ברצוננו להודות לחברי מעבדה בוכהולץ ואת סיגמא אולדריץ RNAi צוות לדיון. ברצוננו להודות מקס פלאנק החברה ואת für Bundesministerium Bildung und Forschung Grands Go-Bio [0315105] לתמיכה. MISSION ® הינו סימן מסחרי רשום של סיגמא אולדריץ ביוטכנולוגיה LP

1. באיכות גבוהה esiRNA המשימה ספריות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל עניין הגן לאזור המיקוד רגישים ביותר ספציפית עבור RNAi נבחר ניצול אלגוריתם DEQOR (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html). 4 ציונים DEQOR את הפוטנציאל ההשתקה של כל אפשרי 21 נוקלאוטידים siRNAs ארוכה mRNA-היעד המבוסס על המדינה-of-the-art עיצוב אילוצים 4. בנוסף, siRNA כל הפוטנציאל הוא ניתח עבור תגובתיות צולבת אפשרי עם גנים אחרים על ידי ביצוע חיפוש תפציץ נגד transcriptome האורגניזם למד. התוכנית ובכך מספק ניתוח של איכות הכוללת בין היכולות של השתקה esiRNA את הפוטנציאל (300-600 אורך נ&quot;ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האזור הנבחר של גנים היעד cDNA מוגבר על ידי ה-PCR באמצעות גן ספציפי primers מוקף bacteriophage RNA-פולימראז-האמרגן רצפים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל מוצר PCR המשמש לייצור esiRNA המשימה מאומתת זהות על ידי רצף של טוהר על ידי ניתוח Labchip Caliper. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לונג פעמיים תקועים RNA הוא עיבד מ-PCR המוצר על ידי RNA פולימראז, ואחריו חישול של גדילי עיבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> esiRNAs מוכנים על ידי עיכול אנזימטי מוגבל של פעמיים תקועים רנ&quot;א ארוך באמצעות RNaseIII ואחריו טיהור באמצעות כרומטוגרפיה אניון מטבע ניצול Q-sepharose עמודות ספין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> esiRNAs הם זירז ו resuspended במאגר TE. התשואה נמדדת UV-קליטת מדידות ריכוז מותאם ידי המסת בכרך המתאים של חיץ TE. האיכות הכוללת של המוצר הסופי נבדק על ידי ניתוח Labchip Caliper. </li></ol> 2. בחירת שורת תאים ואופטימיזציה transfection להקרנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמויות לכיל של esiRNA (שימוש Eg5 כמו חיוביים renilla-בלוציפראז כביקורת שלילית) והגדלת סכומי מגיב transfection בצלחת 384 היטב, מוסיפים תאים דגירה של 48 שעות. Eg5 הוא חלבון מנוע kinesin נדרש הרכבה ציר דו קוטבית דלדול מוביל לעצור mitotic. חזור על הליך זה עבור ריאגנטים transfection שונים שורות תאים. כאן, אנו משתמשים בתאים בתרבית הלה בעקבות הליכים סטנדרטיים oligofectamine (Invitrogen) כמו מגיב transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחירת תנאים אופטימליים transfection לספור את התאים transfected עם Eg5 esiRNAs להראות כי מעצר mitotic (צורה עגולה) ואת המספר הכולל של תאים transfected עם esiRNA (RLUC) renilla-בלוציפראז על ידי מיקרוסקופ אור. בחר את המצב עם רעילות לפחות RLUC ואת הפנוטיפ בולט ביותר Eg5. שיטה חלופית לייעול התנאים transfection כוללת שורת תאים יציבה מביע EGFP (או גן אחר כתב מתאים) תחת שליטה של ​​מקדם פעיל מכוננת. לאחר transfection של esiRNA נגד EGFP (או גן אחר כתב) ו RLUC (או אחרת esiRNA מתאים לשלוט שלילי) לדפוק למטה למדוד יעילות ורעילות על ידי מיון התא הקרינה למשל סייעה (FACS). ודא esiRNA המשמש EGFP הוא משלים לחלוטין-mRNA המטרה. </li></ol> 3. הגדרת את המסך ראשי 5,6 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מטב את הדיוק pipetting עבור כל הרכיבים המשמשים בתחנת pipetting אוטומטיות (למשל אקווריוס, טקאן WellMate, מטריקס). בגלל הפרמטרים pipetting לשנות בהתאם לסוג סוג, פתרון נפח צלחת אופטימיזציה זה יש צורך לחזור על כל שלב בנפרד. אם אפשר, תחנת pipetting צריך להיות ממוקם מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית כדי למנוע זיהומים. כל הרכיבים המשמשים צריך להיות מחוטא לפני השימוש או על ידי מעוקר אם ישים או על ידי ריסוס עם אתנול 75%. מטב לשטוף פרוטוקולים כך צולבות זיהום היטב גם היא מחוץ לתחום. פרטים עבור אופטימיזציה של pipetting אוטומטיות לא ניתן לתת תמורת אילוצי מרחב תלויות במידה רבה התחנה pipetting מנוצל. לפרטים נוספים עיין בפרוטוקול מייצרת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים Transfect בפורמט 384 גם באמצעות תנאי אופטימיזציה מלמעלה עם esiRNAs עבור Eg5 ו RLUC. השתמש דפוס לסירוגין במשך Eg5 ו RLUC esiRNA מכסה את הצלחת כולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגרה למשך 48 שעות לתקן את התאים עם 100% אתנול קר, רעננותם ב PBS במשך 15 דקות, כתם במשך 25 דקות ב PBS המכיל 1 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו - 100 מיקרוגרם DAPI / ml RNase (Qiagen). לבסוף לשטוף עם PBS ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת עוצמת הקרינה על ידי-DAPI למשל במיקרוסקופ על מערכת אולימפוס ScanR. יצירת היסטוגרמה של עוצמת DAPI מזימות כנגד מספר התא להעריך את חלוקת מחזור התא על ידי חישוב אחוז התאים עם ה-DNA תוכן 2N עבור שלב G1; &lt;2N&gt; 4N עבור S-שלב; 4N עבור G2/M-phase ו &gt; 4N עבור aneuploidy / polyploidy. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכת ההומוגניות של תוצאות מעל הצלחת. אופטימיזציה נוספת נדרשת אם תוצאות שונות משמעותית להוציא effe עמדהCTS. בעיה שכיחה בעת שימוש רב גם לוחיות אידוי היא משופרת על בארות קצה בזמן הדגירה. זה מוביל תנאים ניסויים שונים בבארות שונים, אשר לעתים קרובות מתרגמת צלחת עמדה השפעות ספציפיות. מסיבה זו, אנו ממליצים להשאיר את כל בארות קצה ריק במסך. כדי לצמצם עוד יותר אידוי לוודא כי חממות נשמרים לחות גבוהה. אנחנו גם שגרתי להעסיק מחסומים אידוי כגון קלטת איטום קורנינג לנשימה אשר לחסום אידוי. משאבים אחרים גם עבור אפקטים עמדה צריך להילקח בחשבון, וריאציה טכניים כגון מערכת readout (מיקרוסקופ צלחת הקורא, וכו &#39;) או וריאציות בטיפול נוזלי (הדרגתיים, inhomogeneity של פתרונות, וכו&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבדלים סטטיסטיים בין בקרות חיוביות ושליליות לספק למדוד את המשמעות של assay מועסק. הבדל גדול בין שליטה שלילי (או רעשי רקע, שליטה מדומה) לבין המדגם צריך להיות הוקמה לפני תחילת ההקרנה בפועל. מדד טוב עבור המשמעות הסטטיסטית היא Z-הגורם. Z-גורם מחושב המשוואה הבאה: Z = 1 - (3 SD [מדגם] + 3 SD [מדומה]) * (| באב [מדגם] - באב [מדומה] |) -1; עם SD: סטיית התקן; באב: ממוצע. Z-פקטור של 1&gt; Z&gt; 0.5 מצביע על הפרדה מובהקת סטטיסטית של בקרות שלילית (רעש) מן שולטת חיוביים 7. </li></ol> 4. ראשי המסך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 384 גם תרבות צלחות רקמה transfection של esiRNAs ניצול התנאים אופטימיזציה מלמעלה. כאן, אנו משתמשים esiRNA 15ng מומס היטב לכל חיץ TE 5μl. לפחות שמונה עמדות בקרה לכל צלחת צריך להיות עמוסה בקרות חיוביות ושליליות מתאים לתהליך ביולוגי למד (כאן: Eg5 ו RLUC). כדי למנוע תופעות עמדה בארות קצה נטענים עם חיץ TE 5μl בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5μl OptiMEM (Invitrogen) המכיל Oligofectamine 0.2μl לכל היטב, לערבב דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף ההשעיה התא על התערובת transfection (כאן: 40μl ההשעיה תא הלה במהירות של 25 תאים / ריכוז μl, שווה ערך ל 1000 לכל התאים היטב) ו דגירה במשך 72 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדד ה-DNA על תוכן מיקרוסקופ אוטומטיות (אולימפוס ScanR, ראה לעיל). הערכת משתמש Z-ציון סטטיסטיקה לבחירה להכות: Z-הציונים מחושבים עבור כל esiRNAs מדגם באמצעות האות שליטה שלילי כנקודת התייחסות. שים לב, הציון-Z אינו זהה כגורם-Z. Z-עשרות לספק מידה סטטיסטית המשמעות של ערכי המדגם בהשוואה שליטה (מדומה). זה מחושב על המשוואה הבאה: Z = (ערך [לדוגמא] - ממוצע [מדומה]) * סטיית תקן-[מדומה] -1. עבור מבחר פגע סף צריך להיות מיושם. בדרך כלל, משמעות קריטריונים כמו: 2 &lt;Z &lt;-2 משמש, אבל תלוי באיכות של בסיס הנתונים, את חקר תהליך ביולוגי או פשוט היקף של המסך, ספי שונות עשויות לחול. לצד ה-Z ציון סטטיסטיקה קל למדי גם משוכלל יותר שיטות הערכה מתמטית ניתן להשתמש (בתוך הראשונה לתוך שדה רחב של הערכות סטטיסטיות של נתוני ההקרנה ניתן למצוא Malo et al. 8). </li></ol> 5. מסך משני ואימות פגע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסך משני כדלקמן המסך העיקרי לחסל חיוביות שגויות עקב שגיאות ניסיוני או מחוץ היעד תופעות. במשך להיטים שנבחרו בהליך זהה בשימוש במסך הראשי יש לחזור על מספר גדול יותר של משכפל (3-5), כדי לאפשר הערכה סטטיסטית טובה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במשך להיטים מאומת esiRNA שאינן חופפות משני (או אחרת ההדק שאינן חופפות השתקה) נגד יעדים המזוהים המסכים הראשוני אמור לשמש. Assay אותו לקריאה החוצה צריך להיות מוחל גם על המסך הראשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של דבר הגנים הנבחר יכול להיות מאומת על ידי הצלה RNAi חוצה מינים 9. ובכך כרומוזום בקטריאלי מלאכותי (BAC) קידוד למשל ortholog את העכבר של הגן הוא transfected ביציבות לתוך התאים. BAC-בונה לשמר את הגן בהקשר הגנומי שלו ולאפשר ביטוי כמעט-פיזיולוגיים. RNAi נגד הגן האנושי אנדוגני יעזוב את transgene עכבר ביטוי ללא שינוי אשר מציל RNAi-פנוטיפ. RNAi הצלה מספק זהב סטנדרטי עבור אימות של פנוטיפים RNAi זמין עד כה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, המועמדים תוקף נלמדים בפירוט רב יותר בסופו של דבר לגזור הבנה מכניסטית. במקרים רבים RNAi יכול לשמש בניסויים אלה, למשל, מבחני משני משוכללים יותר. </li></ol>

