עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לבריאות גרנט 5KO8DK085136-02 לJY.

1. השג רקמות מעי גס עכבר פרוטוקול לביצוע ניסויים בבעלי חיים, המפרט את הרציונל ומטרות של המחקר, הוגש ואושר על ידי המשרד המוסדי שלנו של בעלי החיים פיקוח מחקר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את העכבר עם isoflurane בשאיפה אחריו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע חתך קו האמצע הגחון, לחזור בו המעי הדק משם ולזהות את המעי הגס. לחזור בו שלפוחית ​​השתן ורחם (אם קיימים) רוחבי ולזהות את עצם הערווה ולחתוך אותו עם מספריים עדינים לחשוף את פי הטבעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את לפדר הגב של פי הטבעת משל המעי הגס ולגייס את מעי גס מפי הטבעת לcecum, ותחצה אותו לנתק את המעי הגס מהמעי הדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הדגימה בופר פוספט קר כקרח (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאי מזרק 10 מיליליטר עם PBS קר כקרח ולשטוף את מעי גס לומן מספר פעמים כדי לנקות את התוכן שלה, ולאחר מכן לחתוך את אופ המעי הגסn אורך חכם באמצעות מספריים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המעי הגס בצינור חרוטי 50 מיליליטר מכיל 20 מיליליטר של PBS קר כקרח. המעי הגס אינו חייב להיות ממוקם בכל אורינטציה מסוימת. לשטוף את המעי הגס על ידי החלפת PBS עד שהנוזל הוא ברור ללא חומר חלקיקים. </li></ol> אנושי פרוטוקול להשיג רקמה אנושית מחולים כירורגי, המפרט את החשיבות של השגת רקמה זו, כמו גם הערכה של סיכונים ויתרונות פוטנציאליים, הוגש ואושר על ידי המשרד המוסדי תכנית אדם הגנת המחקר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיתוף פעולה מחקרי עם מנתח מעי גס הוא הכרחי כדי להיות מסוגל להשיג רקמה אנושית למחקר שלך. פרוטוקול להשיג רקמת מעי גס אנושית יש להגיש ואושר על ידי דירקטוריון הסקירה המוסדי שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתב הסכמה מהדעת מתקבלת מהמטופל לפני ההליך כירורגי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המנתח יבצע כריתת מעי גס בדוכןאופנה ארד. ברגע שהמעי הגס הוסר מהמטופל, הדגימה נלקחת מייד לפתולוגיה. 0.5 בסעיף בעובי מלא של קיר מעי גס אין צורך להערכה פתולוגית מסופק וממוקמים באופן מיידי על PBS קר כקרח. דגימה זו לא צריכה לכלול את לפדר המעי הגס, ונספחי חלקי איטום יש להסירם, כמו גם, שכן הנוכחות של שומן תשפיע על תהליך העיכול. </li></ol> 2. לחשוף תאי אפיתל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המעי הגס כולו עכבר ב25 מיליליטר של 5 מ&quot;מ EDTA בHBSS (טמפרטורת חדר) בצינור חרוטי 50 מיליליטר. מניחים את צינור חרוטי באמבט 37 מעלות צלזיוס רועדות אוויר (250 סל&quot;ד) במשך 15 דקות. , לאחר 15 דקות יוצקים בזהירות את הנוזל ולמלא את הצינור עם 25 מיליליטר של 5 מ&quot;מ EDTA, חזור עבור סכום כולל של 5 שטיפות. למעי גס אנושי, לאחר קבלת רצועת סנטימטר וחצי מקיר מעי גס מפתולוג לחתוך את המעי הגס במספריים לארבעה חלקים שווים בגודלם. הנח שתי החתיכות לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר אחד, והנח את שתי החתיכות של רקמת מעי גס שנותרו לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר נפרד. ואז דגירה עם 25 מיליליטר של 5 מ&quot;מ EDTA בHBSS ולבצע שטיפות, כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את מעי גס פעמיים ב20 מיליליטר של PBS קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את רקמת מעי גס עכבר בצינור חרוטי 50 מיליליטר חדש המכיל 20 מיליליטר של RPMI-5, 10 U של dispase, ו -2,000 U של collagenase D (בטמפרטורת חדר). לרקמת המעי הגס האנושית, השתמש בכמות כפולה של dispase וcollagenase (20 dispase U, 4,000 ד collagenase U). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור באמבטית אוויר 37 C ° רועד בכיוון אנכי (אם בצורה אופקית, יש אוורור יותר מדי ונזק לתאים). לנער ב250 סל&quot;ד עד 60 דקות. לאחר החשיפה לdispase וcollagenase D, רקמת המעי הגס תתחיל לעכל ורקמת המעי הגס תתחיל נראית קשה. זה בדרך כלל לוקח סביב 30 דקות. כאשר המעי יש מראה זה, להסיר את המעי הגס מהאנזימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shake צינור אחד למעלה ולמטה 2-4 פעמים כדי לשבור את הרקמה. Pellet הרקמה ב XG 200 בצנטריפוגה שולחן (4 מעלות צלזיוס) במשך 5 דקות. יוצק בזהירות את supernatant וזורק. </li></ol> 3. בידוד Myofibroblast ותרבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל גלולה על ידי הוספת 10 חיץ מיליליטר ACK תמוגה (47 מעלות צלזיוס). צנטריפוגה שוב XG 200 במשך 5 דקות (4 מעלות צלזיוס), יוצקת את וזורקים supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל גלולה על ידי הוספת 10 מיליליטר RPMI-5 עם טפטפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר מחצית מהשעית התא (5 מיליליטר) דרך מסננת רשת 70 מיקרומטר באמצעות פיפטה 10 מיליליטר לתוך צלחת שטופלה TC 100 מ&quot;מ. לאחר מכן להוסיף 15 מיליליטר נוסף של RPMI-5. חזור עם 5 מיליליטר הנותר של השעיה תא לתוך צלחת שטופלה TC 100 מ&quot;מ שונה. מעי גס עכבר אחד ולכן יניבו שתי מנות שטופלה TC 100 מ&quot;מ. רצועה אחת וחצי סנטימטר של רקמת מעי גס אנושית תניב בסך הכל ארבע מנות שטופלה TC 100 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הכלים בתרבית רקמה ב10% CO 2 באינקובטור ב 37 ° C. תנאי התרבות הם אותו Fאו עכבר ותאים ראשוניים של אדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי 3 שעות, לשטוף בעדינות את תאים שאינם חסיד עם שני שינויים של HBSS. צף הפסולת צריך לשטוף בעדינות. תאים חסיד מורכבים של תאים, מקרופאגים וmyofibroblasts אפיתל. שבוע לאחר זריעה, רק myofibroblasts פער, מקרופאגים ותאי האפיתל להזדקן לאחר המעבר הראשון. להוסיף RPMI-5 טריים ולגדל את התאים בתרבית תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי passaged ידי trypsinization למשך 5 דקות ומפוצלות 2:1. </li></ol> סימני קצור HBSS: תמיסת מלח מאוזנת של האנק; RPMI-5: תקשורת רוזוול הפארק ממוריאל מכון; ACK: אמוניום כלוריד-אשלגן-; FCS: עגל בסרום עוברי; טופלו TC: תרבית רקמה שטופל פתרונות מאגר תמוגה ACK - (4.15 גרם NH 4 Cl, 0.5 גרם KHCO 3, 18.6 מ&quot;ג Na 2 EDTA, 400 מיליליטר H 2 O, כדי להתאים את pH 7.2-7.4 עם 1 N HCl). steriliz סינוןדואר דרך מסנן 0.2 מיקרומטר ולאחסן ב 4 ° C. RPMI-5 - (כדי להפוך 500 מיליליטר: 454.5 מיליליטר RPMI, FCS 25 מיליליטר, 5 מיליליטר 200 L-גלוטמין מ&quot;מ, 5 מיליליטר 1 M HEPES, pH 7.4, 5 מיליליטר 100 פירובט נתרן מ&quot;מ, 5 מיליליטר 100x עט סטרפטוקוקוס, 500 מיליליטר 50 מ&quot;מ B-ME PBS).

