כדי להתחיל, שאפו את התקשורת מהבארות שבהן התאים עטופים בהידרוג'ל מתורבתים בצלחת 24 בארות. שטפו את ההידרוג'לים על ידי הזרקת 500 מיקרוליטר של PBS ישירות על כל באר המכילה את ההידרוג'לים, ולאחר מכן שאפו בעדינות את PBS. באמצעות פיפטה 1, 000 מיקרוליטר, להוסיף 500 מיקרוליטר של פתרון קבוע לכל באר כדי לתקן את spheroids בצלחת 24 באר.
יש להשרות את הג'ל למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, לפני שאתם מוציאים את התמיסה המקבעת ומשליכים אותה למיכל פסולת ייעודי. לאחר מכן, שטפו את ההידרוג'לים עם PBS שלוש פעמים כפי שהודגם קודם לכן. אם לא נעשה שימוש מיידי, אחסנו את ההידרוג'לים ב-500 מיקרוליטר PBS לבאר בארבע מעלות צלזיוס למשך עד שבוע.
כדי להכתים את התאים המכוסים בהידרוג'ל, ראשית, הכינו נוגדנים ראשוניים מדוללים כראוי עבור nestin ו-SOX2. לאחר שאיפת PBS מן הבארות, להוסיף 50 מיקרוליטר של נוגדנים מדוללים לכל באר. לדגור על התאים עם הנוגדנים במשך 24 שעות כדי להכתים אותם לחלוטין.
לאחר מכן באמצעות פיפטה 1, 000 מיקרוליטר, להסיר את פתרון הצביעה ולהשליך את הפסולת כראוי. לאחר שטיפת ההידרוג'לים שלוש פעמים, אחסנו אותם ב-PBS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד שבועיים לפני ההדמיה, או הדמיה מיידית. כדי לנקות את הספרואיד המוכתם לשיפור שקיפות ההדמיה, שאפו תחילה את PBS מכל באר.
לאחר מכן לטפל ברצף spheroids עם 500 מיקרוליטר של 20% 40% ו 80% formamide לכל באר במשך 90 דקות כל אחד. לבסוף לדגור על ההידרוג'לים ב-100% פורממיד במשך 24 שעות לפני ההדמיה. הספרואידים צולמו בעומקים משתנים של מחסנית z, מה שאיפשר את הערכת כדאיות התא בכל מיקום בתוך מחסנית z.
הקרנה מרבית המנצלת את ערימת הספרואידים ייצגה את הנקודה הגבוהה ביותר של עוצמת האור בכל מיקום, מפושטת לתמונה אחת. תמונות מייצגות של ספרואידים מוכתמים גילו כי גורם השעתוק להתחדשות עצמית, SOX2, היה ממוקם יחד עם DAPI בגרעין. להיפך, קן סמן תאי גזע היה נוכח בכל התאים.
לא היה הבדל בין הספרואיד הצף החופשי ללא ג'ל לבין הספרואידים העטופים, אולי בגלל האדישות של ג'ל ה- PEG בו נעשה שימוש. התמונות המייצגות של מקטעים אופטיים בגודל של כ-90 מיקרון לתוך ספרואידים מנוקים ולא מנוקים גילו כי בעת ביצוע הניקוי, ניתן היה לצלם את ליבת הספרואיד עמוק יותר בכ-30 מיקרון בהשוואה לספרואיד שלא נוקה.
