מימון הניתן על ידי אריזונה דרום לענייני יוצאי צבא בריאות מערכת VA מענק ההצטיינות סקירה 0142 ואריזונה Biomedical Research הנציבות מענק 0803.

הכנת רקמות כדי לצפות בשקופיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Colonoscope יכול להיות מועבר לתוך המעי הגס דרך פי הטבעת. הקולונוסקופ הוא צינור ארוך כי יש תאורה מצלמת וידאו בראש, היכולת להעביר את האוויר לתוך המעי הגס לפוצץ אותו כמו בלון ארוך כדי לאפשר ויזואליזציה טובה יותר של המעי הגס, יש מעבר מלקחיים ביופסיה שיכול להרחיב מעבר מצלמת וידאו לצבוט את אזור 3-5 מילימטר של &quot;עור&quot; השטח הפנימי או שכבת הרירית של המעי הגס לתת לנו דגימה לביופסיה. מלקחיים לביופסיה יכול לשמש גם כדי להסיר את פוטנציאל פוליפים טרום סרטניים במעי הגס נמצא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השגנו ביופסיות של רקמות נורמלי ברירית המעי הגס של חולים, עם הסכמה מדעת. חולים אלה עוברת קולונוסקופיה ההקרנה במרפאה העיכול. ביופסיות שלנו הונחו בצנצנות פורמלין. לאחר 4 שעות, פורמלין הוחלף באלכוהול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דוגמאות דומות של רקמות שנלקחו תחומי כריתות המעי הגס, הוסרו במהלך הניתוח, שהיו 1 ס&quot;מ ו 10 ס&quot;מ הרחק סרטן המעי הגס או אדנומות עם neoplasia מתקדמים. דגימות אלה רקמות הונחו גם בפורמלין, ואם דגימות רקמה היו גדולים, חלקם נשמרו בפורמלין לתקופה ארוכה לפני שיוצבו באלכוהול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות רקמה נלקחים למעבדה היסטולוגיה להיות מעובד להציב אבני פרפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוקים פרפין הם מצוננים במקרר כדי לגרום להם לחתוך בקלות רבה יותר על ידי microtome. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפים רקמות בעובי 4 מיקרון נחתכים מן בלוקים רקמות, באמצעות microtome, וצף על פני המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשוואה בין הביטוי של שני חלבונים, למשל ERCC1 ו Pms2, קטעי רקמות חלופיות ניתן לאסוף על שתי שקופיות, עד ישנם שלושה חלקים רקמה על כל אחד שתי שקופיות. למשל, סעיפים 1, 3 ו 5 ניתן להציב בשקופית אחד מהם פתקית ERCC1 וסעיפים 2, 4 ו -6 ניתן להציב בשקופית אחד מהם פתקית Pms2. לאחר שלושה חלקים רקמות immunostained עבור חלבון אחד בשקופית אחת יכולה לאפשר לך לראות אם מכתים דפוס יוצא דופן של קריפטה הוא חפץ או אמיתי, שכן הממצאים לא תחזור על עצמה בחלק אחד או יותר של רקמה בשקופית. מאורות קולון כ 60 מיקרון בקוטר, כך על 15 סעיפים רקמות אפשר לחתוך דרך הקריפטה אחד, הקריפטה אותו אפשר לראות על חלקים מרובות לכל רקמה שקופיות. </li></ol> Immunostaining סעיפים רקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השקופיות הן לשים אז בהליך תיוג immunohistochemical. זהו הליך 8 שעות, והוא סטנדרטי למדי. החלקים של ההליך שבו אנו משתמשים, כי הם לא רגילים, הם משתמשים מכולות Sequenza עבור מכתים, ושימוש פתרון להפחתת מכתים הרקע המכונה &quot;צלף&quot;. הפתרון של &quot;צלף&quot; נמכר כנוסחה קניינית על ידי Biocare רפואי, קונקורד CA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלק מן הצעדים של נהלים שלנו מוצגים כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדוגמה, עבור אימונוהיסטוכימיה Pms2, מגלשות הם deparaffinized לראשונה על ידי הצבת ב 3 שינויים של קסילן (3 דקות כל אחד), ואחריו 2 שינויים אתנול 100% (2 דקות כל אחד), ואחריו 2 שינויים אתנול 95% (2 דקות כל אחד), ואחריו 2 שינויים של מים מזוקקים (2 דקות כל אחד). נהלים אלה מתבצעות מתחת למכסה המנוע כימי עם לחץ אוויר שלילי כך הנסיין אינו חשוף האדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר פורמלין שימש בהתחלה כדי לתקן את הרקמה, חלקים של חלבונים במדגם רקמות הפך צולבים. עכשיו אנחנו צריכים לשבור את צולבות קישורים כך נוגדן יכול לזהות את החלבון של עניין. השקופיות ממוקמים פתרון חיץ אשר הביאו לרתיחה במיקרוגל. זה ואחריו 10 דקות על הגדרת בינוני, ואחריו קירור במשך 20 דקות על הקרח. צעד זה צריך להיבדק ומותאמים מיקרוגל שונים, עד תוצאות טובות מושגות. שים לב כי עבור immunostaining CcOI או Ku86 השתמשנו ציטרט הנתרן חיץ עשה עם חומצת לימון 9mL + ציטרט הנתרן 41mL 450mL + H 2 O (חיץ כולל יוני נתרן) אשר pH של כ - 6.0, עבור ERCC1 השתמשנו חיץ ציטראט עשה עם חומצת לימון 2.1g + 1 ליטר H 2 O + ~ סודיום הידרוקסיד 5 מ&quot;ל להביא pH עד 6.1 (חיץ מינימלי עם יוני נתרן מוסף), ועל Pms2 השתמשנו פתרון עשה עם פתרון חשיפת 5 מ&quot;ל Antigen (על ידי וקטור) + 533mL H 2 O. מאגרים שונים יש צורך להגביר את האינטראקציה עם נוגדנים epitopes חלבון מסוים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השקופיות הן לשים אז במשך 20 דקות ואחריו לשטוף במים מזוקקים במשך 3 דקות, לשטוף מלוחים פוספט שנאגרו (נקרא PBS) במשך 5 דקות לתוך מי חמצן 3% (בדילול מלא מתנול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות ממוקמות מכן לתוך שטוח מתלים מכתים צר שנקרא Sequenza (Shandon מערכת Sequenza Immunostaining מן Thermo Scientific) ושטף עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השקופיות להיות immunostained עבור ERCC1 או Pms2 נחשפים מכן 10 דקותאוטי חשיפה טיפול נוסף של 3 טיפות של תמיסת קניינית, המתקבל Biocare, המכונה &quot;הצלף&quot;, אשר פועל כדי להפחית את הלא ספציפית של חלבונים רקע מכתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות הם שטופים עם &quot;TBST&quot; חיץ המהווה 1 מ&quot;ל Tween 10x + 100 מ&quot;ל + טריס 900 מ&quot;ל מים מזוקקים [שם טריס 10x הוא 24.2 גרם Trizma + 80 גרם NaCl + 1,000 מ&quot;ל מים מזוקקים deionized + HCl מרוכז (כ 15 מ&quot;ל) כדי להביא את הפתרון pH 7.6]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות הם שטופים אז שלוש פעמים עם חיץ, ו 100 מיקרוליטר של נוגדן DAKO biotinylated משני בדילול 1:100 (ב 2% אלבומין בסרום שור מורכב במאגר TBST) הוא הוסיף את השקופיות וטופחו במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב זה, Vectastain ABC (Avidin קומפלקס ביוטין) (מתוך וקטור Laboratories) מגיב מוכן, באמצעות 2.5 מ&quot;ל PBS, 1 פתרון ירידה, 1 פתרון B טיפה, והפתרון מותר לעמוד במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגלשות הם שטופים 3 פעמים עם חיץ TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז 3 טיפות של ריאגנט ABC Vectastain הוא הוסיף את השקופיות מודגרת בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות, ואחריו שטיפה 2 פעמים עם TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות שקועים אז כ -5 דקות ב DAB (diamino-benzamide) (2.9 מ&quot;ל DAB + 400 + 250 מיקרוליטר PBS מיקרוליטר מי חמצן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות הם שטופים אז 2 פעמים עם מים מזוקקים deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Counterstaining נעשית בתמיסה מדוללת של hematoxylin למשך 10 שניות. שקופיות הם השטיפה במי ברז מים ואחריו deionized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שקופיות אז הם מיובש 2 פעמים במשך 2 דקות באתנול 95%, פי 2 במשך 2 דקות ב 100% אתנול ו -2 פעמים במשך 2 דקות קסילן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמה טיפות של Cytoseal XYL (ריצ&#39;רד אלן, מדעי) מתווספים אז אל שקופיות coverslip מיושם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערכה immunohistochemical של ERCC1, Ku86 ו CcOI מבוצעות באמצעות פרוטוקול זהה Pms2, אבל להחליף את הנוגדן Pms2 עם נוגדנים ERCC1, Ku86 ו CcOI המתוארים בטבלה שלהלן. </li></ol> הערכת סעיפים רקמה מאורות חסר ביטוי ERCC1, Pms2, Ku86 ו CcOI <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו מבט ראשון על סעיפים הרקמה תחת photomicroscope (DM-BA300) Motic לביטוי של Pms2 ו ERCC1 ב מאורות של רירית המעי הגס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pms2 ו ERCC1 הן אנזימים לתיקון דנ&quot;א, ולכן הם נמצאים במקום בו ה-DNA הוא, הגרעינים של תאים של מאורות. זה מופיע באיור 1, שבו המעי הגס חום המייצג מכתים עבור ERCC1, מתרחשת הגרעינים של תאים בקריפטה. בקריפטה נורמלי אנו מציגים לראשונה המיקרוסקופ היה מוכתם עבור ERCC1, ואת כתם חום מראה את המיקום של ERCC1. אנו מציינים את סוגי התאים מאורות, שם &quot;תאים הגביע&quot; מעוצבים קצת כמו כוס יין, עם גרעינים על אזור קטן בבסיס של תאים בקצה החיצוני של הקריפטה, וכן את סעיף מתנפחת, מלא גרגירים mucin לבן בחלק של התא בצד הפנימי של בקריפטה. שני סוגים של תאים דמיון מסוים בסעיפים מוכתם שלנו, והם enterocytes ותאי enteroendocrine, גרעינים שלהם הם גם בקצה החיצוני של הקריפטה, בבסיס של התאים. ב ביופסיות שנלקחו חולים אשר מעולם לא היה neoplasia הגס, או ביופסיות רחוק מכל אתר של סרטן המעי הגס, כמעט כל הגרעינים של כל מאורות להראות רמה גבוהה נורמלי הביטוי של ERCC1 כפי שמוצג כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לכוון את התצפיות שלנו, קטעי רקמה המתקבל ביופסיות של חולים עם neoplasia אין הגס הם נצפו ברמות הביטוי של Pms2, ERCC1, CcOI או Ku86 בתוך רירית המעי הגס נורמלי. אנחנו יכולים לראות את כל מאורות בסעיף רקמה נורמלית, עם עדשה 40X אובייקטיבי, כפי שאנו לאט לעבור קטע רקמה נקודת כולו את מאורות, התאים ביניים, כל קשריות הלימפה בשקופית, ואת muscularis (אם הוא קיים ב ביופסיה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו כן, אנו מציינים כי יש רק כמה תאים בבסיס בקריפטה אשר בתאי גזע. אלה בתאי גזע ליצור את כל התאים של כ -2,000 בקריפטה להשלים. תא גזע עם מוטציה או epimutation יכול להשתלט על נישה כל תא גזע. ואז הקריפטה כולו עשוי שינו מכתים עבור אנזים עניין (המרה קריפטה) כפי שאנו מראים שקופית חדשה זו שבה אנו רואים את כל לקוי מאורות עבור CcOI ליד מאורות כי יש ביטוי גבוה של CcOI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אז אנחנו שקופיות מחולה סרטן המעי הגס או אדנומה עם neoplasia מתקדמים. בשקופית זו, מאורות מסוימים יש רמה גבוהה הרגיל של הביטוי ERCC1 וכמה יש רמות נמוכות יותר של הביטוי. כל מאורות בתוך קטע רקמה מצולמים ברזולוציה נמוכה עם עדשה 10x אובייקטיבי, ואת התמונות רעפים כך בסעיף הרקמה כולה נראית בתמונה אחת. מאורות ממוספרים אז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאורות עם ביטוי גבוה של האנזים, אופייני מאורות בביופסיות רחוק הלוך ושובמ &#39;כל סרטן, נקראים רמת מכתים &quot;4&quot;. רמות אחרות הן &quot;0&quot; אם אין ביטוי גלוי, &quot;1&quot; אם הביטוי רק לזיהוי בקושי ניכר, &quot;2&quot; אם יש להציג את הביטוי, אבל ברמה הרבה יותר נמוך מאשר הרמה 4, ו - &quot;3&quot; אם הביטוי הוא כיום ברמה נמוכה מ 4, אבל חזק למדי. אנחנו כל נקודה להחליק על כחול תמונה ברזולוציה נמוכה עבור 4, כתום ירוק 3, צהוב 2, 1 ו אדום 0. כאן אנו עוברים להראות קטע מתוך ביופסיה באמצעות עדשה אובייקטיבי 40X. אנחנו נקודה מאורות על התמונה ברזולוציה נמוכה. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. הקריפטה הגס מראה ביטוי גבוה של ERCC1 ב הגרעינים של תאים קריפטה. כל הצבעים בתמונה זו היו משופרים באופן שווה בניגוד ואת הרוויה, בעזרת Paint Shop Pro 5. נציג תוצאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסעיפים רקמות חלופיות בשקופיות נפרדות לאפשר לנו להסתכל מאורות הגס זהה, עם הבעה של שני חלבונים שונים המוצגים על ידי אימונוהיסטוכימיה. התמונה הצבעונית של one הקריפטה עבור Pms2 ואת מוכתם הקריפטה זהה ERCC1 מוצג מיקרוסקופים צמוד עם מסכי מחשב סמוכים. זה מאפשר לנו לקבוע אם יש מחסור משותף עבור שני חלבונים או אם הליקויים בכל חלבונים, בעוד כל שכיחה, מתרחשת באופן עצמאי. יש לנו שלושה סעיפים רקמה לכל שקופית, כך שכל מחסור ניכר ביטוי של חלבון ניתן לאמת כמו להיות לקוי על סעיף אחד או יותר, ולא בגלל חפץ. ב הרקמות הסובבות סרטן המעי הגס, שם היא פגם בתחום והוליד סרטן, יש שכיחות גבוהה של חסר מאורות עבור ERCC1 ו Pms2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמשנו גם אימונוהיסטוכימיה כדי למצוא את התדר של לקוי מאורות עבור Ku86 ו CcOI. בשקופית זו, אנו עוברים סעיף הרקמה כולה immunostained עבור Ku86, באמצעות עדשה אובייקטיבי 40X, ואנחנו יכולים לראות מאורות כמה חסרים עבור Ku86 בסעיף זה רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמו כן, בשקופית זו, אנו עוברים סעיף הרקמה כולה immunostained עבור CcOI, באמצעות עדשה אובייקטיבי 40X, ואנחנו יכולים לראות כי רק מספר מתונה של מאורות חסרים עבור CcOI. </li></ol>

