שחררו את קומפלקסי טבעות הכרומטין של lexA CBP מהחרוזים המגנטיים המשמשים לטיהור מוקד הגן של כרומטין בעותק יחיד על ידי דגירה על הדבורים בשני מיקרוליטרים של וירוס טבק רקומביננטי 6xHis-tagged או TEV protease. לאחר הפרדת הדבורים מהדבורים הסופיות באמצעות העברת מדף מגנטי, הפולט המכיל טבעות כרומטין שסועות לצינור תגובה חדש של 1.5 מיליליטר. שוב, הניחו את הצינורות על מדף מגנטי כדי להפריד בין שאריות החרוזים לבין הפלוט הסופי.
השהה מחדש את החרוזים ב 750 מיקרוליטר של חיץ אמוניום פחמתי קר לפני אחסון כמה דגימות ב 20 צלזיוס לניתוח DNA וחלבונים. מהפליטה הסופית, הוציאו את הדגימות ואחסנו אותן בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס לצורך ניתוח DNA וחלבונים. יתר על כן, לקחת דגימות מן החרוזים שיורית.
התחל את Elution denaturation על ידי שטיפת חרוזים מגנטיים פעמיים ב 750 מיקרוליטר של חיץ אמוניום קרבונט קר במשך 20 דקות כל אחד, ארבע מעלות צלזיוס מסתובב ב 20 סיבובים לדקה. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של הידרוקסיד אמוניום מולרי 0.5 לחרוזים כדי לחלץ קומפלקסים כרומטין קשור lexA לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. מפרידים את החרוזים מהמתלה באמצעות מתלה מגנטי ומעבירים את הפולט לצינור תגובה בעל קשירה נמוכה.
יש לדגור על צינור התגובה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות ולהפריד את החרוזים מהמתלה באמצעות מתלה מגנטי. לאחר שתסיים, העבר את הפולט לצינור תגובה מחייב נמוך. להשהות מחדש את החרוזים ב 750 מיקרוליטר של מים deionized ולאסוף דגימות עבור ניתוח DNA וחלבונים.
לבסוף, קבל דגימות ניתוח DNA וחלבון מן eluate הסופי. במחקר כומתה יעילות הטיהור של מוקד ARS316 וזן הרקומבינציה והושוותה למוקד הבקרה PDC1. מוקד ARS316 הראה התאוששות נמוכה יותר בזרימה בהשוואה ל- PDC1.
למרות שחלק קטן של טבעות הכרומטין נותרו קשורות לחרוזי TEV עקב מחשוף פרוטאז TEV לא שלם, אלוציית דנטורציה הביאה להתאוששות מוקד ARS316 של 80% עד 90%. זה מתאים להעשרה הגבוהה של מולקולות ARS316 בחרוזי TEV ובשברי אלוציה של דנטורציה כאשר משקללים את גודל גנום השמרים בהשוואה לזן הבקרה שלא הראה העשרה של מוקד ARS316 באף אחד מהשברים המכומתים. לאחר הדבקת TEV, החרוזים הראו אחוז התאוששות גבוה יותר של מוקד ARS316 מכיוון שיעילות מחשוף ה- TEV לא הייתה 100%זה הביא לכך שחלק קטן של טבעות הכרומטין נותרו קשורות לחרוזים.
עם זאת, החמקמק הדנטורינג הראה התאוששות של 80 עד 90% של מוקד ARS316 וזן הרקומינוס המתאים להעשרה הגבוהה של מולקולות ARS316 כאשר משקללים את גודל גנום השמרים.
