of inflammation, cancer, angiogenesis and differentiation, these co-culture systems are of prime importance in the study of the intricate relationships that exist between the different cellular subtypes present in the central nervous system, particularly in the context of neuroinflammation. This article offers general methodological guidelines in order to set up an experiment in order to evaluating cellular changes mediated by secreted soluble factors using an insert co-culture system. Moreover, a specific protocol to measure the neuroinflammatory effects of cytokines secreted by lipopolysaccharide-activated N9 microglia on neuronal PC12 cells will be detailed, offering a concrete understanding of insert co-culture methodology.

השימוש במערכות שיתוף תרבות כנס רלוונטי במיוחד בחקר של תהליכי neuroinflammatory שופכי אור יחסי paracrine בין שחקנים סלולריים השונים של מערכת העצבים המרכזית. חסינות של מערכת העצבים המרכזי מושגת בעיקר על ידי תאי תושב קרואי מיקרוגליאה מנטר סביבתם במצב מסועף הנח של...

Watch this Scientific Journal Video about Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact at JoVE.com

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

פיתוח של מערכת כנס עמית התרבות שני סוגים סלולריים בהעדר לתקשר Cell-Cell

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

development-an-insert-co-culture-system-two-cellular-types-absence

Research

JoVE Journal

Biology

27.8K Views.  University of Québec. In multicellular organisms, secreted soluble factors elicit responses from different cell types as a result of paracrine signaling. Insert co-culture systems offer a simple way to assess the changes mediated by secreted soluble factors in the absence of cell-cell contact.

Video: Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events leading to stromal activation and establishment of the tumor microenvironment (TME). Several in vitro and in vivo models of the TME have been developed; however, in general these models do not readily permit isolation of individual cell populations, under non-perturbing conditions, for further study. To circumvent this difficulty, we have employed an in vitro TME model using a cell growth substrate consisting of a permeable microporous membrane insert that permits simple generation of highly enriched cell populations grown intimately, yet separately, on either side of the insert&#39;s membrane for extended co-culture times. Through use of this model, we are capable of generating greatly enriched cancer-associated fibroblast (CAF) populations from normal diploid human fibroblasts following co-culture (120 hr) with highly metastatic human breast carcinoma cells, without the use of fluorescent tagging and/or cell sorting. Additionally, by modulating the pore-size of the insert, we can control for the mode of intercellular communication (e.g., gap-junction communication, secreted factors) between the two heterotypic cell populations, which permits investigation of the mechanisms underlying the development of the TME, including the role of gap-junction permeability. This model serves as a valuable tool in enhancing our understanding of the initial events leading to cancer-stroma initiation, the early evolution of the TME, and the modulating effect of the stroma on the responses of cancer cells to therapeutic agents.

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

חקיין של microenvironment הגידול: שיטה פשוטה ליצירת אוכלוסיות תאים מועשרות חוקרים אינטר תקשורת

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

Cancer Research

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

דפוסי שיתוף תרבות נייד באמצעות מערכות מימיות שני שלבים

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Bioengineering

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies of endothelial-epithelial bilayers have traditionally relied on permeable support models that enable bilayer culture, but permeable supports are limited in their ability to replicate the diversity of human basement membranes. In contrast, hydrogel models that require chemical synthesis are highly tunable and allow for modifications of both the material stiffness and the biochemical composition via incorporation of biomimetic peptides or proteins. However, traditional hydrogel models are limited in functionality because they lack pores for cell-cell contacts and functional in vitro migration studies. Additionally, due to the thickness of traditional hydrogels, incorporation of pores that span the entire thickness of hydrogels has been challenging. In the present study, we use poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels and a novel zinc oxide templating method to address the previous shortcomings of biomimetic hydrogels. As a result, we present an ultrathin, basement membrane-like hydrogel that permits the culture of confluent cellular bilayers on a customizable scaffold with variable pore architectures, mechanical properties, and biochemical composition.

Current bilayer culture models do not allow for functional in vitro studies that mimic in vivo microenvironments. Using polyethylene glycol and a zinc oxide templating method, this protocol describes the development of an ultrathin biomimetic basement membrane with tunable stiffness, porosity, and biochemical composition that closely mimics in vivo extracellular matrices.

תרבית תאים זגוגית אלסטי Porated Hydrogels כמו קרום המרתף ביונים עבור כפול

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

A Co-culture Method to Investigate the Crosstalk Between X-ray Irradiated Caco-2 Cells and PBMC

