עבודה זו נתמכה על ידי מלגת המחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע במסגרת מענק מס '. DGE-1745301 (S.Y.), פרס Pew-Stewart Scholar (S.C.), פרס Searle Scholar (S.C.), מענק המחקר של קרן Shurl and Kay Curci (S.C.), Merkin Innovation Seed Grant (S.C.), מענק המחקר Mallinckrodt (S.C.) ומרגרט א. מענק Early Medical Research Trust לשנת 2024 (S.C). S.C. נתמך גם על ידי NIH/NCI תחת פרס מספר P30CA016042.

1. תיוג חלבונים בתאים
<ol><li>בטא את החלבון המעניין המאוחה ל- HaloTag בקו התאים הרצוי.</li>
	<li>בטא ביציבות H2B מתויג בהילה באותו סוג תאים כמו ב-1.1 באמצעות טרנספוזונים או התמרה ויראלית.</li>
</ol>2. הכנת כיסויים
<ol><li>לפני השימוש בכיסויים לתרבית תאים, יש לנקות את הכיסויים כדי להסיר מזהמים אוטופלואורסצנטיים.<ol><li>הר בקוטר 25 מ"מ, #1.5 מכסה מחליקים על מתלה צביעה קרמית ומניחים במיכל פוליפרופילן.</li>
		<li>יש לטבול לחלוטין את החלקות הכיסוי בתמיסת KOH באורך 1 מ' ולסניק למשך שעה.</li>
		<li>יש לשטוף את החלקות שלוש פעמים במים מזוקקים פעמיים (ddH2O).</li>
		<li>יש לטבול לחלוטין את החלקות הכיסוי באתנול 100% ולבצע סוניקט למשך שעה אחת.</li>
		<li>יש לטבול לחלוטין את הכיסויים באתנול 20% מדולל ב-ddH2O ולאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.</li>
	</ol></li>
</ol>3. הכנת תאים למיקרוסקופ
הערה: בצע שלבים מסעיף זה בארון בטיחות ביולוגית כדי למנוע זיהום של התאים.
<ol><li>תאי צלחת על כיסויים מנוקים. יש לבצע יומיים לפני ההדמיה אם החלבון המתויג בהילה מתבטא באופן ארעי. יש לבצע יום אחד לפני ההדמיה אם החלבון המתויג בהילה מתבטא בצורה יציבה או אנדוגנית.<ol><li>השתמשו במלקחיים סטריליים כדי להניח את הכיסויים בצלחת בעלת 6 בארות (כיסוי אחד/באר לכל דגימת תא) ואפשרו לשאריות אתנול להתאדות.</li>
		<li>צלחת כל באר עם מספר מתאים של תאים כדי להשיג 70% מפגש בזמן ההדמיה. צלחת באר נוספת עם תאים המבטאים ביציבות H2B-Halo עם אותו מפגש מטרה.</li>
		<li>בצע שלב זה רק אם אתה מבטא באופן זמני את החלבון המסומן ב- Halo של עניין. לדגור על תאים במשך 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2. לאחר מכן, העבר את התאים עם פלסמיד המקודד את החלבון המתויג של עניין באמצעות ריאגנטים transfection מתאים בעקבות הנחיות היצרן.</li>
		<li>לדגור על התאים במשך 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO2.</li>
	</ol></li>
	<li>צבעו את התאים המבטאים את החלבון המסומן ב-Halo כבעל תווית הילה הן עם ליגנד Halo שאינו ניתן להפעלה פוטו-אקוסטית (למשל, JFX549) והן עם ליגנד Halo הניתן להפעלה פוטו-אקוסטית (למשל, PA-JF646). תאי צביעה המבטאים H2B-Halo רק עם ליגנד Halo הניתן להפעלה פוטואקטיבית. הערה: יש להשתמש בריכוזים של ליגנדות Halo המפורטות כאן כנקודת התחלה; הריכוז האופטימלי יהיה תלוי ברמת הביטוי ובריכוז המקומי המעובה של החלבון המעניין.<ol><li>עבור כל דגימת תא המבטאת את החלבון המתויג בהילה, יש לדלל 100 ננומטר JFX549 ליגנד Halo35 ו-20 ננומטר PA-JF646 ליגנד Halo36 ב-500 מיקרוליטר של מדיה תאית מתאימה. עבור כל דגימה המבטאת H2B-Halo, יש לדלל רק 20 ננומטר PA-JF646 Halo ligand ב-500 μL של מדיה תאית מתאימה.</li>
		<li>עבור כל באר, יש לשאוף מדיה קיימת, להוסיף 2 מ"ל של PBS 1x, ואז לשאוף PBS (פעולה זו מכונה "שטיפה" לשארית הפרוטוקול), ולהחליף במדיה המכילה את ליגנדות Halo המתאימות.</li>
		<li>יש לדגור במשך שעה אחת בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.</li>
		<li>יש לשטוף עם PBS ארבע פעמים ולהחליף במדיה חדשה שאינה מכילה ליגנדות Halo.</li>
		<li>יש לדגור במשך 15 דקות בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2.</li>
		<li>חזור על שלבים 3.2.4 ו- 3.2.5 שלוש פעמים (ארבעה מחזורי דגירה בסך הכל).</li>
		<li>השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר את הכיסוי עם תאים לתא כיסוי תרבית תאים התואם לשלב המיקרוסקופ.</li>