<ol>
	<li>Slaughter, D. P., Southwick, H. W., Smejkal, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+cancerization+in+oral+stratified+squamous+epithelium;+clinical+implications+of+multicentric+origin.">Field cancerization in oral stratified squamous epithelium; clinical implications of multicentric origin.</a> Cancer. 6, 963-968 (1953).</li><li>Vauthey, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+field+cancerisation+in+clinical+oncology.">Importance of field cancerisation in clinical oncology.</a> Lancet Oncol. 1, 15-16 (2000).</li><li>Bernstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+defects+in+progression+to+gastrointestinal+tract+cancers.">Field defects in progression to gastrointestinal tract cancers.</a> Cancer Lett. 260, 1-10 (2008).</li><li>Calabrese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+pretumor+progression+before+and+after+loss+of+DNA+mismatch+repair.">Colorectal pretumor progression before and after loss of DNA mismatch repair.</a> Am J Pathol. 164, 1447-1453 (2004).</li><li>Bernstein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Pms2+expression+in+non-neoplastic+flat+mucosa+from+patients+with+colon+cancer+correlates+with+reduced+apoptosis+competence.">Reduced Pms2 expression in non-neoplastic flat mucosa from patients with colon cancer correlates with reduced apoptosis competence.</a> Appl Immunohistochem Mol Morphol. 14, 166-172 (2006).</li><li>Huang, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+1+is+a+marker+for+normal+and+malignant+human+colonic+stem+cells+(SC)+and+tracks+SC+overpopulation+during+colon+tumorigenesis.">Aldehyde dehydrogenase 1 is a marker for normal and malignant human colonic stem cells (SC) and tracks SC overpopulation during colon tumorigenesis.</a> Cancer Res. 69, 3382-3389 (2009).</li><li>Kim, K. M., Shibata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylation+reveals+a+niche:+stem+cell+succession+in+human+colon+crypts.">Methylation reveals a niche: stem cell succession in human colon crypts.</a> Oncogene. 21, 5441-5449 (2002).</li><li>Greaves, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+DNA+mutations+are+established+in+human+colonic+stem+cells,+and+mutated+clones+expand+by+crypt+fission.">Mitochondrial DNA mutations are established in human colonic stem cells, and mutated clones expand by crypt fission.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 714-719 (2006).</li><li>Nara, K., Nagashima, F., Yasui, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+elevated+ultraviolet-induced+mutation+frequency+in+isolated+Chinese+hamster+cell+lines+defective+in+nucleotide+excision+repair+and+mismatch+repair+proteins.">Highly elevated ultraviolet-induced mutation frequency in isolated Chinese hamster cell lines defective in nucleotide excision repair and mismatch repair proteins.</a> Cancer Res. 61, 50-52 (2001).</li><li>Payne, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deoxycholate+induces+mitochondrial+oxidative+stress+and+activates+NF-kB+through+multiple+mechanisms+in+HCT-116+colon+epithelial+cells.">Deoxycholate induces mitochondrial oxidative stress and activates NF-kB through multiple mechanisms in HCT-116 colon epithelial cells.</a> Carcinogenesis. 28, 215-222 (2007).</li><li>Lim, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+changes+induced+by+reactive+oxygen+species+in+hepatocellular+carcinoma:+methylation+of+the+E-cadherin+promoter.">Epigenetic changes induced by reactive oxygen species in hepatocellular carcinoma: methylation of the E-cadherin promoter.</a> Gastroenterology. 135, 2128-2140 (2008).</li><li>Bernstein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+acids+as+carcinogens+in+human+gastrointestinal+cancers.">Bile acids as carcinogens in human gastrointestinal cancers.</a> Mutat Res. 589, 47-65 (2005).</li><li>Payne, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hydrophobic+bile+acids,+genomic+instability,+Darwinian+selection,+and+colon+carcinogenesis.">hydrophobic bile acids, genomic instability, Darwinian selection, and colon carcinogenesis.</a> Clinical and Experimental Gastroenterology. 1, 19-47 (2008).</li></ol>