The protocol adopted in this work aims at unraveling how X-rays perturb the functioning of the intestinal barrier, focusing on the interplay between colorectal tumor cells and the immune system. Colorectal carcinoma is among the most common type of cancer, typically treated by surgery, chemotherapy, and radiotherapy. Advantages of radiotherapy in targeting the tumor are well known. However, even limited exposures of healthy tissues are of great concern, particularly regarding the effects on the intestinal barrier and the immune system. The adopted setup allows to study the interplay between two cell populations in a condition more similar to the physiological one, when compared to normal cell cultures. For this purpose, we resort to different techniques and we used an in vitro co-culture model, based on Caco-2 cells differentiated as a monolayer and PBMC, sharing the same culture medium. This protocol has been developed to focus on both macroscopic effects, i.e. cell viability and Trans-Epithelial Electrical Resistance (TEER), and, through western blot, molecular alterations, i.e. the activation of inflammatory pathway in immune cells and the tight junction protein expression in Caco-2 cells. Initial evaluation of radiation effects on Caco-2 cell viability was assessed via the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and Trypan blue assays, while TEER was measured at fixed time intervals through an ohmmeter specifically designed for co-culture systems. In this way, the effects due to radiation, the presence of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC), and eventually their synergistic effect, can be demonstrated. Through these complementary techniques, we observed a high radio-resistance of Caco-2 within the range of 2 - 10 Gy of X-rays and an increased Caco-2 monolayer permeability when PBMCs were added. In particular, PBMC presence was found to be associated with the variation in the tight junction scaffold proteins expression.

We present a protocol to investigate the crosstalk between X-ray-irradiated Caco-2 and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The protocol starts with Caco-2 irradiation and set-up of the co-culture with PBMC; subsequently, trans-epithelial electrical resistance is measured regularly over 48 h and western blot performed in both Caco-2 and PBMC.

שיטה תרבות משותפת לחקור Crosstalk בין רנטגן מוקרן קאקו-2 תאים, PBMC

The protocol adopted in this work aims at unraveling how X-rays perturb the functioning of the intestinal barrier, focusing on the interplay between ...

Immunology and Infection

Establishing Single-Cell Based Co-Cultures in a Deterministic Manner with a Microfluidic Chip

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases including cancer. However, it is challenging to clarify the complex mechanism of intercellular interactions in highly heterogeneous cell populations using conventional co-culture systems because the heterogeneity of the cell subpopulation is obscured by the average values; the conventional co-culture systems can only be used to describe the population signal, but are incapable of tracking individual cells behavior. Furthermore, conventional single-cell experimental methods have low efficiency in cell manipulation because of the Poisson distribution. Microfabricated devices are an emerging technology for single-cell studies because they can accurately manipulate single cells at high-throughput and can reduce sample and reagent consumption. Here, we describe the concept and application of a microfluidic chip for multiple single-cell co-cultures. The chip can efficiently capture multiple types of single cells in a culture chamber (~46%) and has a sufficient culture space useful to study the cells&#39; behavior (e.g., migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaction at the single-cell level. Lymphatic endothelial cells and oral squamous cell carcinoma were used to perform a single-cell co-culture experiment on the microfluidic platform for live multiple single-cell interaction studies.

This report describes a microfluidic chip-based method to set up a single cell culture experiment in which high-efficiency pairing and microscopic analysis of multiple single cells can be achieved.

הקמת תרבויות בודדות מבוססות-משותפות באופן דטרמיניסטי עם שבב מיקרופלואידיסי

Cell co-culture assays have been widely used for studying cell-cell interactions between different cell types to better understand the biology of diseases ...

Migration, Chemo-Attraction, and Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have identified a special population of vascular cells, the periventricular endothelial cells, that play a critical role in the migration and distribution of forebrain GABAergic interneurons during embryonic development. This, coupled with their cell-autonomous functions, alludes to novel roles of periventricular endothelial cells in the pathology of neuropsychiatric disorders like schizophrenia, epilepsy, and autism. Here, we have described three different in vitro assays that collectively evaluate the functions of periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons. Use of these assays, particularly in a human context, will allow us to identify the link between periventricular endothelial cells and brain disorders. These assays are simple, low cost, and reproducible, and can be easily adapted to any adherent cell type.

We present three simple in vitro assays-the long-distance migration assay, the co-culture migration assay, and chemo-attraction assay-that collectively evaluate the functions of human stem cell derived periventricular endothelial cells and their interaction with GABAergic interneurons.

הגירה, כימותרפיה-אטרקציה, ושיתוף התרבות Assays בשביל הגזע האנושי תאים הנגזרת האנדותל והנוירונים

Role of brain vasculature in nervous system development and etiology of brain disorders is increasingly gaining attention. Our recent studies have ...