		<li>הוסף מדיה ללא פנול אדום לתא והמשך להדמיה. יש לדגור על הדגימות שלא מצולמות באופן מיידי בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 עד לצורך.</li>
	</ol></li>
</ol>4. הדמיה של מולקולה בודדת
הערה: ניסויים עצמאיים המודדים את זמני השהייה הן של H2B והן של החלבון המעניין צריכים להתבצע על פני מספר ימים (≥3) כדי להפיק תוצאות מובהקות סטטיסטית. לפני הדמיה של דגימות תאים במיקרוסקופ, יש ליישר את שתי המצלמות באמצעות מיקרוספרות מוכתמות בגודל 0.1 מיקרומטר (Table of Materials) או תקן כיול דומה.
<ol><li>הכינו את המיקרוסקופ.<ol><li>הפעל את המיקרוסקופ ואת המחשב השולט במיקרוסקופ.</li>
		<li>הפעל רכיבי דגירה של תאים חיים (תנור חימום ו- CO2) במיקרוסקופ והגדר אותו ל- 37 ° C ו- 5% CO2. לאפשר למערכת להתאזן.</li>
		<li>שים טיפה של השמן המתאים על יעד טבילה שמן 100x TIRF על המיקרוסקופ ולטעון את דגימת התא על שלב המיקרוסקופ.</li>
	</ol></li>
	<li>זהה תא לתמונה.<ol><li>ציירו את דוגמת התא תחת תאורת שדה בהיר וכווננו את מיקום z עד שהתאים יהיו ממוקדים.</li>
		<li>זהה תא בעל מאפיינים מורפולוגיים של תאים בריאים.</li>
		<li>חתוך את שדה הראייה (FOV) כך שהוא ילכוד רק את גרעין תא היעד.</li>
		<li>השתמש בתאורת לייזר וכוונן את זווית TIRF עד להשגת תאורת HILO41 עם יחס אות לרעש אופטימלי של מולקולות בודדות.</li>
	</ol></li>
	<li>תמונה H2B-Halo בתאים חיים. הערה: כוחות הלייזר המשמשים בסעיף זה הם ספציפיים לניסוי זה ונכללים כדוגמה. יש לבחור סמכויות לייזר מתאימות על פי הקריטריונים המפורטים בדיון.<ol><li>הגדר תצורת רכישה באופן הבא. הגדר את זמן החשיפה כ- 500 אלפיות השנייה. במהלך כל חשיפה של 500 מילישניות, עוררו את מולקולות PA-JF646 המסומנות כ-H2B-Halo עם קרן של 9.1 mW, 640 ננומטר. במהלך הזמן המת בין פריימים (158.01 μs במערכת ההדמיה המשמשת כאן), פוטו-הפעל את המולקולות עם קרן של 111 μW, 405 ננומטר.</li>
		<li>צלם 2000 מסגרות ברציפות תחת הגדרות אלה. הגדילו בהדרגה את עוצמת הקרן של 405 ננומטר במהלך הרכישה כאשר מספר המולקולות הפוטואקטיביות הופך לבלתי מספיק.</li>
	</ol></li>
	<li>דמיינו את החלבון המתויג בהילה שמעניין תאים חיים.<ol><li>השתמש במראה דיכרואית בעלת מעבר ארוך כדי לפצל אורכי גל פליטה בין שתי מצלמות, אחת כדי לזהות PA-JF646 והשנייה כדי לזהות JFX549. השתמש במסנני פליטה מתאימים מול המצלמות.</li>
		<li>השתמש באותה תצורת רכישה המתוארת ב- 4.3.1 עם השינוי הבא. הוסף ערוץ JFX549 נוסף כדי לעקוב אחר המיקומים של החלבון המתויג ב- Halo מתעבה לאורך זמן. כל 10 שניות, לרכוש מסגרת אחת (500 ms, 2.1 mW, 561 ננומטר עירור) בערוץ JFX549 תוך שמירה על רכישת ערוץ PA-JF646. זה יגרום לדמם לתוך ערוץ PA-JF646, אשר יטופל בניתוח הנתונים שלאחר הרכישה.</li>
		<li>צלם 2000 מסגרות ברציפות תחת הגדרות אלה. הגדילו בהדרגה את עוצמת הקרן של 405 ננומטר במהלך הרכישה כאשר מספר המולקולות הפוטואקטיביות הופך לבלתי מספיק.</li>
	</ol></li>
</ol>5. ניתוח נתוני הדמיה של מולקולה בודדת
הערה: הפרמטרים המשמשים לאורך סעיף 5 הם ספציפיים לניסוי זה ונכללים כדוגמה. יש לבחור פרמטרים מתאימים על פי הקריטריונים המפורטים בדיון.
<ol><li>הכן נתוני הדמיה גולמיים לעיבוד.<ol><li>לקבלת הנתונים של החלבון המעניין, המירו כל ערוץ מקובץ נתוני ההדמיה הגולמיים לקובץ .tif עצמאי באמצעות ImageJ או תוכנת עיבוד תמונה דומה. עבור הנתונים של H2B, המר את הערוץ היחיד מקובץ נתוני ההדמיה הגולמיים לקובץ .tif באותו אופן. הערה: בהתאם לתוכנת הרכישה שבה נעשה שימוש, יכולות להיות מסגרות ריקות בסרט העיבוי, מכיוון שרק מסגרת אחת למעקב אחר עיבוי מצולמת כל 10 שניות. יש לאכלס את המסגרות הריקות במסגרת העיבוי העדכנית ביותר (תוכנות רכישה מסוימות עושות זאת באופן אוטומטי). בנוסף, אם יש דימום משמעותי מתעלת העיבוי (JFX549) לערוץ המולקולה הבודדת (PA-JF646) במהלך מסגרות מעקב עיבוי אלה, יש להחליף את מסגרות המולקולה הבודדת המתאימות במסגרת המולקולה הבודדת העדכנית ביותר.</li>