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב מאוד לקבל 3 חלקים רקמה לכל שקופית. בועות יכול להתרחש כאשר יישום התקשורת נושאת את הנוגדנים, כך כמה מאורות או חלקים מאורות לא יכול להיות מוכתם כראוי רק בגלל בועה מנעו את הנוגדן מלהגיב עם סעיף הרקמה. מאורות כ 60 מיקרון בקוטר, וחתכים רקמה 4 מיקרון עבה, אז יכול להיות שיש כמה שיותר סעיפים 15 בקריפטה דרך רקמות זהה. זה בדרך כלל ניתן למצוא אותו הקריפטה, באמצעות המורפולוגיה של בקריפטה כמדריך, על סעיפים רקמות מרובים להציב בשקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במחקרים האחרונים שלנו, דגימות רקמה גדול, מכתים ב Sequenza לא יכול לתת כיסוי טוב נוגדנים לרקמה. במקרים אלה, אפשר מעדיפים להשתמש מכתים יד של רקמות, שבה ירידה של מדיה המכילה את הנוגדן הוא הניח יד על מדגם רקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לראות בבירור את מכתים חום מראה ביטוי של החלבון immunostained, ואת מכתים כחול מראה DNA גרעיני על צג המחשב, התוכנה photomicroscope Motic מותאם כדלקמן: רווח 0, 0 אופסט, שפר 0, 255, גמא 1.00, 0, חדות 1, תיקון צבע 7, R, G, B רווח 1.00, ו - R, G, בהירות B 0. ההחלטה מוגדר 1024 x 768, ו - איזון לבן מופעלת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השיטה שלנו יכול לשמש עם כל החלבונים חשב להיות חשובים להתפתחות סרטן המעי הגס, כדי להעריך את התדירות שלהם של מחסור, או אולי overexpression, פגמים בשדה המקיף סרטן המעי הגס או אדנומות עם neoplasia מתקדמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פגמים שדה הם חלק התקדמות סרטן &quot;Cancerization בשדה&quot; המונח היה בשימוש לראשונה על ידי סלוטר et al. 1 בשנת 1953 כדי לתאר את האזור או &quot;שדה&quot; של האפיתל כי כבר preconditioned ידי תהליכים ידועים ברובם (באותה עת) כדי להשפיע אותו לכיוון התפתחות סרטן. השימוש הראשוני היה בהקשר של סרטן הפה. מאז, המונחים &quot;cancerization השדה&quot; לבין &quot;פגם בשדה&quot; נעשה שימוש נרחב יותר כדי לתאר את כל רקמה טרום ממאירה שבו סרטן חדשים נוטים יותר להתעורר, ומושג cancerization שדה לאונקולוגיה קלינית קיבל תשומת לב הולכת וגוברת 2 . אנחנו לאחרונה סקר את הראיות ליקויים בתחום סרטן במערכת העיכול 3. כלול בסקירה זו היו תוצאות של עשרות מחקרים לספק ראיות של ליקויים בתחום במעי הגס. פגמים שדה רירית המעי הגס נובעים כנראה על ידי הברירה הטבעית של תאים מוטנטים או תאים שינו epigenetically בין בתאי גזע של הקריפטה כזה שאף אחד בתאי גזע שורד ברצף 4 נישה. חוסר יציבות גנטית או הפנוטיפ המוטטורי, אולי בשל ירידה של תיקון דנ&quot;א נוקלאוטיד כריתה או אי התאמה לתקן דנ&quot;א, יאיץ את התהליך הזה (וגם פגם תכופים Pms2 דווחה בעבר והסביבה סרטן המעי הגס 5). אם, באוכלוסייה הרגילה של בתאי גזע רירית המעי הגס, תא רוכש יתרון סלקטיבי באמצעות מוטציה או epimutation, זה יהיה נוטים להרחיב clonally על חשבון בתאי גזע השכנות. בשנת רירית המעי הגס, הגומחה תא גזע היא נכבשה על ידי ≤ 5 6 תאים אשר לאחר מכן להצמיח כל (כ -2,000) של התאים בקריפטה. השתלטות של הגומחה תא גזע לפי סוג תוצאות מוטציה או שינו epigenetically תא &quot;המרה קריפטה&quot; 7. התפשטות שיבוטים מוטציה (מאורות המרה) באפיתל המעי הגס עשויים להתרחש בדרך כלל על ידי ביקוע הקריפטה 8. דוגמה של ביקוע הקריפטה מוצג באיור 2. בדרך זו פיסת רקמה נורמלית עולה. במסגרת תיקון כזה, מוטציה נוסף מסוג זה עלולה להתרחש כך הקריפטה נתון רוכש יתרון לעומת מאורות אחרים בתוך התיקון, ואת קריפטה זו תרחיב clonally ויצרו כתם משנית בתוך המדבקה המקורית. במסגרת תיקון זה חדש, התהליך ניתן לחזור עוד כמה זמן, אולי במשך עשרות שנים, עד תא גזע ממאירים אשר עולה clonally מתרחב לתוך סרטן. אם זה התהליך הכללי שבו אדנוקרצינומות הגס ספורדיים להתעורר, אז אדנוקרצינומות הגס בדרך כלל צריך להיות קשור, להיות קדמו, שדות של נורמליות. לכן חלקת מאורות המרה עשויה להיות צפויה להיות לגילוי פגמים באזור שמסביב אדנומה עם neoplasia מתקדמים, או סביב סרטן המעי הגס. מתוך מודל זה של התקדמות טרום סרטניים, ניתן היה לצפות למצוא שינויים גנטיים או epigenetic הקשורים התקדמות טרום סרטניים בקרב דגימות רקמה שנלקחו רירית שאינם neoplastic הגס באזורים שמסביב נגעים neoplastic של המעי הגס העלולים להתפתח לסרטן . בפרט, פגמים אנזימי תיקון דנ&quot;א או חלבונים הנחוצים אפופטוזיס, יתרום להתקדמות על ידי שיפור יציבות גנומית, והוא עשוי להיות צפוי להימצא