<ol>
	<li>Ghildiyal, M., Zamore, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+silencing+RNAs:+an+expanding+universe.">Small silencing RNAs: an expanding universe.</a> Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).</li><li>Jackson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+reveals+off-target+gene+regulation+by+RNAi.">Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.</a> Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).</li><li>Echeverri, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+the+risk+of+reporting+false+positives+in+large-scale+RNAi+screens.">Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens.</a> Nat Methods. 3, 777-779 (2006).</li><li>Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEQOR:+a+web-based+tool+for+the+design+and+quality+control+of+siRNAs.">DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs.</a> Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).</li><li>Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+biology+of+mammalian+cell+division.">Systems biology of mammalian cell division.</a> Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-scale+RNAi+profiling+of+cell+division+in+human+tissue+culture+cells.">Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells.</a> Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).</li><li>Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+practice+in+high-throughput+screening+data+analysis.">Statistical practice in high-throughput screening data analysis.</a> Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+interference+rescue+by+bacterial+artificial+chromosome+transgenesis+in+mammalian+tissue+culture+cells.">RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).</li><li>Kittler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+resources+for+endoribonuclease-prepared+short+interfering+RNAs+for+specific+loss-of-function+studies.">Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies.</a> Nat Methods. 4, 337-344 (2007).</li></ol>

מחברים להכריז יחסים פיננסיים עם גופים מסחריים שאולי יש אינטרס העבודה שהוגשה.