Neuroscience

<meta charset="utf8"></head><body>מערכת תרבית משותפת תלת-ממדית דו-שכבתית מתקדמת לתאי אפיתל ופיברובלסטים

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods can enhance cell culture efficiency. This study introduces an advanced two-layered culture system intended to cultivate epithelial cells as tissue-like layers with the culture of fibroblasts within a 3D environment. Polyvinyl alcohol (PVA) and poly(&#949;-caprolactone) (PCL) nanofibrous membranes (NMs) were fabricated via electrospinning and utilized as a physiologically relevant extracellular matrix for the culture of epithelial cells and fibroblasts, respectively. In the upper insert wells, lung epithelial cells were cultivated on the PVA NM, and in the lower chambers, fibroblasts were cultured on the PCL NM. This configuration eliminates direct cell-cell contact and facilitates the examination of paracrine signaling mediated by soluble factors. Confocal microscopy was employed to analyze the distribution, growth pattern, and expression of intracellular proteins, including zona occludens in epithelial cells. Z-stacking techniques enabled detailed 3D reconstructions, providing precise insights into the integrity of tight junctions and spatial organization within the epithelial layer. Scanning electron microscopy (SEM) assessed the morphological characteristics of cell types on the nanofibrous membranes. SEM imaging revealed intricate cell surface structures and interactions with the nanofibers, offering a comprehensive perspective on cellular architecture and cell interaction with nanofibrous structure. The Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay is a simple method for measuring epithelial cell and fibroblast growth rates over time. It provides the proliferative behaviors and potential synergistic effects of coculturing these cells. These findings highlight the effectiveness of a simple insert co-culture system for simultaneous culture of fibroblasts and epithelial cells, which is crucial in various physiological and pharmacological contexts, including epithelial tissue regeneration, tumor microenvironment with endothelial, immune, and other stroma cells, toxicity assay, and drug activity test.

<meta charset="utf8"></head><body>מחבר זרקור: קידום מערכות קוקולטורה תלת-ממדית עם PVA-PCL ממברנות ננו-סיביות

Here, we demonstrate how epithelial cells cultured with fibroblasts in the nanofibrous membrane-based two-layer system can stably adhere to and grow on the membrane.

הקמת מודול קוקולטורה תלת מימדי של תאי אפיתל באמצעות ממברנות ננו-סיביות

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...

An Innovative 3D-Printed Insert Designed to Enable Straightforward 2D and 3D Cell Cultures

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of conditioned media remains time-consuming and far from physiological and pathological conditions. Although a few models of co-culture are commercially available, they remain restricted to specific assays and are mostly for two types of cells. 
Here, 3D-printed inserts are used that are compatible with numerous functional assays. The insert allows the separation of one well of a 6-well plate into four compartments. A wide range of combinations can be set. Moreover, windows are designed in each wall of the compartments so that potential intercellular communication between every compartment is possible in the culture medium in a volume-dependent manner. For example, paracrine intercellular communication can be studied between four cell types in monolayer, in 3D (spheroids), or by combining both. In addition, a mix of different cell types can be seeded in the same compartment in 2D or 3D (organoids) format. The absence of a bottom in the 3D-printed inserts allows the usual culture conditions on the plate, possible coating on the plate containing the insert, and direct visualization by optical microscopy. The multiple compartments provide the possibility to collect different cell types independently or to use, in each compartment, different reagents for RNA or protein extraction. In this study, a detailed methodology is provided to use the new 3D-printed insert as a co-culture system. To demonstrate several capacities of this flexible and simple model, previously published functional assays of cell communication were performed in the new 3D-printed inserts and were demonstrated to be reproducible. The 3D-printed inserts and the conventional cell culture using conditioned media led to similar results. In conclusion, the 3D-printed insert is a simple device that can be adapted to numerous models of co-cultures with adherent cell types.

In this paper, a newly designed 3D-printed insert is presented as a model of co-culture and validated through the study of the paracrine intercellular communication between endothelial cells and keratinocytes.

עלון חדשני המודפס בתלת-ממד ונועד לאפשר תרביות תאים דו-ממדיות ותלת-ממדיות פשוטות

The classical analyses of indirect communication between different cell types necessitate the use of conditioned media. Moreover, the production of ...

פיתוח של מערכת כנס עמית התרבות שני סוגים סלולריים בהעדר לתקשר Cell-Cell

Summary

Explore More Videos

חקיין של microenvironment הגידול: שיטה פשוטה ליצירת אוכלוסיות תאים מועשרות חוקרים אינטר תקשורת

דפוסי שיתוף תרבות נייד באמצעות מערכות מימיות שני שלבים

תרבית תאים זגוגית אלסטי Porated Hydrogels כמו קרום המרתף ביונים עבור כפול

שיטה תרבות משותפת לחקור Crosstalk בין רנטגן מוקרן קאקו-2 תאים, PBMC

הקמת תרבויות בודדות מבוססות-משותפות באופן דטרמיניסטי עם שבב מיקרופלואידיסי

הגירה, כימותרפיה-אטרקציה, ושיתוף התרבות Assays בשביל הגזע האנושי תאים הנגזרת האנדותל והנוירונים

הקמת מודול קוקולטורה תלת מימדי של תאי אפיתל באמצעות ממברנות ננו-סיביות

הקמת מודול קוקולטורה תלת מימדי של תאי אפיתל באמצעות ממברנות ננו-סיביות

הקמת מודול קוקולטורה תלת מימדי של תאי אפיתל באמצעות ממברנות ננו-סיביות

עלון חדשני המודפס בתלת-ממד ונועד לאפשר תרביות תאים דו-ממדיות ותלת-ממדיות פשוטות