		<li>אם יש מסגרות שיש להחליף באחד מהסרטים עקב הסיבות לעיל, החלף אותן במסגרת העדכנית ביותר מסרט זה על-ידי שינוי (במידת הצורך) והפעלת pretracking_comb.txt, מאקרו ImageJ הזמין ב- Chong et al.1 וביצוע ההנחיות.</li>
	</ol></li>
	<li>צור מסלולים של חלקיק יחיד באמצעות תוכנת SPT, לדוגמה, SLIMfast39, יישום GUI של אלגוריתם MTT38 הזמין ב- Teves et al.42.<ol><li>טען את הקובץ מ- 5.1.2 המכיל את הסרט בעל המולקולה היחידה ב- SLIMfast על ידי לחיצה על טען >- Imagestack.</li>
		<li>הגדר את הפרמטרים (שיעור שגיאות לוקליזציה: 10-6; לולאות דפלציה: 3) עבור לוקליזציה על ידי לחיצה על > OPT גיליון: לוקליזציה.</li>
		<li>הגדר את הפרמטרים (שיא פליטה: 664 ננומטר; זמן השהיה: 500 אלפיות השנייה) לרכישה על-ידי לחיצה על > OPT Sheet: Acquisition.</li>
		<li>דמיינו את הלוקליזציה של כל המולקולות במסגרת אחת כדי לוודא שהפרמטרים שנבחרו מתאימים (TEST LOC). אם הדבר אינו מתאים, שנה פרמטרים בשלבים 5.2.2 ו- 5.2.3 וחזור על שלב זה.</li>
		<li>צור קובץ המכיל לוקליזציה של כל המולקולות בכל מסגרת (LOC ALL).</li>
		<li>טען את הקובץ מ- 5.2.5 ב- SLIMfast על ידי לחיצה על טען נתוני חלקיקים > >- SLIMfast.</li>
		<li>הגדר את הפרמטרים (מקדם דיפוזיה מרבי צפוי: 0.1 מיקרומטר2/s; מספר מרבי של מתחרים: 5) ליצירת מסלול על ידי לחיצה על > OPT Sheet: Tracking.</li>
		<li>צור קובץ המכיל את המסלולים של כל המולקולות (GEN TRAJ).</li>
	</ol></li>
	<li>סנן את המסלולים הקצרים מ- t min, 2.5 s, באמצעות evalSPT39, הזמין ב- Drosopoulos et al.43, כדי לקחת בחשבון שגיאות מעקב הגורמות למסלולים קצרים באופן מלאכותי.<ol><li>טען את הקובץ מ- 5.2.8 ל- evalSPT (+ קובץ > מ- 5.2.8 > אישור).</li>
		<li>הגדר את הפרמטרים (מינימום: 5 מסגרות; מרבי: אורך מסלול מרבי עבור קובץ מ- 5.2.8) כדי לסנן את המסלולים הקצרים מ- 2.5 שניות.</li>
		<li>צור קובץ עם כל המסלולים המסוננים (ייצוא נתונים).</li>
	</ol></li>
	<li>בצע שלב זה עבור מסלולי החלבון המעניין בלבד. מיין את המסלולים לאלה שבעיבוי ומחוץ למעבים, ולאחר מכן חלץ את זמן השהייה הממוצע בעיבוי. הערה: כל הקודים עבור סעיף זה זמינים ב- Chong et al.1.<ol><li>סף את כל מסגרות הסרט שנרכשו בערוץ JFX549 כדי ליצור סרט קיטועי זמן המאוכלס במסיכה בינארית המתפתחת בזמן המדגישה מיקומי עיבוי על-ידי הפעלת המאקרו, הגרעין ו mask_v2.txt האשכול של ImageJ וביצוע ההנחיות.</li>
		<li>פרמט מחדש את מסלולי המולקולה הבודדת שנוצרו ב- 5.3.3. שימוש בסקריפט MATLAB, ConvertASCII_SlowTracking_css3.m, והתאמת שמות הקבצים, הנתיבים והפרמטרים לפי הצורך. (פרמטרים: חשיפה, 0.5 שניות; רזולוציה, 0.16 מיקרומטר לפיקסל).</li>
		<li>מיין מסלולים בהתבסס על שבריר החיים שמולקולה נתונה מבלה בעיבוי, F, באמצעות סקריפט MATLAB, categorization_v4.m, והתאמת שמות הקבצים והנתיבים לפי הצורך.</li>
		<li>המשך להשתמש רק במסלולים בעיבוי.</li>
	</ol></li>
	<li>חלץ kobs,s ו - kpb וחשב את זמן המגורים הממוצע המתוקן, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">.<ol><li>חלץ kobs,s מהחלבון המעובה של מסלולי עניין באמצעות סקריפט MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m, והתאמת שמות קבצים, נתיבים ופרמטרים לפי הצורך. (פרמטרים: חשיפה, 0.5 שניות; StartFrameForFit, 5 מסגרות).</li>
		<li>חלץ kpb ממסלולי H2B באמצעות סקריפט MATLAB, PLOT_ResidenceHist_css.m, והתאם שמות קבצים, נתיבים ופרמטרים לפי הצורך. (פרמטרים: חשיפה, 0.5 שניות; StartFrameForFit, 5 מסגרות).</li>
		<li>חישוב זמן השהייה הממוצע המתוקן של חלבון הריבית הקשור באופן ספציפי למעבים שלו, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">כ- , <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq07v3.jpg" style="margin: auto;"> הערה: יש לבצע בקרות כדי לוודא שזמני חשיפה שונים ארוכים מספיק כדי לטשטש חלקיקים ניידים, לדוגמה, 300 אלפיות השנייה ו- 800 אלפיות השנייה, עדיין גורמים לאותו זמן שהייה ממוצע של החלבון המעניין.</li>
	</ol></li>
</ol>