התערבות RNA הפך טכניקה סטנדרטיים ללמוד הפסד של פונקציה פנוטיפים. בקנה מידה גדול אוספים של RNAi-מתווכים זמינים ספקים שונים ולספק שיטה קלה, חסכונית ומהירה על השתקה של גן. זה פתח את השער להקרנה שיטתית מפתח שחקנים תהליכים ביולוגיים רבים ומאפשר פרספקטיבה הגנום בקנה מידה על מגוון רחב של מינים שונים, סוגי תאים. שיעורי גבוהה שווא שלילי חיובי כוזב הם אתגר משותף מסכי RNAi. כדי לטפל בבעיה זו, מאמצים רבים הושקעו על מנת לשפר את היעילות בפרט הספציפיות של השתקת מפעילה. התגלית החשובה הייתה בריכה של siRNAs שונה המיקוד התמליל זהה משפר באופן משמעותי את היעד הספציפיות. מכיוון בריכת מורכבת מאוד של siRNAs שונה מופק על ידי endoribonuclease, esiRNAs גבוהים סגוליות מעורר היעד, הפחתת שיעור חיובי כוזב מסכי RNAi. esiRNAs הוכיחו גם להשיג knockdowns יעיל, גם הפחתת שיעור שלילי כוזב. מכיוון מסכי RNAi הם תובענית מבחינה טכנית, סביר להניח שהם יישארו מאתגר לבצע על בסיס קבוע במשך זמן מה. עם זאת, כפי ריאגנטים ומכשירים מעבדות לקבל יותר ויותר לשתף את מומחיותם, השימוש במסכים RNAi בביולוגיה המודרנית נחשבים להגדיל בעתיד.

<table border="1">
<tr>
<td>Material Name</td>
<td>Type</td>
<td>Company</td>
<td>Catalogue Number</td>
<td>Comments</td>
</tr>	
<tr>
<td>MISSION esiRNA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>For additional information contact: rnai@sial.com</td>
</tr>
<tr>
<td>Wellmate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ThermoScientific</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Breathable sealing tape</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345)</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>OptiMEM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=E7023|SIAL&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12346">Ethanol</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>E7023</td>
<td>200 proof (absolute), for molecular biology</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=P5493|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12347">Phosphate buffered saline</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P5493</td>
<td>BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=D8417|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12348">4&#x2032;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D8417</td>
<td>Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC)</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=R6513|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12349">Ribonuclease A from bovine pancreas</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>R6513</td>
<td>For molecular biology, &ge;70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder</td>
</tr>
<tr>
<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&N4=T9285|SIGMA&N5=SEARCH_CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC&cm_sp=affiliate-_-Jove-_-12350">Tris-EDTA buffer solution</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>T9285
</td>
<td>100 x, for molecular biology</td>
</tr>
</table>

mission esirna for rnai screening in mammalian cells

התערבות RNA (RNAi) הוא מנגנון בסיסי הסלולר לבקרה של ביטוי גנים. RNAi הוא המושרה על ידי פעמיים תקועים RNAs קצר הידוע גם בשם RNAs התערבות קטנה (siRNAs). קצר פעמיים תקועים RNAs מקורן יותר מבשרי גדילי כפול על ידי פעילות של דייסר, חלבון ממשפחת RNase III של endonucleases. שברי וכתוצאה מכך הם מרכיבים של RNA-Induced השתקה מורכבות (RISC), בהכוונת אותו mRNA המטרה מאותו מקור. RISC cleaves את ה-mRNA היעד ובכך להפחית את הביטוי של החלבון המקודד 1,2,3. RNAi הפכה שיטה ניסיונית עוצמה בשימוש נרחב עבור אובדן של מחקרים לתפקד גנים בתאי יונקים ניצול RNAs התערבות קטנה. כיום שתי שיטות עיקריות זמינים לייצור RNAs התערבות קטנה. שיטה אחת כרוכה סינתזה כימית, ואילו שיטה חלופית מעסיקה מחשוף endonucleolytic של יעד ספציפי פעמיים תקועים RNAs ארוך על ידי RNase III במבחנה. ובכך, בריכה מגוונת של siRNA כמו oligonucleotides מיוצר אשר ידוע גם בשם-siRNA endoribonuclease מוכן או esiRNA. השוואה של היעילות של siRNAs ו esiRNAs נגזרת כימית מראה מעורר הן עוצמה והשתקת מטרה גן. הבדלים עם זאת, ניתן לראות כאשר משווים סגוליות. רבים siRNAs מסונתז כימי יחיד לייצר בולטות מחוץ היעד תופעות, ואילו תערובת מורכבת הטמון esiRNAs מוביל מציאה ספציפי יותר 10. במחקר זה, אנו מציגים את העיצוב של הגנום בקנה מידה esiRNA ספריות המשימה וניצול שלו להקרנה RNAi לידי ביטוי במסך ה-DNA תוכן לזיהוי גנים המעורבים התקדמות מחזור התא. אנחנו מראים איך לייעל את פרוטוקול transfection ואת assay להקרנה של תפוקה גבוהה. אנחנו גם מדגימים כיצד נתונים גדולים מגדיר ניתן להעריך סטטיסטית ולהציג שיטות לאימות להיטים העיקרי. לבסוף, אנחנו נותנים נקודות מוצא פוטנציאל אפיונים תפקודית נוספת של להיטים תוקף.