בשדה פגום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירה עבור חסר Pms2 כאשר התאים דeficient עבור ERCC1 ו נתון סוכן ה-DNA נזק נארה et al. 9 25 גדל תרבויות של תאים בשחלה סינית אוגר 43-3B, כל עם מוטציה inactivating תיקון דנ&quot;א גן ERCC1, והתייחסו התרבויות עם סוכן ה-DNA נזק, MNNG. בין התאים ששרדו את הטיפול נזק לדנ&quot;א, תא בודד היה מבודד מן התרבות כל ואיפשר להקים שיבוט. כל שיבוטים מבודד היו בערך פי 10 יותר בפני הרג ידי MNNG מאשר המתח ההורים. מתוך שיבוטים מבודדים, 22 הוכחו להיות פגום אי התאמה לתקן דנ&quot;א (MMR). חמישה אלה 22 שיבוטים נבדקו על ידי רצף, ושלושה מתוך חמשת היו חסרים עבור Pms2. זו הבחירה פגם Pms2 היה כנראה משום Pms2 מחסור שנגרם התנגדות אפופטוזיס, ולכן היכולת לשרוד את הנזק לדנ&quot;א הוסיף שנותרו תאים כאשר ERCC1 נעדר. (בדרך כלל, Pms2 החושים נזק לדנ&quot;א רמות, וגורמת לתאים לעבור אפופטוזיס כאשר נזק לדנ&quot;א הוא מוגזם.) לכן, מחסור ב Pms2 נבחרה כאשר ERCC1 מחסר תאים חשופים נזק לדנ&quot;א. המשובטים פגום בשני ERCC1 ו Pms2 היו הראו על קצב 500-1000 פי מוטציה יותר כאשר מוקרן עם UV מאשר תאים ההורים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חומצות מרה לגרום סטרס חמצוני, הם סוכני ה-DNA פוגע חשובים להתפתחות סרטן המעי הגס חומצה Deoxycholic, חומצות מרה, מגביר את הלחץ החמצוני דרך דור של מינים חמצן מגיב (ROS) על ידי תהליכים רבים, כולל פגיעה של 10 המיטוכונדריה. יש עדויות האחרונות ROS לגרום לשינויים epigenetic 11, ולפחות 15 מחקרים הראו כי חומצות מרה, על ריכוזי מוגבר המלווה דיאטה שומן גבוהה, לגרום נזק לדנ&quot;א 12. הנסקרת כפי ברנשטיין et al. 12, קיים קשר חיובי בין צריכת שומן וסרטן שכיחות סרטן המעי הגס. חומצות מרה מופרשים לתוך המעי בתגובה השומן בתזונה, וחומצות מרה לשמש דטרגנטים כדי לסייע בעיכול השומן. לכן, דיאטה שומן גבוהה קשורה הפרשה מוגברת חומצות מרה. צואה ריכוזי חומצת מרה גבוהות באוכלוסיות עם שכיחות גבוהה של סרטן המעי הגס, חשיפה מוגזמת חומצות מרה נחשב כגורם הסיכון העיקרי עבור סרטן המעי הגס 13. חומצות מרה יכול להיות הגורם מומים שדה המעי הגס. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. Fissioning הקריפטה הגס תוך 3 מאורות. מסקנה מצאנו שכיחות גבוהה של מאורות חסר לתקן גנים DNA ERCC1 ו Pms2 (Pms2 נדרש גם עבור אפופטוזיס) פגמים בשדה גדול סביב סרטן המעי הגס. ליקויים ERCC1 ו Pms2 (עקב שינויים או מוטציות epigenetic) עשוי להיות צעדים בתחילת חוסר היציבות הגנטית מרכזי להתפתחות סרטן המעי הגס.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>PMS2 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>556415</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ERCC1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Fisher</td>
<td>MS-671-P1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ku86 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotech.</td>
<td>SC-9034</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CcO1 antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>459600</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Biotinylated secondary</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DAKO</td>
<td>E0413</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>22% BSA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Informagen, Inc.</td>
<td>2327</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sniper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biocare Medical</td>
<td>BS966</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectastain ABC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Labs</td>
<td>PK-6100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DAB</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>34001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tween 20</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>USB</td>
<td>20605</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cytoseal XYL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>48212-196</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Trizma</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T1503</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