כימות מבוסס הדמיה של תאים חיים על מולקולות בודדות של אינטראקציות חלבונים

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול כפי שהוא מוצג כאן מיועד למערכות כמו אלה שנחקרו ב-Irgen-Gioro et al.40. בהתאם ליישום, ניתן לשנות רכיבים מסוימים של הפרוטוקול, למשל, השיטה ליצירת קווי תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי, מערכת התיוג הפלואורסצנטי וסגנון הכיסוי שבו נעשה שימוש. תיוג הילה של חלבון בתא יכול להיעשות בא?...

גוף הולך וגדל של עבודות מצביע על כך שמעבים ביומולקולריים ממלאים תפקיד חשוב בארגון התא ובתפקודים תאיים רבים, למשל, ויסות שעתוק 1,2,3,4,5, תיקון נזק לדנ"א 6,7,8, ארגון הכרומטין 9,10,11,12, כרומוזום X השבתה 13,14,15 ואיתות תוך-תאי 16,17,18. בנוסף, חוסר ויסות של עיבוי ביומולקולרי מעורב במחלות רבות, כולל סרטן 19,20,21 והפרעות נוירודגנרטיביות 22,23,24,25,26. היווצרות קונדנסט מונעת לעתים קרובות על ידי אינטראקציות חלבון-חלבון חולף, סלקטיבי ורב-ערכי, חומצת חלבון-גרעין, או חומצת גרעין-חומצת גרעין27. בתנאים מסוימים, אינטראקציות אלה יכולות להוביל להפרדת פאזה נוזלית-נוזלית (LLPS), מעבר צפיפות המעשיר באופן מקומי ביומולקולות ספציפיות בטיפות חסרות ממברנה. אינטראקציות רב-ערכיות כאלה מתווכות לעתים קרובות על ידי האזורים הלא מסודרים במהותם (IDR) של חלבונים 1,28,29. אפיון ביופיזי של אינטראקציות אלה ברמה המולקולרית הוא קריטי להבנתנו של תפקודים תאיים בריאים וחריגים רבים, בהתחשב בהתפשטות המעבים לאורכם. למרות שטכניקות המבוססות על מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי, כגון שחזור פלואורסצנטי לאחר הלבנה פוטו-אקונומית (FRAP)30,31,32, היו בשימוש נרחב כדי להראות באופן איכותי כי חילופי המולקולריות בין המעבים והסביבה התאית הסובבת הם דינמיים, כימות דינמיות האינטראקציה של ביומולקולות ספציפיות בתוך עיבוי אינו אפשרי בדרך כלל באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי קונקונבנציונלי או מולקולה בודדת מיקרוסקופיה ללא שיטות ניתוח נתונים מיוחדות. טכניקת המעקב אחר חלקיקים בודדים (SPT) המתוארת בפרוטוקול זה מבוססת על מיקרוסקופ חד-מולקולה של תא חי33 ומספקת כלי רב עוצמה ייחודי לכימות דינמיקת האינטראקציה בין חלבונים ספציפיים בתוך קונדנסטים. הקריאה של SPT למדידה כזו היא זמן השהייה הממוצע של חלבון בעל עניין במעבה.
ניתן לחלק את הפרוטוקול לשני חלקים - רכישת נתונים וניתוח נתונים. השלב הראשון של איסוף נתוני הדמיה הוא לבטא בתאים חלבון מעניין המאוחה ל- HaloTag34. זה מאפשר תיוג של החלבון המעניין עם שני פלואורופורים, כאשר רוב מולקולות החלבון יסומנו עם פלואורופור שאינו ניתן להפעלה (למשל, JFX549 Halo ligand35) וחלק קטן מהן יסומן עם פלואורופור מובחן ספקטרלית וניתן להפעלה (למשל, PA-JF646 Halo ligand36). זה מאפשר רכישה בו זמנית של כל מיקומי העיבוי בתא ורכישה של יריעות של מולקולה בודדת של חלבון העניין נקשר ולא נקשר למעבים. בינתיים, אותו סוג של תאים משתנים כדי לבטא ביציבות H2B מתויג Halo, היסטון כי הוא בעיקר חסר תנועה על כרומטין. לאחר מכן התאים מוכתמים בליגנד Halo PA-JF646 כדי לאפשר הדמיה של H2B במולקולה אחת. כפי שיפורט בפירוט בהמשך, ניסוי זה מסביר את תרומתה של הלבנה לאור כדי לאפשר כימות מדויק של דינמיקת האינטראקציה של החלבון המעניין. לאחר מכן יש לגדל תאים לניסויי הדמיה בתרבית על גבי כיסויים נקיים, להיות מוכתמים בליגנד(ים) של HaloTag ולהרכיב אותם לתא הדמיה של תאים חיים. משם, הדגימה מצולמת תחת הארה של יריעה אופטית משופעת ולמינציה (HILO) במיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת (TIRF) המסוגל לבצע הדמיה דו-ערוצית וזיהוי של מולקולה יחידה. לאחר מכן הפליטה מפוצלת לשתי מצלמות, אחת עוקבת אחר מיקומי עיבוי ואחת עוקבת אחר מולקולות בודדות. הרכישה מתבצעת עם זמן אינטגרציה ארוך (בסדר גודל של מאות מילישניות) כדי לטשטש חלבונים המתפזרים בחופשיות וללכוד רק חלבונים שהם פחות ניידים עקב קשירה למבנים יציבים בתא37.
השלב הראשון של ניתוח נתונים הוא שימוש באלגוריתם מעקב אחר חלקיקים בודדים (SPT)38,39 כדי למקם מולקולות חלבון בודדות בכל פריים של הסרט ולהרכיב את הלוקליזציות למסלול עבור כל מולקולה לאורך חייה הניתנים לגילוי. לאחר מכן ממיינים את המסלולים לאלה המייצגים מולקולות בפנים ולאלה המייצגים מולקולות מחוץ למעבים על ידי השוואת הלוקליזציה של המולקולות לאורך מסלוליהן ללוקליזציה של כל המעבים בזמנים המתאימים1.
לאחר מכן, עקומת הישרדות (1 - CDF) נוצרת באמצעות האורכים של כל המסלולים בעיבוי. זמן המגורים הממוצע לכאורה של המולקולות מופק לאחר מכן על ידי התאמת עקומת ההישרדות למודל המעריכי הדו-רכיבי הבא של קשירת חלבונים,
<img align="center" alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq01.jpg" style="margin: auto;">,
עם A כשבר של מולקולות שאינן קשורות באופן ספציפי ועם kobs,ns ו - kobs,s כשיעורי הדיסוציאציה הנצפים של מולקולות שאינן קשורות באופן ספציפי וקשורות ספציפית, בהתאמה. רק kobs,s נחשב מכאן והלאה. הדינמיקה של דיסוציאציה חלבונית, ktrue,s, ופוטו-הלבנה של הפלואורופור, kpb, תורמות ל-kobs,s כמו
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq02.jpg" style="margin: auto;">;
לכן, כדי לבודד את ההשפעות של דיסוציאציה חלבונית, נמדד שיעור הדיסוציאציה הספציפי של H2B-Halo בקו התאים שהוזכר קודם.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq03.jpg" style="margin: auto;">
H2B הוא חלבון המשולב ביציבות בכרומטין וחווה דיסוציאציה מינימלית בסקאלת הזמן של רכישת סרט בעל מולקולה בודדת37. קצב הדיסוציאציה הספציפי שלו שווה אז לקצב ההלבנה של ליגנד ההילה PA-JF646, או