<ol>
	<li>Armaka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+cell+targeting+by+TNF+as+a+common+pathogenic+principle+in+chronic+inflammatory+joint+and+intestinal+diseases.">Mesenchymal cell targeting by TNF as a common pathogenic principle in chronic inflammatory joint and intestinal diseases.</a> J. Exp. Med. 205, 331-337 (2008).</li><li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+cells+important+in+health+and+disease.">Paracrine cells important in health and disease.</a> Am. J. Physiol. 277, C1-C9 (1999).</li><li>Yoo, J., Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D1+mediates+synergistic+MMP-3+expression+induced+by+TNF-alpha+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts.">Protein kinase D1 mediates synergistic MMP-3 expression induced by TNF-alpha and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 30-35 (2011).</li><li>Yoo, J., Chung, C., Slice, L., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+D+mediates+synergistic+expression+of+COX-2+induced+by+TNF-{alpha}+and+bradykinin+in+human+colonic+myofibroblasts.">Protein kinase D mediates synergistic expression of COX-2 induced by TNF-{alpha} and bradykinin in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C1576-C1587 (2009).</li><li>Valentich, J. D., Popov, V., Saada, J. I., Powell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+of+an+intestinal+subepithelial+myofibroblast+cell+line.">Phenotypic characterization of an intestinal subepithelial myofibroblast cell line.</a> Am. J. Physiol. 272, C1513-C1524 (1997).</li><li>Rodriguez Perez, C. E., Nie, W., Sinnett-Smith, J., Rozengurt, E., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+potentiates+lysophosphatidic+acid-induced+COX-2+expression+via+PKD+in+human+colonic+myofibroblasts.">TNF-alpha potentiates lysophosphatidic acid-induced COX-2 expression via PKD in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 300, G637-G646 (2011).</li><li>Yoo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF-alpha+induces+upregulation+of+EGFR+expression+and+signaling+in+human+colonic+myofibroblasts.">TNF-alpha induces upregulation of EGFR expression and signaling in human colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 302, G805-G814 (2012).</li><li>Mahida, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+human+colonic+subepithelial+myofibroblasts+express+extracellular+matrix+proteins+and+cyclooxygenase-1+and+-2.">Adult human colonic subepithelial myofibroblasts express extracellular matrix proteins and cyclooxygenase-1 and -2.</a> Am. J. Physiol. 273, G1341-G1348 (1997).</li><li>De Wever, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Priming+and+potentiation+of+DNA+damage+response+by+fibronectin+in+human+colon+cancer+cells+and+tumor-derived+myofibroblasts.">Priming and potentiation of DNA damage response by fibronectin in human colon cancer cells and tumor-derived myofibroblasts.</a> Int. J. Oncol. 39, 393-400 (2011).</li><li>Edwards, R. A., Smock, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+arachidonate+release+and+PGE2+production+in+Gi+alpha2-deficient+intestinal+and+colonic+subepithelial+myofibroblasts.">Defective arachidonate release and PGE2 production in Gi alpha2-deficient intestinal and colonic subepithelial myofibroblasts.</a> Inflamm. Bowel Dis. 12, 153-165 (2006).</li><li>Hoang, B., Trinh, A., Birnbaumer, L., Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+MAPK-+and+PGE2-dependent+IL-11+production+in+Gialpha2-/-+colonic+myofibroblasts.">Decreased MAPK- and PGE2-dependent IL-11 production in Gialpha2-/- colonic myofibroblasts.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 292, G1511-G1519 (2007).</li><li>Li, Z. B., Kollias, H. D., Wagner, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myostatin+directly+regulates+skeletal+muscle+fibrosis.">Myostatin directly regulates skeletal muscle fibrosis.</a> J. Biol. Chem. 283, 19371-19378 (2008).</li><li>Saada, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subepithelial+myofibroblasts+are+novel+nonprofessional+APCs+in+the+human+colonic+mucosa.">Subepithelial myofibroblasts are novel nonprofessional APCs in the human colonic mucosa.</a> J. Immunol. 177, 5968-5979 (2006).</li><li>Lahar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+subepithelial+myofibroblasts+support+in+vitro+and+in+vivo+growth+of+human+small+intestinal+epithelium.">Intestinal subepithelial myofibroblasts support in vitro and in vivo growth of human small intestinal epithelium.</a> PLoS One. 6, e26898 (2011).</li></ol>