deficient pms2, ercc1, ku86, ccoi in field defects during progression to colon cancer

בשנת סרטן, &quot;פגם בשדה&quot; הוא מוכר קלינית בגלל הנטייה הגבוהה של ניצולי סרטן מסוימים לפתח ממאירות אחרות של סוג רקמה זאת, לעתים קרובות במיקום סמוך. ליקויים בתחום כזה כבר המצוין סרטן המעי הגס. ליקויים המולקולריים האחראים פגם שדה במעי הגס ניתן יהיה לקלוט בתדר גבוה ברקמה נורמלית בהיסטולוגיה סביב אדנוקרצינומה של המעי הגס או סביב אדנומה עם neoplasia מתקדמים (גם בדרך סרטן המעי הגס), אך בתדירות נמוכה בתוך רירית המעי הגס מחולים ללא neoplasia הגס. בעזרת אימונוהיסטוכימיה, מאורות כולו בתוך 10 ס&quot;מ בכל צד של אדנוקרצינומות הגס או neoplasias הגס המתקדם נמצאו להיות מופחת או נעדר תכופות בביטוי לשני לתקן דנ&quot;א וחלבונים, Pms2 ו / או ERCC1. Pms2 הוא חלבון תפקיד כפול, פעיל אי התאמה לתקן דנ&quot;א, כמו גם הצורך אפופטוזיס של תאים עם נזק לדנ&quot;א עודף. ERCC1 פעיל תיקון כריתה נוקלאוטיד דנ&quot;א. הביטוי מופחת או חסר של שני ERCC1 ו Pms2 היה ליצור תאים בעלי יכולת מוגברת הן כדי לשרוד (התנגדות אפופטוזיס) וכן רמה מוגברת של הניוון. הביטוי מופחת או חסר של שני ERCC1 ו Pms2 צפוי צעד מוקדם להתפתחות סרטן המעי הגס. גן ה-DNA לתקן Ku86 (פעיל ב-DNA שאינם הומולוגיים סוף להצטרף) ו למקטע ציטוכרום c אוקסידאז אני (מעורב אפופטוזיס) היו כל דיווחים להיות ירידה בביטוי באזורים הרירית קרוב סרטן המעי הגס. עם זאת, ההערכה immunohistochemical של רמות הביטוי שלהם הראו נמוך רק תדרים צנוע של מאורות להיות חסר הביטוי שלהם פגם שדה המקיף לסרטן המעי הגס או סביב neoplasia הגס המתקדם. אנחנו מראים כאן, השיטה שלנו ההערכה של מאורות לביטוי של ERCC1, Pms2, Ku86 ו CcOI. אנו מראים כי השכיחות של כל לקוי מאורות עבור Pms2 ו ERCC1 לעיתים קרובות גדול כמו 70% עד 95% ב 20 ס&quot;מ אזורים ארוך סביב neoplasia הגס, בעוד תדר של מאורות חסר Ku86 יש ערך החציון של 2% ותדירות מאורות חסר CcOI יש ערך חציון של 16% באזורים אלה. המעי הגס כולו הוא 150 ס&quot;מ (בערך 5 מטר) ויש לו כ -10 מיליון מאורות בשכבה הרירית שלה. פגם Pms2 ו ERCC1 סביב סרטן המעי הגס ובכך עשויים לכלול 1,000,000 מאורות. זה מן הקריפטה פגום כי סרטן המעי הגס עולה.

Watch this Scientific Journal Video about Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer at JoVE.com

Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

ביטוי מופחת / נעדרים של Pms2 ו / או ERCC1 ב מאורות כולו הוא אירוע שכיח בטווח של 10 ס&quot;מ בכל צד של אדנוקרצינומות הגס, סביר להניח בסיס פגם שדה עם הניוון גבוה להתפתחות סרטן. מחסור Ku86 או CcOI הרבה פחות תכופים פגמים אלה בשדה.