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq04.jpg" style="margin: auto;">.
זמן השהייה הממוצע בעיבוי של החלבון המעניין, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;">, הוא אז
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq06.jpg" style="margin: auto;">.
מוצגות תוצאות מייצגות של Irgen-Gioro et al.40 , כאשר פרוטוקול זה יושם כדי להראות כי מיזוג תחום אוליגומריזציה ל- IDR גורם לזמני שהייה ארוכים יותר של IDR במעבים שלו. תוצאה זו מצביעה על כך שתחום האוליגומריזציה הנוסף מייצב את האינטראקציות ההומוטיפיות של IDR המניע LLPS. באופן עקרוני, ניתן ליישם את אותה שיטה עם פרוטוקולים מעט שונה כדי לאפיין את האינטראקציות ההומוטיפיות או ההטרוטיפיות של כל חלבון המשתתף בהיווצרות של כל סוגי המעבים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.1 &#181;m TetraSpeck microsphere</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T7279</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mm Diameter, #1.5 Coverslips</td>
			<td>Marienfeld Superior</td>
			<td>111650</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>593/40 nm bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-593/40-25</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>676/37 nm bandpass filter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>FF01-676/37-25</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well TC Plate</td>
			<td>Genesee</td>
			<td>25-105MP</td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Line: U-2 OS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-96</td>
			<td>Labeling of proteins in cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ConvertASCII_SlowTracking_css3 
			.m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass Staining Rack</td>
			<td>Thomas</td>
			<td>24957</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterated Janelia Fluor 549 (JFX549)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, Low Glucose</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10-567-022</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eclipse Ti2-E Inverted Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof</td>
			<td>Lab Alley</td>
			<td>EAP200-1GAL</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>evalSPT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Drosopoulos et al., 2020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>SH30396.03</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ikon Ultra CCD Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>X-13723</td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Longpass dichroic beamsplitter</td>
			<td>Semrock</td>
			<td>Di02-R635-25x36</td>
			<td>Single-molecule imaging: Red/Far Red beamsplitter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUN-F Laser Unit</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: 405/488/561/640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatTek glass-bottom dish</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td>Preparation of cells for microscopy: 35 mm, #1.5 coverslip dish for cell culture.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIS-Elements</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: Microscope acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nucleus and cluster mask_v2.txt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15-140-122</td>
			<td>Labeling of proteins in cells: Growth media used: DMEM with 5% fetal bovine serum, 1% penstrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18912014</td>
			<td>Labeling of proteins in cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoactivatable Janelia Fluor 646 (PA-JF646)</td>
			<td>Janelia Research Campus</td>
			<td></td>
			<td>Preparation of cells for microscopy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PLOT_ResidenceHist_css.m</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydroxide</td>
			<td>Mallinckrodt Chemicals</td>
			<td>6984-06</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pretracking_comb.txt</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Chong et al., 2018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SLIMfast</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Analysis of single-molecule imaging data: Available in Teves et al., 2016</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top incubation system</td>
			<td>Tokai Hit</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging: For live-cell imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TwinCam dual emission image splitter</td>
			<td>Cairn Research</td>
			<td></td>
			<td>Single-molecule imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic Cleaner</td>
			<td>Branson</td>
			<td>5800</td>
			<td>Preparation of coverslips</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-molecule measurement of protein interaction dynamics within biomolecular condensates