יש מחברים אין לחשוף.

הטכניקה הכללית היא דומה בעת שימוש או עכבר או מעי גס אנושי. גם טכניקה זו יכולה לשמש כדי לבודד myofibroblasts מהמעי הדק. פרטים ספציפיים עבור הבידוד של myofibroblasts מ1. עכבר ו2. מעי גס אנושי הם דנו בהמשך. 1. קולון מאוס <p class="jove_content" style=";text-align:right;directi...

הרגולציה של תפקוד מערכת (GI) במערכת העיכול כוללת אינטראקציות מורכבות, דינמיות בין השכבה הרירית וmesenchyme הבסיסי שלה. אינטראקציות אלה בדרך כלל לשמש כדי לשמור על איזון, אך עשויה גם להוביל להתפתחות של מדינות מחלה בתנאים פתולוגיים 1. Myofibroblasts הוא subpopulation של תאי סטרומה ממוקמים subjacent לשכבת האפיתל המתקשרות באופן אוטוקריני עם סובבי אוכלוסיות תא לווסת את מספר תהליכי מערכת העיכול הקריטיים הכוללים התחדשות רירית, תיקון, וסיסטיק 2. שורת תאי 18Co היא דוגמא לקו אדם הגס myofibroblast תא שכבר בשימוש נרחב ללמוד לתפקד myofibroblast משום שהיא חולקת רבות ממאפייני העיקריים בmyofibroblasts אתרו. אלה כוללים את ביטוי החלבון של חלק אקטין שריר (α-SMA) וvimentin, כמו גם ביטוי של מספרשל קולטני תא שטח כגון צמיחת אפידרמיס גורם הקולטן, או קולטנים ל3,4 חומצת lysophosphatidic. בגלל מאפיינים אלה משותפים ultrastructural, כמו גם קווי הדמיון בתפקוד ביולוגי 5, שורת תאי 18Co כבר נעשה שימוש נרחב ללמוד לתפקד myofibroblast בהקשר של מדינות מחלה רבות כגון מחלת מעי דלקתית או 3,6 סרטן מעי גס. עם זאת, יש מגבלות וחששות בעת שימוש בקו סלולרי. אלה כוללים חוסר יציבות genotypic לאורך זמן שמבדיל את שורות תאים מהתאים ראשוניים, לשנות את הפנוטיפ ותפקוד ביולוגי של התא, כולל שיעורי צמיחה ואינטראקציות עם אוכלוסיות תאים אחרות. שורות תאים גם חוסר הרכיבים הרגילים של microenvironment GI (אפיתל, סטרומה, ורכיבים של כלי דם), שהיא מגבלה העיקרית לשימוש בו. לכן, המסקנות שהוסקה ממחקר קו הסלולרי ניסיוני דורשת אימות נוספת כדי לצמצם את ריsk של פרשנות שגויה. ניתן להשיג מרקמות מעי גס אנושיות ועכבר myofibroblasts העיקרי כדי לאשר את ממצאי ניסויים שזוהו בשורת תאי 7. השיטה שתוארה במקור על ידי Mahida, et al. 8, והפרוטוקול שלנו הוא אחת טכניקות רבות תיארו היטב, שניתן להשתמש כדי לבודד myofibroblasts העיקרי מעכבר והמעי גס אנושי 9. לכל מודל של עכברים של מחלה במעי הגס, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לבודד myofibroblasts העיקרי כדי ללמוד כיצד הם פועלים עם תאי שכנים או לתרום לשניהם רגילים או במערכת העיכול פתולוגיים מעבדת 10,11. טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד איך myofibroblasts לתרום לריפוי רירי, סיסטיק, והפיתוח של אדנומות וקרצינומות של מעי גס. יכול גם להיות מושגת myofibroblasts העיקרי מרקמות מעי גס אנושיות שכבר עברו כריתה בזמן מבצע ל( מחלה דלקתית של מעי, מגבלות, דיברטיקוליטיס) שפיר או ממאיר גonditions. תאים ראשוניים מבודדים מרקמת מעי גס אנושית ועכבר ניתן לגדל בתרבית תאים ומנוצלים על מספר מוגבל של מעברים.

