מיקרו-דפוס הוא כלי רב עוצמה משום שהוא מאפשר ללמוד תגובות תאיות כדי להגדיר אותות ביוכימיים וביופיזיים שתאים נתקלים באורגניזמים חיים. בניגוד לשיטות אחרות, המתואר הוא גמיש יותר עבור יצירת דפוס. לדוגמה, הוא מאפשר ייצור של מעברי צבע ומיקרו-דפוסים של חלבונים מרובים עם רבייה גבוהה.
הקבוצה שלנו משתמשת ב- LIMAP לא רק כדי לחקור את התוואי העצבי, אלא גם כיצד תאים אחרים מגיבים לאותות המשפיעים על התפשטות התאים, ההתמדה והנדידה. מיקרו-תבנית משמשת למענה על שאלות בסיסיות בביולוגיה של התא. הידע שנצבר יכול לשמש לשינוי מכשירים קיימים ברפואה רגנרטיבית, למשל, תיקון עצבים לאחר פגיעה עצבית היקפית.
התחל בעיצוב תבניות עבור תבניות בתוכנות ציור דיגיטליות. בחר גודל תמונה של 1, 824 פיקסלים אורך ו 1, 140 פיקסלים ברוחב. עצב את התבנית ושמור את התבנית כקובץ TIFF של 8 סיביות.
לפני דפוס, לנקות ולהפעיל את פני השטח עם מנקה פלזמה באמצעות לחץ תהליך של 1, 000 כדי 1, 300 millitorr ו כוח של 29.6 וואט במשך 1 עד 5 דקות. השתמש בצלחת תחתית זכוכית עם גודל באר פנימי 20 מ"מ ועובי זכוכית של 0.16 עד 0.19 מילימטרים. בחר גם שש באר או מנה אחת טובה, בהתאם למספר התנאים שנבדקו.
חותכים את סטנסילי PDMS בתנאים סטריליים כדי להבטיח שהם מתאימים היטב לתחתית הזכוכית הפנימית. הסר את סתימות microwell הפנימי עם מדפים סטריליים, ולתקוע את stencils על הזכוכית היטב. הכינו פתרון PLL-PEG של 0.1 מיליגרם למיליליטר ב-PBS, והוסיפו 20 מיקרוליטרים לכל מיקרווול.
לאחר מכן, הדגירה את המנה בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. לאחר הדגירה, הסר 15 מיקרוליטרים של ה- PLL-PEG מכל באר, ושטוף אותו חמש פעמים עם 20 מיקרוליטרים של PBS מבלי לתת לו להתייבש. הכן מיקרווול אחד כדי ליצור דפוס התייחסות על ידי הסרת 18 microliters של PBS מ באר אחת והוספת חמישה microliters של photoinitiator, עוזב PBS במיקרווולים הנותרים.
לאחר מכן, השתמשו בסמן פלואורסצנטי כדי לסמן היטב פנימית ריקה. מקם את הרבה מעל המטרה, ולהתאים את המיקוד האובייקטיבי עד הלוגו PRIMO ואת התגית לטפל בתאים שלך". לאחר מכן, רשום את מיקום Z של מישור המוקד.
ליצירת תבנית ייחוס, דמיינו את קצה המיקרווול בעזרת הפוטיניטיאטור באמצעות האור המשודר דרך המצלמה, ובחרו את סמל ה-ROI מהתפריט הימני. בחר PRIMO כדי להעלות את תבנית התבנית הרצויה, אשר תוקרן על ROI כיחידה עיצובית. נווט לאזור היקפי במיקרווול, בחר נעל והתאם את המוקד למיקום הכיול Z.
לאחר מכן, בחר הפעל כדי להתחיל לצלם את תבנית ההפניה. לשטוף את דפוס הייחוס microwell שלוש פעמים עם 20 microliters של PBS כדי להסיר את photoinitiator. לאחר מכן, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של מטריצה חוץ-תאית עם תווית פלואורסצנטית, או ECM, תווי חלבון.
הדגירה את המנה בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 20 דקות, הקפד להגן על הייחוס היטב מפני אור. לאחר הדגירה, להסיר 18 microliters של פתרון חלבון, ולשטוף את הטוב שלוש פעמים עם 20 microliters של PBS. השתמש במיקרוסקופ epifluorescence כדי לדמיין את תבנית הייחוס.
התאימו את המיקוד על קצות דוגמת המילוי דרך נתיב המצלמה והקליטו את מיקום Z בהתאם למוקד הטוב ביותר. מיקום זה יהיה מוקד הלייזר האופטימלי המשמש לדפוסים הבאים. בתנאים סטריליים, הסר 18 מיקרוליטרים של PBS מכל המיקרווולים.