עיבויים ביומולקולריים הנוצרים באמצעות הפרדת פאזות נוזלית-נוזלית (LLPS) נחשבו קריטיים בארגון התא ובמספר גדל והולך של תפקודים תאיים. אפיון LLPS בתאים חיים חשוב גם משום שעיבוי חריג נקשר למחלות רבות, כולל סרטן והפרעות נוירודגנרטיביות. LLPS מונע לעתים קרובות על ידי אינטראקציות סלקטיביות, חולפות ורב-ערכיות בין חלבונים בעלי הפרעה מהותית. עניין רב הם דינמיקת האינטראקציה של חלבונים המשתתפים LLPS, אשר מסוכמים היטב על ידי מדידות של זמן המגורים מחייב שלהם (RT), כלומר, כמות הזמן שהם מבלים קשורים בתוך condensates. כאן, אנו מציגים שיטה המבוססת על הדמיה של מולקולה בודדת של תאים חיים המאפשרת לנו למדוד את RT הממוצע של חלבון מסוים בתוך מעובים. אנו מדמיינים בו זמנית מולקולות חלבון בודדות ואת המעבים שאליהם הן משויכות, משתמשים במעקב אחר חלקיק יחיד (SPT) כדי לשרטט מסלולים של מולקולה בודדת, ולאחר מכן מתאימים את המסלולים למודל של קשירת טיפות חלבון כדי לחלץ את RT הממוצע של החלבון. לבסוף, אנו מראים תוצאות מייצגות שבהן שיטת הדמיה זו של מולקולה בודדת יושמה כדי להשוות את ממוצע RTs של חלבון בעיבוי LLPS שלו כאשר הוא מאוחה ולא מאוחה לתחום אוליגומריזציה. פרוטוקול זה ישים באופן נרחב למדידת דינמיקת האינטראקציה של כל חלבון המשתתף ב- LLPS.

A growing body of work suggests that biomolecular condensates play an important role in cellular organization and numerous cellular functions, e.g., transcriptional regulation1,2,3,4,5, DNA damage repair6,7,8, chromatin organization9,10,11,12, X-chromosome inactivation13,14,15, and intracellular signaling16,17,18. In addition, the dysregulation of biomolecular condensates is implicated in many diseases, including cancers19,20,21 and neurodegenerative disorders22,23,24,25,26. Condensate formation is often driven by transient, selective, and multivalent protein-protein, protein-nucleic acid, or nucleic acid-nucleic acid interactions27. Under certain conditions, these interactions can lead to liquid-liquid phase separation (LLPS), a density transition that locally enriches specific biomolecules in membraneless droplets. Such multivalent interactions are often mediated by the intrinsically disordered regions (IDRs) of proteins1,28,29. Biophysical characterization of these interactions at the molecular level is critical to our understanding of numerous healthy and aberrant cellular functions, given the pervasiveness of condensates across them. Although techniques based on confocal fluorescence microscopy, e.g., fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)30,31,32, have been widely used to qualitatively show that the molecular exchanges between condensates and the surrounding cellular environment are dynamic, quantifying the interaction dynamics of specific biomolecules within condensates is generally not possible using conventional confocal microscopy or single-molecule microscopy without specialized data analysis methods. The single-particle tracking (SPT) technique described in this protocol is based on live-cell single-molecule microscopy33 and provides a uniquely powerful tool to quantify the interaction dynamics between specific proteins within condensates. The readout of SPT for such measurement is the mean residence time of a protein of interest in the condensates.
The protocol can be broken down into two parts - data acquisition and data analysis. The first step of imaging data acquisition is to express in cells a protein of interest that is fused to a HaloTag34. This enables labeling of the protein of interest with two fluorophores, where a majority of the protein molecules are to be labeled with a non-photoactivatable fluorophore (e.g., JFX549 Halo ligand35) and a small fraction of them are to be labeled with a spectrally distinct, photoactivatable fluorophore (e.g., PA-JF646 Halo ligand36). This allows for the simultaneous acquisition of all condensate locations in the cell and the acquisition of single-molecule movies of the protein of interest binding and unbinding to the condensates. Meanwhile, the same type of cells are modified to stably express Halo-tagged H2B, a histone that is largely immobile on chromatin. The cells are then stained with the PA-JF646 Halo ligand to enable single-molecule imaging of H2B. As will be discussed in detail below, this experiment accounts for the contribution of photobleaching to enable precise quantification of the interaction dynamics of the protein of interest. Cells for imaging experiments must then be cultured on clean coverslips, stained with HaloTag ligand(s), and assembled into a live-cell imaging chamber. From there, the sample is imaged under highly inclined and laminated optical sheet (HILO) illumination on a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope capable of two-channel imaging and single-molecule detection. The emission is then split onto two cameras, one tracking condensate positions and one tracking single molecules. Acquisition is performed with a long integration time (on the order of hundreds of ms) to blur out freely-diffusing proteins and only capture proteins that are less mobile due to binding to stable structures in the cell37.
The first step of data analysis is using an established single-particle tracking (SPT) algorithm38,39 to localize individual protein molecules in each frame of the movie and assemble the localizations into a trajectory for each molecule over its detectable lifetime. The trajectories are then sorted into those representing molecules inside and those representing molecules outside the condensates by comparing the localizations of the molecules throughout their trajectories to the localizations of all the condensates at the corresponding times1.
Next, a survival curve (1 - CDF) is generated using the lengths of all the in-condensate trajectories. The apparent mean residence time of the molecules is then extracted by fitting the survival curve to the following two-component exponential model of protein binding,
<img align="center" alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq01.jpg" style="margin: auto;" />,
with A as the fraction of molecules non-specifically bound and with kobs,ns and kobs,s as the observed dissociation rates of the non-specifically bound and specifically bound molecules, respectively. Only kobs,s is considered from here onward. The dynamics of both protein dissociation, ktrue,s, and photobleaching of the fluorophore, kpb, contribute to kobs,s as
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq02.jpg" style="margin: auto;" />;
thus, to isolate the effects of protein dissociation, the specific dissociation rate of H2B-Halo in the cell line mentioned prior is measured.
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq03.jpg" style="margin: auto;" />
H2B is a protein that is stably integrated into chromatin and that experiences minimal dissociation in the time scale of a single-molecule movie acquisition37. Its specific dissociation rate is then equal to the photobleaching rate of the PA-JF646 Halo ligand, or
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq04.jpg" style="margin: auto;" />.
The mean in-condensate residence time of the protein of interest, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq05.jpg" style="margin: auto;" />, is then
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/66169/66169eq06.jpg" style="margin: auto;" />.
Representative results from Irgen-Gioro et al.40 are shown, where this protocol was applied to demonstrate that fusing an oligomerization domain to IDR results in longer residence times of the IDR in its condensates. This result suggests that the added oligomerization domain stabilizes the homotypic interactions of the IDR that drives LLPS. In principle, the same method with slightly modified protocols can be applied to characterize the homotypic or heterotypic interactions of any protein that participates in the formation of any types of condensates.