Table of specific reagents and equipment:
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <th>Name of the reagent</th>
 <th>Company</th>
 <th>Catalogue number</th>
 <th>Comments (optional)</th>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispase I</td>
 <td>Invitrogen/GIBCO</td>
 <td>#17105-041</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase D</td>
 <td>Roche</td>
 <td>#1 088 858</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>4 in, 16 G Popper blunt-end needle</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>#14-825-16K</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue

Myofibroblast הוא תא סטרומה של מערכת העיכול (GI), שכבר צוברת תשומת לב רבה לתפקידה החיוני בפונקציות במערכת העיכול רבות. בעוד כמה שורות תאי myofibroblast זמינות מסחרי ללמוד תאים אלה במבחנה, יש תוצאות מחקר משורת תאים שנחשפה לתנאי תרבית תאים ניסיוניים מגבלות מובנות בשל האופי מדי רדוקציוניסטית של העבודה. שימוש בmyofibroblasts העיקרי מציע יתרון גדול במונחים של מאשר ממצאי ניסוי שזוהו בשורת תאים. בידוד של myofibroblasts העיקרי ממודל חיה מאפשר לחקר myofibroblasts בתנאים המחקים באופן הדוק יותר נחקרים מצב המחלה. בידוד של myofibroblasts העיקרי מרקמות מעי גס אנושיות מספק לטעון את נתוני ניסוי הרלוונטיים ביותר, שכן התאים מגיעים ישירות מחולים עם המחלה הבסיסית. אנו מתארים טכניקה מבוססת היטב כי יכול להיות utilized לבודד myofibroblasts העיקרי משני בעכבר ורקמת מעי גס אנושית. תאים מבודדים אלה מאופיינים להיות אקטין אלפא שריר החלק וvimentin חיובי, וdesmin שלילי, עולה בקנה אחד עם myofibroblasts המעיים subepithelial. ניתן לגדל תאי myofibroblast ראשוניים בתרבית תאים ומשמשים למטרות ניסוי על מספר מצומצם של מעברים.

ברגע בודד, ניתן לגדל myofibroblasts האנושי הראשוני בתרבית תאים ומשמש על מספר מצומצם של מעברים (עד חלוף 4). תאים אלה מתאפיינים כחלק אקטין שריר וvimentin חיובי, ו( ​​איור 1 א) desmin שלילי, עולים בקנה אחד עם myofibroblasts subepithelial המעיים 5,7. יש להם גם מורפולוגיה stellate אופיינית <stron...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue at JoVE.com

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Myofibroblast הוא תא סטרומה השפעה של מערכת העיכול המווסת את התהליכים פיסיולוגיים חשובים במדינות שניהם נורמליות ומחלה. אנו מתארים טכניקה המאפשרת בידוד של myofibroblasts העיקרי משני בעכבר ורקמת מעי גס אנושית, אשר יכול להיות מנוצל לניסויים במבחנה.