הוסף חמישה microliters של photoinitiator לכל באר, הומוגניזציה על ידי צינורות למעלה ולמטה. אם אתם יוצרים תבניות של מספר חלבונים באותו מיקרווול, העלו את כל ערכות תבניות הדפוס הרצויות בו-זמנית. לאחר מכן, בחר את מספר השורות, העמודות והמינון.
שמור את תצורת התבנית כקובץ בתוכנה. נווט לאזור שבו נוצרה תבנית ההפניה והתאם את המוקד למיקום Z האופטימלי. לאחר מכן, בחר הפעל כדי ליזום צילום.
יחידות העיצוב הופכות מעתום לכחול עם השלמת הצילום. הסר את photoinitiator מן microwells על ידי שטיפת אותם שלוש פעמים עם 20 microliters של PBS. לאחר הכביסה האחרונה, להסיר 18 microliters של PBS מכל microwell, ולהוסיף 20 microliters של פתרון חלבון ECM.
הדגירה את המנה בטמפרטורת החדר במשך 20 עד 30 דקות, הקפד להגן עליו מפני אור. לאחר מכן, הסר 15 מיקרוליטרים של פתרון החלבון ECM, ושטף את המיקרווולים שלוש פעמים באמצעות 20 מיקרוליטרים של PBS. כדי למנוע כריכה צולבת, הוסיפו 20 מיקרוליטרים של PLL-PEG, או BSA, למיקרווולים, והדקירה את המנה בטמפרטורת החדר למשך שעה, בחושך.
לאחר מכן, להסיר 15 microliters של סוכן החסימה, ולשטוף את כל microwells שלוש פעמים עם 20 microliters של PBS. הסר 18 microliters של PBS, ולהוסיף 5 microliters של photoinitiator לכל microwell, להבטיח כי photoinitiator הוא הומוגני על כל פני השטח של microwells. נווט אל המיקרווול הראשון וטען את תצורת התבנית שנשמרה קודם לכן.
לאחר מכן, בחר את הפעולות שיש לדפוס עבור הסיבוב השני של פוטופטרנינג, הקפד לבטל את הבחירה בפעולות מהסיבוב הראשון. לאחר photopatterning, להסיר PLPP על ידי שטיפה עם PBS. לאחר מכן, דגירה במשך 20 דקות עם פתרון חלבון ECM השני, ולשטוף את microwells שלוש פעמים עם 20 microliters של PBS.
השתמש במיקרוסקופ epifluorescence כדי לדמיין ולדמיין את התבניות המודפסות. כאשר מוכן צלחת התאים, להוסיף מיליליטר אחד של מדיום עם תאים לזכוכית הפנימית היטב, הקפד לכסות את כל microwells. ולמקום את צלחת התרבות ב 37 מעלות צלזיוס, ו 5% פחמן דו חמצני אינקובטור.
על מנת להבטיח כי הדפוסים שנוצרו הם ייצוג מדויק של התבנית, מדידות עוצמת פלואורסצנטי מתקבלות לאורך הפסים, ומ מאזור רקע מתאים מעל כל פס. תבניות מיקרו מוגדרות לשחזור מושגות ברוחב שבין 20 ל-2 מיקרומטרים, אך ניתן לראות אפקט קצה בעת הדפסת תכונות של 20 מיקרומטר או רחב יותר. ריכוזי חלבון מוגדרים מתקבלים על ידי דגירה עם ריכוזים משתנים של חלבון, או שינוי מינון הלייזר המשמש כדי לחשוף את הסרט antiadhesive.
עוצמת הלייזר פרופורציונלית לרמת גווני האפור של התבנית, ויוצרת מעברי צבע של תאורת UV. המדידה של פרופיל עוצמת הפלואורסצנטיות לאורך פס מעבר הצבע, היא ליניארית בתבנית התבנית, ובדוגמת מעבר הצבע שנוצרה. פרוטוקול זה יכול לשמש ליצירת מיקרו-דפוסים עם חלבונים מרובים באותו מיקרווול, כגון דפוסי צלב עם פסים אופקיים של פיברונקין, ופסים אנכיים של למינין.
אבל צעד חסימה יש צורך למנוע הצלבה של חלבונים. דפוסי הצלב שנוצר יכול לשמש לאחר מכן עבור assays הסלולר עם קווי תאים עצביים, או תאי CAD, או נוירונים ראשוניים, עכברוש DRGs. בעת ביצוע פרוטוקול זה, ההיבטים החשובים ביותר שיש לזכור הם ביצוע כיול מערכת תקין, לא לתת microwells להתייבש במהלך שלבי הכביסה מרובים, ושימוש בפרמטרים הנכונים עבור דגירה וחסימה של חלבון.
ניתוח של התנהגות התא בדרך כלל כרוך מיקרוסקופיה, כגון פלואורסצנטיות, זמן לשגות, AFM. אפיון נוסף יכול לכלול שיטות ביוכימיות אחרות, כגון פרופיל ביטוי גנים.