מחבר זרקור: הערכה של דינמיקה של עיבוי חלבונים בתאים אנושיים חיים

מדידה של מולקולה בודדת של דינמיקת אינטראקציה של חלבונים בתוך עיבויים ביומולקולריים

1 Our lab aims to understand the interaction behaviors<v>2 of intrinsically disordered protein regions 3 and how they play roles in transcriptional regulation 4 in healthy and diseased human cells. 5 In our lab, we develop and use novel 6 single molecule microscopy techniques 7 in combination with molecular biology, 8 biochemical and proteomic approaches 9 to study biomolecular condensates. 10 This protocol enables the quantification of the dynamics 11 by which a specific protein 12 binds to a particular type of condensate 13 in live human cells, 14 and is broadly applicable 15 to measuring the interaction dynamics of any protein 16 that participates in liquid-liquid phase separation.

כאן, אנו מציגים תוצאות מייצגות של Irgen-Gioro et al.40, שם השתמשנו בפרוטוקול SPT זה כדי להשוות את דינמיקת האינטראקציה של שני חלבונים במעבי LLPS בהרכבה עצמית שלהם. TAF15 (TATA-box binding protein associated factor 15) מכיל IDR שיכול לעבור LLPS עם ביטוי יתר בתאים אנושיים. שיערנו כי מיזוג TAF15(IDR) ל-FTH1 (שרשרת פריטין כבדה 1), ?...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Evaluation of Protein-Condensate Dynamics in Live Human Cells at JoVE.com

חלבונים רבים בעלי הפרעה פנימית הוכחו כמשתתפים בהיווצרות של עיבוי ביומולקולרי דינמי מאוד, התנהגות חשובה לתהליכים תאיים רבים. במאמר זה אנו מציגים שיטה מבוססת הדמיה של מולקולה בודדת לכימות הדינמיקה שבאמצעותה חלבונים מתקשרים זה עם זה בעיבויים ביומולקולריים בתאים חיים.

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number ...

single-molecule-measurement-protein-interaction-dynamics-within

Research

JoVE Journal

Biology

Single-Molecule Measurement of Protein Interaction Dynamics Within Biomolecular Condensates

2.5K Views.  California Institute of Technology. 1 המעבדה שלנו שואפת להבין את התנהגויות האינטראקציה2 של אזורי חלבון בעלי הפרעה פנימית 3 וכיצד הם ממלאים תפקידים בוויסות שעתוק 4 בתאים אנושיים בריאים וחולים. 5 במעבדה שלנו אנו מפתחים ומשתמשים ב-6 שיטות מיקרוסקופיה חדשניות של מולקולות בודדות 7 בשילוב עם ביול?...

Video: מחבר זרקור: הערכה של דינמיקה של עיבוי חלבונים בתאים אנושיים חיים

Biomolecular condensates formed via liquid-liquid phase separation (LLPS) have been considered critical in cellular organization and an increasing number of cellular functions. Characterizing LLPS in live cells is also important because aberrant condensation has been linked to numerous diseases, including cancers and neurodegenerative disorders. LLPS is often driven by selective, transient, and multivalent interactions between intrinsically disordered proteins. Of great interest are the interaction dynamics of proteins participating in LLPS, which are well-summarized by measurements of their binding residence time (RT), that is, the amount of time they spend bound within condensates. Here, we present a method based on live-cell single-molecule imaging that allows us to measure the mean RT of a specific protein within condensates. We simultaneously visualize individual protein molecules and the condensates with which they associate, use single-particle tracking (SPT) to plot single-molecule trajectories, and then fit the trajectories to a model of protein-droplet binding to extract the mean RT of the protein. Finally, we show representative results where this single-molecule imaging method was applied to compare the mean RTs of a protein at its LLPS condensates when fused and unfused to an oligomerizing domain. This protocol is broadly applicable to measuring the interaction dynamics of any protein that participates in LLPS.