Watch this Scientific Journal Video about MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells at JoVE.com

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

כאן אנו להשתמש בספריית esiRNA האדם המסך תפוקה גבוהה עבור גנים המעורבים חלוקת התא. אנו מדגימים כיצד להקים ולנהל מסכי esiRNA, וכן כיצד לנתח ולאמת את התוצאות.

המשימה esiRNA עבור הקרנת RNAi בתאי יונקים

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

mission-esirna-for-rnai-screening-in-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

16.1K Views.  Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics. כאן אנו להשתמש בספריית esiRNA האדם המסך תפוקה גבוהה עבור גנים המעורבים חלוקת התא. אנו מדגימים כיצד להקים ולנהל מסכי esiRNA, וכן כיצד לנתח ולאמת את התוצאות.

Video: MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes (A. gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite.  The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Protocol for RNAi Assays in Adult Mosquitoes A. gambiae

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the Dimopoulos lab to inject dsRNA into Anopheles gambiae mosquitoes, which harbor the malaria parasite. The technique manipulating the injection setup and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

פרוטוקול מבחני RNAi ב למבוגרים יתושים (א gambiae)

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in cell death. The first step in subculturing is to detach cells from the surface of the primary culture vessel by trypsinization or mechanical means. The resultant cell suspension is then subdivided, or reseeded, into fresh cultures. Secondary cultures are checked for growth and fed periodically, and may be subsequently subcultured to produce tertiary cultures. The time between passaging of cells varies with the cell line and depends on the growth rate.

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. This video will demonstrate a procedure for subculturing both adherent and suspension cells.

Trypsinizing ו Subculturing בתאי יונקים

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Bacterial Delivery of RNAi Effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory tool, the RNAi pathway appears to be promising for therapeutic utilization. For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, delivery of RNAi-mediating agents to target cells is one of the major obstacles. A novel strategy to overcome this hurdle is transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria, e.g. Escherichia coli, to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells to induce RNAi. A first-generation tkRNAi-mediating vector, TRIP, contains the bacteriophage T7 promoter for expression regulation of a therapeutic shRNA of interest. Furthermore, TRIP has the Inv locus from Yersinia pseudotuberculosis that encodes invasin, which permits natural noninvasive bacteria to enter &beta;1-integrin-positive mammalian cells and the HlyA gene from Listeria monocytogenes, which produces listeriolysin O. This enzyme allows the therapeutic shRNA to escape from entry vesicles within the cytoplasm of the target cell. TRIP constructs are introduced into a competent non-pathogenic Escherichia coli strain, which encodes T7 RNA polymerase necessary for the T7 promoter-driven synthesis of shRNAs. A well-characterized cancer-associated target molecule for different RNAi strategies is ABCB1 (MDR1/P-glycoprotein, MDR1/P-gp). This ABC-transporter acts as a drug extrusion pump and mediates the "classical" ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) phenotype of human cancer cells which is characterized by a specific cross resistance pattern. Different ABCB1-expressing MDR cancer cells were treated with anti-ABCB1 shRNA expression vector bearing E. coli. This procedure resulted in activation of the RNAi pathways within the cancer cells and a considerable down regulation of the ABCB1 encoding mRNA as well as the corresponding drug extrusion pump. Accordingly, drug accumulation was enhanced in the pristine drug-resistant cancer cells and the MDR phenotype was reversed. By means of this model the data provide the proof-of-concept that tkRNAi is suitable for modulation of cancer-associated factors, e.g. ABCB1, in human cancer cells.