Pms2 לקוי, ERCC1, Ku86, CcOI ב פגמים שדה במהלך התקדמות סרטן המעי הגס

In carcinogenesis, the "field defect" is recognized clinically because of the high propensity of survivors of certain cancers to develop other ...

deficient-pms2-ercc1-ku86-ccoi-field-defects-during-progression-to

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Views.  University of Arizona, Tucson. ביטוי מופחת / נעדרים של Pms2 ו / או ERCC1 ב מאורות כולו הוא אירוע שכיח בטווח של 10 ס"מ בכל צד של אדנוקרצינומות הגס, סביר להניח בסיס פגם שדה עם הניוון גבוה להתפתחות סרטן. מחסור Ku86 או CcOI הרבה פחות תכופים פגמים אלה בשדה.

Video: Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

Implantation of Ferumoxides Labeled Human Mesenchymal Stem Cells in Cartilage Defects

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and functional tissue. Matrix associated stem cell implants (MASI) aim to regenerate cartilage defects due to arthritic or traumatic joint injuries. Adult mesenchymal stem cells (MSCs) have the ability to differentiate into cells of the chondrogenic lineage and have shown promising results for cell-based articular cartilage repair technologies. Autologous MSCs can be isolated from a variety of tissues, can be expanded in cell cultures without losing their differentiation potential, and have demonstrated chondrogenic differentiation in vitro and in vivo1, 2.
In order to provide local retention and viability of transplanted MSCs in cartilage defects, a scaffold is needed, which also supports subsequent differentiation and proliferation. The architecture of the scaffold guides tissue formation and permits the extracellular matrix, produced by the stem cells, to expand. Previous investigations have shown that a 2% agarose scaffold may support the development of stable hyaline cartilage and does not induce immune responses3.
Long term retention of transplanted stem cells in MASI is critical for cartilage regeneration. Labeling of MSCs with iron oxide nanoparticles allows for long-term in vivo tracking with non-invasive MR imaging techniques4.
This presentation will demonstrate techniques for labeling MSCs with iron oxide nanoparticles, the generation of cell-agarose constructs and implantation of these constructs into cartilage defects. The labeled constructs can be tracked non-invasively with MR-Imaging.

Goal of the presentation is to demonstrate a highly reproducible method to generate matrix associated stem cell implants in cartilage defects, which can be visualized with MR imaging. Stem cells are labeled with FDA-approved Ferumoxides, mixed with agarose, implanted into cartilage defects and imaged with a 7T MR scanner.

השרשה של Ferumoxides תווית אדם בתאי גזע mesenchymal ב פגמים סחוס

The field of tissue engineering integrates the principles of engineering, cell biology and medicine towards the regeneration of specific cells and ...

Determining the Contribution of the Energy Systems During Exercise

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given physical activity. Although some sports are relatively easy to be reproduced in a laboratory (e.g., running and cycling), a number of sports are much more difficult to be reproduced and studied in controlled situations. This method presents how to assess the differential contribution of the energy systems in sports that are difficult to mimic in controlled laboratory conditions. The concepts shown here can be adapted to virtually any sport.
The following physiologic variables will be needed: rest oxygen consumption, exercise oxygen consumption, post-exercise oxygen consumption, rest plasma lactate concentration and post-exercise plasma peak lactate. To calculate the contribution of the aerobic metabolism, you will need the oxygen consumption at rest and during the exercise. By using the trapezoidal method, calculate the area under the curve of oxygen consumption during exercise, subtracting the area corresponding to the rest oxygen consumption. To calculate the contribution of the alactic anaerobic metabolism, the post-exercise oxygen consumption curve has to be adjusted to a mono or a bi-exponential model (chosen by the one that best fits). Then, use the terms of the fitted equation to calculate anaerobic alactic metabolism, as follows: ATP-CP metabolism = A1 (mL . s-1) x t1 (s). Finally, to calculate the contribution of the lactic anaerobic system, multiply peak plasma lactate by 3 and by the athlete&#x2019;s body mass (the result in mL is then converted to L and into kJ).
The method can be used for both continuous and intermittent exercise. This is a very interesting approach as it can be adapted to exercises and sports that are difficult to be mimicked in controlled environments. Also, this is the only available method capable of distinguishing the contribution of three different energy systems. Thus, the method allows the study of sports with great similarity to real situations, providing desirable ecological validity to the study.

This protocol allows researchers focused on exercise and sports sciences to determine the relative contribution of three different energy systems to the total energy expenditure during a large variety of exercises.

לקבוע את התרומה של מערכות אנרגיה במהלך פעילות גופנית

One of the most important aspects of the metabolic demand is the relative contribution of the energy systems to the total energy required for a given ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

ניתוח גנטי מהיר של איתות אפיתל-mesenchymal במהלך התחדשות שיער

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

חי הדמיה של חיסול תאים אפופטוטיים במהלך<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עובר

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional measures of muscle health. In this video article, we demonstrate a method to measure force generation during contraction of zebrafish larval trunk muscle. Force measurements are accomplished by placing an anesthetized larva into a chamber filled with a salt solution. The anterior end of the larva is tied to a force transducer and the posterior end of the larva is tied to a length controller. An isometric twitch contraction is elicited by electric field stimulation and the force response is recorded for analysis. Force generation during contraction provides a measure of overall muscle health and specifically provides a measure of muscle function. Although we describe this technique for use with wild-type larvae, this method can be used with genetically modified larvae or with larvae treated with drugs or toxicants, to characterize muscle disease models and evaluate treatments, or to study muscle development, injury, or chemical toxicity.

Force measurements can be used to demonstrate changes in muscle function due to development, injury, disease, treatment or chemical toxicity. In this video, we demonstrate a method to measure force during a maximal contraction of zebrafish larval trunk muscle.