Many intrinsically disordered proteins have been shown to participate in the formation of highly dynamic biomolecular condensates, a behavior important for numerous cellular processes. Here, we present a single-molecule imaging-based method for quantifying the dynamics by which proteins interact with each other in biomolecular condensates in live cells.

Halo-Ligand Staining of Cells for Protein Condensate-Interaction Studies Using Single-Molecule Imaging

1 After creating the cell lines<v>2 expressing the HaloTag protein of interest and Halo-H2B, 3 prepare the halo ligand staining reagent 4 separately for both of them. 5 Rinse the cells with two milliliters of PBS. 6 Add halo ligand containing media 7 and incubate them at 37 degrees Celsius 8 with 5%carbon dioxide for one hour.9 After removing the staining media, 10 rinse the cells four times with PBS 11 and incubate them with fresh media devoid of halo ligands. 12 After four such rinse incubation cycles, 13 transfer the cover slip with cells 14 to a microscope stage compatible chamber 15 with sterile forceps. 16 Add phenol red-free media to the chamber before imaging.

צביעת Halo-ligand של תאים למחקרי אינטראקציה של עיבוי חלבונים באמצעות הדמיה של מולקולה בודדת

Single-Molecule Imaging of Halo-Tagged Proteins to Study Protein-Condensate Interactions

1 To begin, obtain ligand stain cells<v>2 expressing halo-tagged protein of interest and halo H2B. 3 After turning on the microscope system, 4 set the live cell incubation parameters 5 and let the system equilibrate. 6 Put a drop of the oil onto 7 a 100x TIRF objective on the microscope 8 and load the cell sample onto the microscope stage.9 To identify a morphologically healthy cell, 10 adjust the Z position 11 and image the cell sample under brightfield illumination. 12 Crop the field of view to capture the target cell nucleus. 13 Using laser illumination, adjust the TIRF angle 14 to achieve hilo illumination with an optimal 15 signal to noise ratio of a single molecule.16 Then, set the exposure time to 500 milliseconds. 17 During the dead time between frames, 18 photo activate the molecules 19 with a 111 microwatt 405 nanometer beam, 20 and during each exposure, excite H2B halo molecules 21 with a 9.1 milliwatt 640 nanometer beam. 22 Initiate image capturing for 2000 frames continuously 23 and gradually increase the power of the 405 nanometer beam 24 upon reduction of photo activated molecules.25 For a halo-tagged protein of interest, 26 split emission wavelengths between two cameras 27 using a long pass dichroic mirror. 28 To the same acquisition parameters demonstrated earlier, 29 add JFX549 channel to acquire one frame every 10 seconds 30 and capture 2000 frames continuously.

הדמיה של מולקולה בודדת של חלבונים עם תווית הילה לחקר אינטראקציות חלבון-עיבוי

Analysis of Single-Molecule Imaging Data to Study Interactions of Halo-Tagged Proteins

1 To begin, perform live cell<v>2 single molecule imaging of HaloTag protein condensates. 3 Using ImageJ, convert each channel 4 from the raw imaging data file 5 into an independent TIFF file. 6 If necessary, run pre-tracking comb.text 7 and follow the prompts 8 to replace any frames with the most recent ones. 9 To load the single molecule of movie file in SlimFast, 10 click on load, followed by image stack. 11 Set the parameters for localization 12 and acquisition under respective option sheets.13 Visualize the localizations of all the molecules. 14 And using lock all, 15 generate a file containing the localizations 16 of all the molecules in every frame. 17 Next, go to load particle data 18 and select SlimFast to load the file 19 with localization and acquisition settings.20 Using option and sheet tracking, 21 adjust the parameters for trajectory generation. 22 Click on gen traj to generate a file 23 containing the trajectories of all the molecules. 24 Load the sheet tracked file into eval SPT 25 and set the parameters 26 to filter out the trajectories shorter than 2.5 seconds.27 Using export data, generate a file 28 with all the filtered trajectories. 29 Running the ImageJ macro, nucleus, 30 and cluster mask version two. text, 31 threshold all the frames of the movie acquired 32 in the JFX549 channel to generate a time lapse movie 33 populated with the time evolving binary mask 34 highlighting condensate locations.35 Using convert ASCII slow tracking CSS 3. M, 36 reformat the trajectories 37 and run categorization version 4. M 38 to sort them based on the lifetime 39 a molecule spends in a condensate.40 Next, using plot residence hist CSS. M, 41 extract the observed dissociation rate 42 of specifically bound molecules 43 and the photobleaching rate from the in condensate 44 protein of interest and the H2B trajectories. 45 Finally, calculate the corrected mean residence time 46 of the protein of interest, 47 specifically bound to its condensates.48 A frame from two-color single molecule movie 49 of TAF15 IDR-Halo-FTH1 shows signals 50 from the nucleus in both PA-JF646 and JFX549 channels. 51 Upon assembling and sorting, 52 a clear distinction was observed for the trajectories 53 of PA-JF646 detected molecules bound to the condensates. 54 The calculated mean residence times 55 after correction for photobleaching 56 were more for TAF15-Halo-FTH1 than Halo-TAF15.