For development of RNA interference (RNAi)-based therapies, a novel strategy was developed, transkingdom RNAi (tkRNAi). This technology uses non-pathogenic bacteria to produce and deliver therapeutic short hairpin RNA (shRNA) into target cells. Here, tkRNAi was successfully applied for reversal of classical ABCB1-mediated multidrug resistance (MDR) of cancer cells.

משלוח חיידקית של RNAi effectors: Transkingdom RNAi

RNA interference (RNAi) represents a high effective mechanism for specific inhibition of mRNA expression. Besides its potential as a powerful laboratory ...

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying potassium (referred to as GIRK) channels, which are important for regulating the excitability of neurons. There are four different mammalian GIRK channel subunits (GIRK1-GIRK4) - we focus on GIRK2 because it forms a homotetramer. Stimulation of different types of G protein-coupled receptors (GPCRs), such as the muscarinic receptor (M2R), leads to activation of GIRK channels. Alcohol also directly activates GIRK channels. We will show how to mutate one amino acid by specifically changing one or more nucleotides in the cDNA for the GIRK channel. This mutated cDNA sequence will be amplified in bacteria, purified, and the presence of the point mutation will be confirmed by DNA sequencing. The cDNAs for the mutated and wild-type GIRK channels will be transfected into human embryonic kidney HEK293T cells cultured in vitro. Lastly, whole-cell patch-clamp electrophysiology will be used to study the macroscopic potassium currents through the ectopically expressed wild-type or mutated GIRK channels. In this experiment, we will examine the effect of a L257W mutation in GIRK2 channels on M2R-dependent and alcohol-dependent activation.

We will demonstrate how to study the effect of a single point mutation on the function of an ion channel.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

MISSION LentiPlex Pooled shRNA Library Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to knockdown gene expression levels in loss of gene function studies.
There are two main methods for performing RNAi. The first is the use of small interfering RNAs (siRNAs) that are chemically synthesized, and the second utilizes short-hairpin RNAs (shRNAs) encoded within plasmids 1. The latter can be transfected into cells directly or packaged into replication incompetent lentiviral particles. The main advantages of using lentiviral shRNAs is the ease of introduction into a wide variety of cell types, their ability to stably integrate into the genome for long term gene knockdown and selection, and their efficacy in conducting high-throughput loss of function screens. To facilitate this we have created the LentiPlex pooled shRNA library.
The MISSION LentiPlex Human shRNA Pooled Library is a genome-wide lentiviral pool produced using a proprietary process. The library consists of over 75,000 shRNA constructs from the TRC collection targeting 15,000+ human genes 2. Each library is tested for shRNA representation before product release to ensure robust library coverage. The library is provided in a ready-to-use lentiviral format at titers of at least 5 x 108 TU/ml via p24 assay and is pre-divided into ten subpools of approximately 8,000 shRNA constructs each. Amplification and sequencing primers are also provided for downstream target identification.
Previous studies established a synergistic antitumor activity of TRAIL when combined with Paclitaxel in A549 cells, a human lung carcinoma cell line 3, 4. In this study we demonstrate the application of a pooled LentiPlex shRNA library to rapidly conduct a positive selection screen for genes involved in the cytotoxicity of A549 cells when exposed to TRAIL and Paclitaxel. One barrier often encountered with high-throughput screens is the cost and difficulty in deconvolution; we also detail a cost-effective polyclonal approach utilizing traditional sequencing.

Here we use a human LentiPlex pooled library and traditional sequencing methods to identify gene targets promoting cell survival. We demonstrate how to set up and deconvolute a LentiPlex screen and validate the results.

LentiPlex המשימה משולב הקרנת shRNA ספריית בתאי יונקים

RNA interference (RNAi) is an intrinsic cellular mechanism for the regulation of gene expression. Harnessing the innate power of this system enables us to ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

ניתוח של עמדת מחזור התא בתאי יונקים

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. The potential throughput of this assay has, however, been limited by the need to individually clone and assay the activity of each sequence on interest using protein fluorescence or enzymatic activity as a proxy for regulatory activity. Advances in high-throughput DNA synthesis and sequencing technologies have recently made it possible to overcome these limitations by multiplexing the construction and interrogation of large libraries of reporter constructs. This protocol describes implementation of a Massively Parallel Reporter Assay (MPRA) that allows direct comparison of hundreds of thousands of putative regulatory sequences in a single cell culture dish.

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory activities. Coupling candidate regulatory elements to reporter genes that carry identifying sequence tags enables massive parallelization of these assays.