מדידת כוח במהלך התכווצות כדי להעריך את תפקוד שריר בזחלי דג הזברה

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

בידוד של ראשוני myofibroblasts מעכבר ורקמות מעי גס אנושיים

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Detection of Alternative Splicing During Epithelial-Mesenchymal Transition

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various physiological and pathological processes. Here we describe a strategy to detect alternative splicing during EMT using an inducible EMT model by expressing the transcription repressor Twist. EMT is monitored by changes in cell morphology, loss of E-cadherin localization at cell-cell junctions, and the switched expression of EMT markers, such as loss of epithelial markers E-cadherin and &#947;-catenin and gain of mesenchymal markers N-cadherin and vimentin. Using isoform-specific primer sets, the alternative splicing of interested mRNAs are analyzed by quantitative RT-PCR. The production of corresponding protein isoforms is validated by immunoblotting assays. The method of detecting splice isoforms described here is also suitable for the study of alternative splicing in other biological processes.

Alternative splicing regulation has been shown to contribute to the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program in various physiological and pathological processes. Here we describe a method utilizing an inducible EMT model for the detection of alternative splicing during EMT.

איתור של אלטרנטיבי שחבור במהלך המעבר אפיתל- mesenchymal

Alternative splicing plays a critical role in the epithelial-mesenchymal transition (EMT), an essential cellular program that occurs in various ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell synchronization can be difficult for many cell systems. Standard practice is to block cell cycle progression at a specific stage and then release the accumulated cells producing a wave of cells progressing through the cycle in unison. However, some cell types find this block toxic resulting in abnormal cell cycling, or even mass death. Bromodeoxyuridine (BrdU) uptake can be used to track the cell cycle stage of individual cells. Cells incorporate this synthetic thymidine analog, while synthesizing new DNA during S phase. By providing BrdU for a brief period it is possible to mark a pool of cells that were in S phase while the BrdU was present. These cells can then be tracked through the remainder of the cell cycle and into the next round of replication, permitting the duration of the cell cycle phases to be determined without the need to induce a potentially toxic cell cycle block. It is also possible to determine and correlate the expression of both internal and external proteins during subsequent stages of the cell cycle. These can be used to further refine the assignment of cell cycle stage or assess effects on other cellular functions such as checkpoint activation or cell death.

This protocol describes the use of bromodeoxyuridine (BrdU) uptake to permit the temporal tracking of cells that were in S phase at a specific point in time. Addition of DNA dyes and antibody labeling facilitates detailed analysis of the fate of the S phase cells at later times.

מעקב זמני של התקדמות תא מחזור שימוש cytometry הזרימה ללא הצורך בסנכרון

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented (CDE) Diet Model of Chronic Liver Injury

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual inflammation, progressive destruction and regeneration of the hepatic parenchyma, liver progenitor cell proliferation, and fibrosis. The end-stage of every chronic liver disease is cirrhosis, a major risk factor for the development of hepatocellular carcinoma. To study processes regulating disease initiation, establishment, and progression, several animal models are used in laboratories. Here we describe a six-week time course of the choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) mouse model, which involves feeding six-week old male C57BL/6J mice with choline-deficient chow and 0.15% DL-ethionine-supplemented drinking water. Monitoring of animal health and a typical body weight loss curve are explained. The protocol demonstrates the gross examination of a CDE-treated liver and blood collection by cardiac puncture for subsequent serum analyses. Next, the liver perfusion technique and collection of different hepatic lobes for standard evaluations are shown, including liver histology assessments by hematoxylin and eosin or Sirius Red stainings, immunofluorescent detection of hepatic cell populations as well as transcriptome profiling of the liver microenvironment. This mouse model is suitable for studying inflammatory, fibrogenic, and liver progenitor cell dynamics induced through chronic liver disease and can be used to test potential therapeutic agents that may modulate these processes.

The Murine Choline-Deficient, Ethionine-Supplemented CDE Diet Model of Chronic Liver Injury

Here we describe a common method to induce chronic liver injury in mice by feeding of a choline-deficient and ethionine-supplemented (CDE) diet. We demonstrate health monitoring, liver perfusion, isolation, and preservation. A time course of six weeks can inform about liver injury, pathohistology, fibrosis, inflammatory, and liver progenitor cell responses.

מאתר כולין לקויה, בתוספת Ethionine (CDE) דיאטה מודל של פגיעה כרונית בכבד

Chronic liver diseases, such as viral hepatitis, alcoholic liver disease, or non-alcoholic fatty liver disease, are characterized by continual ...

Assessing Urinary Tract Junction Obstruction Defects by Methylene Blue Dye Injection

Urinary tract junction obstruction defects are congenital anomalies inducing hydronephrosis and hydroureter. Murine urinary tract junction obstruction defects can be assessed by tracking methylene blue dye flow within the urinary system. Methylene blue dye is injected into the renal pelvis of perinatal embryonic kidneys and dye flow is monitored from the renal pelvis of the kidney through the ureter and into the bladder lumen after applying hydrostatic pressure. Dye accumulation will be evident in the bladder lumen of the normal perinatal urinary tract, but will be constrained between the renal pelvis and the end point of an abnormal ureter, if urinary tract obstructions occur. This method facilitates the confirmation of urinary tract junction obstructions and visualization of hydronephrosis and hydroureter. This manuscript describes a protocol for methylene blue dye injection into the renal pelvis to confirm urinary tract junction obstructions.

Methylene blue dye injection into the renal pelvis facilitates the assessment of urinary tract junction obstruction defects during mouse embryonic urinary tract development. Here, a protocol for methylene blue dye injection into the renal pelvis is described.

הערכת בדרכי השתן צומת פגמים חסימה על ידי הזרקת מתילן כחול צבע

Urinary tract junction obstruction defects are congenital anomalies inducing hydronephrosis and hydroureter. Murine urinary tract junction obstruction ...