בידוד של ראשוני myofibroblasts מעכבר ורקמות מעי גס אנושיים

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

isolation-of-primary-myofibroblasts-from-mouse-and-human-colon-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K Views.  UCLA.  Myofibroblast הוא תא סטרומה השפעה של מערכת העיכול המווסת את התהליכים פיסיולוגיים חשובים במדינות שניהם נורמליות ומחלה. אנו מתארים טכניקה המאפשרת בידוד של myofibroblasts העיקרי משני בעכבר ורקמת מעי גס אנושית, אשר יכול להיות מנוצל לניסויים במבחנה. 

Video: Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, little is known about changes in neuronal chromatin and nuclear organization during the course of development and aging, or in chronic neuropsychiatric disease. However, to date most chromatin and DNA based assays (other than FISH) lack single cell resolution. To this end, the considerable cellular heterogeneity of brain tissue poses a significant limitation, because typically various subpopulations of neurons are intermingled with different types of glia and other non-neuronal cells. One possible solution would be to grow cell-type specific cultures, but most CNS cells, including neurons, are ex vivo sustainable, at best, for only a few weeks and thus would provide an incomplete model for epigenetic mechanisms potentially operating across the full lifespan.  Here, we provide a protocol to extract and purify nuclei from frozen (never fixed) human postmortem brain. The method involves extraction of nuclei in hypotonic lysis buffer, followed by ultracentrifugation and immunotagging with anti-NeuN antibody. Labeled neuronal nuclei are then collected separately using fluorescence-activated sorting. This method should be applicable to any brain region in a wide range of species and suitable for chromatin immunoprecipitation studies with site- and modification-specific anti-histone antibodies, and for DNA methylation and other assays. 

The cellular heterogeneity of brain tissue poses a significant limitation for the study of epigenetic markings in chromatin because most assays lack single cell resolution. Neurons typically are intermingled with glia and other non-neuronal cells. We provide a protocol to extract and collect neuronal nuclei from human brain.

גרעינים בידוד עצבי שלאחר המוות של רקמת מוח האדם

Neurons in the human brain become postmitotic largely during prenatal development, and thus maintain their nuclei throughout the full lifespan. However, ...

Isolation of Immune Cells from Primary Tumors

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various chemokines and growth factors 1,2. However, once in the TME, these cells lose the ability to promote anti-tumor immunity and begin to support tumor growth and down-regulate anti-tumor immune responses 3-4. Studies on tumor-associated leukocytes have mainly focused on cells isolated from tumor-draining lymph nodes or spleen due to the inherent difficulties in obtaining sufficient cell numbers and purity from the primary tumor. While identifying the mechanisms of cell activation and trafficking through the lymphatic system of tumor bearing mice is important and may give insight to the kinetics of immune responses to cancer, in our experience, many leukocytes, including dendritic cells (DCs), in tumor-draining lymph nodes have a different phenotype than those that infiltrate tumors 5,6 . Furthermore, we have previously demonstrated that adoptively-transferred T cells isolated from the tumor-draining lymph nodes are not tolerized and are capable of responding to secondary stimulation in vitro unlike T cells isolated from the TME, which are tolerized and incapable of proliferation or cytokine production 7,8. Interestingly, we have shown that changing the tumor microenvironment, such as providing CD4+ T helper cells via adoptive transfer, promotes CD8+ T cells to maintain pro-inflammatory effector functions 5. The results from each of the previously mentioned studies demonstrate the importance of measuring cellular responses from TME-infiltrating immune cells as opposed to cells that remain in the periphery. To study the function of immune cells which infiltrate tumors using the Miltenyi Biotech isolation system9, we have modified and optimized this antibody-based isolation procedure to obtain highly enriched populations of antigen presenting cells and tumor antigen-specific cytotoxic T lymphocytes. The protocol includes a detailed dissection of murine prostate tissue from a spontaneous prostate tumor model (TRansgenic Adenocarcinoma of the Mouse Prostate -TRAMP) 10 and a subcutaneous melanoma (B16) tumor model followed by subsequent purification of various leukocyte populations.

In this report, we describe a protocol for isolating highly purified populations of leukocytes that infiltrate tumors. This protocol is adapted from the Miltenyi Biotech protocol to enhance yield and purity for isolating cells from complex tumor tissue.

בידוד של תאים חיסוניים של גידולים ראשוניים

Tumors create a unique immunosuppressive microenvironment (tumor microenvironment, TME) whereby leukocytes are recruited into the tumor by various ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&amp;#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

בידוד תאי גזע בוגרים נאיבי מתרבויות פיברובלסטים אנושיות הראשוניות

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for 25 min. Human esophageal resection specimens are stripped of muscularis propria and adventitia and the remaining mucosa is minced, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for up to 6 hr. Cultured cells express &#945;-SMA and vimentin and express desmin weakly or not at all. Culture conditions are not conducive to growth of epithelial, hematopoietic, or endothelial cells. Culture purity is further confirmed by flow cytometric evaluation of cell surface marker expression of potential contaminating hematopoietic and endothelial cells. The described technique is straightforward and results in consistent generation of non-hematopoieitc, non-endothelial stromal cells. Limitations of this technique are inherent to the use of primary cultures in molecular biology studies, i.e., the unavoidable variability encountered among cultures established across different mice or humans. Primary cultures however are a more representative reflection of the in vivo state compared to cell lines. These methods also provide investigators the ability to isolate and culture stromal cells from different clinical and experimental conditions, allowing comparisons between groups. Characterized esophageal stromal cells can also be used in functional studies investigating epithelial-stromal interactions in esophageal disorders.

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

בידוד של myofibroblasts מעכבר והוושט אדם

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

בידוד והתרבות ראשית של לתאי אנדותל עכבר אב העורקים

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

בידוד ותרבות של עכברים ראשיים Keratinocytes מ neonatal ומבוגרים עור עכבר

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that mitigate fibrosis. However, fibroblast research has been hindered due to the lack of universally acceptable fibroblast markers to identify quiescent as well as activated fibroblasts. Fibroblasts are a heterogenous cell population, making them difficult to isolate and characterize. The presented protocol describes three different methods to enrich fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts. Using a standard and reliable protocol to isolate fibroblasts will enable the study of their roles in homeostasis as well as fibrosis modulation.

Obtaining a pure population of fibroblasts is crucial to studying their role in wound repair and fibrosis. Described here is a detailed method to isolate fibroblasts and myofibroblasts from uninjured and injured mouse hearts followed by characterization of their purity and functionality by immunofluorescence, RTPCR, fluorescence-assisted cell sorting, and collagen gel contraction.

בידוד ואפיון של מבוגרים ופיברותקיעות לב ומיופיברופיצוצים

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in the continuity of this barrier can result in inflammatory disorders such as inflammatory bowel disease. One of the limitations in the study of intestinal epithelial biology has been the lack of primary cell culture models, which has obliged researchers to use model cell lines derived from carcinomas. The advent of three dimensional (3D) enteroids has given epithelial biologists a powerful tool to generate primary cell cultures, nevertheless, these structures are embedded in extracellular matrix and lack the maturity characteristic of differentiated intestinal epithelial cells. Several techniques to generate intestinal epithelial monolayers have been published, but most are derived from established 3D enteroids making the process laborious and expensive. Here we describe a protocol to generate primary epithelial colon monolayers directly from murine intestinal crypts. We also detail experimental approaches that can be used with this model such as the generation of confluent cultures on permeable filters, confluent monolayer for scratch wound healing studies and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

In this protocol, we describe how to generate murine primary epithelial colon monolayers directly from intestinal crypts. We provide experimental approaches to generate confluent monolayers on permeable filters, confluent monolayers for scratch wound healing and biochemical studies, and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

דור של מונוליירים אפיתל המעי הגס הראשי מורין מקריפטות מעיים

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

בידוד ותרבות של קרטינוציטים אוראליים ראשוניים מחך העכבר למבוגרים

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...