עבודה זו נתמכה חלקית על ידי מענק לא. 213/09 של קרן המדע הישראלי, אין להעניק. 2005258 מקרן BSF, מענק לא. 201,665 מן המועצה האירופית למחקר (ERC), ועל ידי מכון ראסל ברי לננוטכנולוגיה בטכניון. אנו מכירים את עזרתו של פרופ &#39;נועם אדיר פארס סלאמה מהפקולטה Schulich לכימיה בטכניון לגבי אספקת וטיפול של כחוליות. העזרה והתמיכה של סבטלנה Yoffis מן היחידה Micro-Nano ייצור הטכניון הוא מאוד מוערך.

1. סקירה של שקיעת דם מיקרו הדמיה ראשית, אנו מספקים הסבר קצר על שקיעת דם, שקיעת דם מיקרוסקופית, ואת המרכיבים השונים של המערכת שלנו, ולאחר מכן נתאר את הניסויים הדמיה בפועל. תהודה אלקטרונים ספין היא טכניקה ספקטרוסקופיות שבהן קרינה אלקטרומגנטית בתדר מסוים נספג על ידי מולקולות עם ספינים של אלקטרונים מזווג, תחת שדה מגנטי סטטי חיצוני (איור 1). שקיעת דם מועסק באזורים רחבים של המדע, כגון כימיה, ביולוגיה, פיזיקה, מדע החומרים, לאיתור וזיהוי של רדיקלים חופשיים ומרכזי פאראמגנטיים. זוהי שיטה רבת עוצמה לחקר הסביבה של מולקולות פאראמגנטיים במינים חיים ומספק מידע על חומציות (pH), צמיגות, חמצן, תגובתי מינים חמצן בריכוז 3. לקבלת דוגמיות הטרוגנית, שקיעת דם מידע ספקטרלי ניתן לקבל באופן מוחלט מרחבית (כלומר, על ידי קבלת תמונה), באמצעות מעברים הדרגתיים השדה המגנטי 4. זה דומה מאוד לשיטה נפוצה יותר של הדמיה באמצעות תהודה מגנטית (MRI) כי בעיקר מציין ספינים פרוטון. עד כה, כגון שקיעת דם טכניקות הדמיה יושמו עבור דגימות לחיות עם גודל גדול יחסית של כמה סנטימטרים וגם ברזולוציה מ&quot;מ בקנה מידה. (לדוגמה ראה איור 2, שנלקחו הפניה 5.) ההתפתחות האחרונה יחסית שקיעת דם הדמיה היא הרחבה של יכולותיו מהתבוננות חיות קטנות ברזולוציה של מילימטר בהיקף של מדידות של דגימות מילימטר ותת בגודל מילימטר עם בקנה מידה מיקרון החלטה. תחום זה נקרא מיקרוסקופיה שקיעת דם, אשר היום יכול לספק תמונות שקיעת דם 3D עם רזולוציה מתקרב 1 מיקרון 2 (ראה דוגמאות נציג איור 3). מיקרוסקופ ESR הוא דומה במהותו ספקטרומטר שקיעת דם רגילה. יש לו מגנט ליצירת שדה סטטי, מערכת מיקרוגל עבור עירור ספין זיהוי אות, בדיקה לקיום המדגם, מסוף ממוחשב לשלוט בתהליך הרכישה וטיפול נתונים. רכיבים אחרים הדמיה ייחודית שקיעת דם בכלל קיים גם שקיעת דם microcopy הם מגנטיים שיפוע בתחום מקורות, שהם חלק ממערכת אלקטרונית, סלילי צבע הנמצאים לחקור את ההדמיה. פרטים נוספים על מערכת ספציפית שלנו מוצגים בסרט הפרוטוקול המתואר התייחסות 2. 2. שקיעת דם מיקרו הדמיה לדוגמא הכנה בשלב זה מתאר את שיטת הכנת המדגם לניסוי שקיעת דם מיקרו הדמיה. בסוף שלב זה התאים ממוקמים בתחתית מיוחד שהוכן שקיעת דם מיכל זכוכית מיקרוסקופ מדגם יחד עם פתרון trityl 6 הרדיקלי למאגר. פרוטוקול זה מתאר את המדידה של תאים כחוליות ולכן, עבור סוגים אחרים של תאים, התאמות הנכון עשוי להיות נחוץ בשלב הכנת המדגם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, כמה ריבועים של נייר סופג עם גודל של 400 ~ 400 מיקרומטר נלקחים ונוסף צינור Eppendorf אשר מלא לאחר מכן עם 1.2 מ&quot;ל של ההשעיה כחוליות (בריכוז של 40 מ&quot;ג / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההשעיה היא centrifuged 2 דקות ב 6000 סל&quot;ד ב microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות זאת, למאגר supernatant נמחק לחלוטין למעט μL 50 ~ אשר עזבו כדי למנוע התייבשות כחוליות. כתוצאה מתהליך זה, הנייר סופג רווי עכשיו על ידי התאים כחוליות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פינצטה בסדר, סיבים כמה המחולצים הנייר והניח בתחתית כוס דמוי בעל שהוכנו במיוחד זכוכית מדגם 7. לאחר מכן 3 מ&quot;מ של trityl בפתרון-11 BG 8, 9 (ראה Scheme 1) הוא הוסיף לבעל המדגם על ידי סיוע של מזרק בסדר. בעל הוא חתום מכן באמצעות דבק לריפוי UV, משאיר משקע קטן אוויר פתוח. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> במלאי 4 </td><td> במלאי 3 </td><td> במלאי 2 </td><td> במלאי 1 </td></tr><tr><td> H 3 BO 3 2.86g/liter </td><td> K 2 HPO 4: 3H 2 O 4.0g/liter </td><td> MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter </td><td> Na 2 מ&quot;ג EDTA 0.1g/liter </td></tr><tr><td> MnCl 2: 4H 2 O 1.81g/liter </td><td></td><td></td><td> אמוניום ציטרט Ferric 0.6g/liter </td></tr><tr><td> ZnSO 4: 7H 2 O 0.222g/liter </td><td></td><td></td><td> חומצה ציטרית: 1H2O 0.6g/liter </tד&gt; </tr><tr><td> CuSO 4: 5H 2 O 0.079g/liter </td><td></td><td></td><td> CaCl 2: 2H 2 O 3.6g/liter </td></tr><tr><td> COCl 2 : 6 שעות 2 O 0.050g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> NaMoO 4: 2H 2 O 0.391g/liter </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Scheme 1. הכנת בינוני 11 BG. </li></ol> 3. שקיעת דם מיקרו הדמיה ניסויים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את הניסוי הדמיה, להפעיל את המערכת שקיעת דם מיקרו הדמיה להכניס את הדגימה לתוך מהוד שהולך בתוך החללית הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעת, באמצעות תוכנת שליטה במחשב, להגדיר את המערכת על מצב &quot;כוון&quot; ולמצוא את המיקרוגל תהודה בתדירות של החללית, אשר ישמשו למדידת שקיעת דם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, הגדר את שדה מגנטי סטטי על ערך התואם את תדר המיקרוגל מיושם, להגדיר את הפרמטרים תזמון רצף הדופק ולבחון את האות שקיעת דם על מנת לוודא כי המערכת פונקציות היטב המדגם הוא מוכן היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ואז, להגדיר את הפרמטרים הדמיה, כגון מספר של פיקסלים, כוחו של מילויים, ואת אורכו של פולסים שיפוע לערכים הנדרשים שלהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההתקנה, לאסוף שלוש תמונות 3D שקיעת דם על ידי רצף הד האן הדופק הדמיה (איור 4) עם הפרדה interpulse, ערכי  500, 600, ו 700 ns. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אור מוקרן על המדגם הוא מופעל או כבוי בהתאם לתנאי הניסוי הנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך הרכישה, הנתונים נשמרים באופן אוטומטי. ותיזות קבצי נתונים גולמיים מעובדים אז דרך סקריפט תוכנות Matlab לספק תמונות של ריכוז קיצוני trityl וזמן רגיעה T 2 המפה, אשר תורגמו תמונה חמצן בריכוז באמצעות כיול קיימים. </li></ol> 4. נציג תוצאות התוצאות של הניסוי הם מספר תלת מימדי שקיעת דם מיקרו תמונות נרשם ערכים שונים τ. תמונות אופייניות נתונים גולמיים ניתנים באיור 5. העליון שלוש תמונות, נמדד בתנאים כהה, דומים מאוד, למעט הפחתה בעוצמת האות. מצד שני, דפוס תמונה השינויים תחת קרינה אור בשל פעמים הרפיה שונים בחלקים שונים של המדגם. מידע זה יכול להיות מעובד 1 להשיג תמונה משרעת, כפי שמוצג באיור 6 וגם תמונות של זמן הרפיה, T 2 (איור 7). T 2 תמונות מתורגמים ריכוז חמצן ערכים באמצעות עקומת קיימים כיול המקשר את ריכוז החמצן בזמן הרפיה באמצעות המשוואה: <img src="/files/ftp_upload/2122/2122eq.jpg" alt="משוואה 1" /> הנה, T 2 0 הוא הזמן ספין ספין הרפיה של החללית בתנאים anoxic (תלוי בריכוז של בדיקה, C, מקדם הדיפוזיה שלה, D), ו-k הוא קבוע המידתיות. ברוב המקרים, מקדם הדיפוזיה אינו משתנה הרבה דוגמאות לחיות (אם כי, במידת הצורך, הוא יכול עקרונית להיות מוערך באופן ישיר גם על ידי 6 שקיעת דם, 10), ריכוז ספין מתקבל במהלך תהליך ההדמיה. לכן, יחס זה יכול לשמש כדי למדוד ישירות ריכוז החמצן. נחזור איור 6, ברור מהתמונה משרעת כי תאי כחוליות היו ממוקמים בעיקר בצד ימין של בעל המדגם. יתר על כן, מבוסס על איור 7, ברור כי לאור יוזם את הייצור של O 2 ו - גורם לעלייה משמעותית בריכוז O 2 של פתרון, בעיקר voxels ליד כחוליות. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig1.jpg" alt="איור 1" /> איור 1: רמות אנרגיה בתהודה ספין האלקטרון. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2: חמצן בריכוז תמונה אופיינית של עכבר נושאת גידול. התמונה משמאל מראה את המידע האנטומי, המבוסס על תמונה MRI. יציבה חינם אורגני רדיקלי היה מוזרק אל העכבר ומאפיינים שקיעת דם שלה לספק את ריכוז החמצן בכל סביבתו (מימין). שקיעת דם מבוסס התוצאות על גבי תמונת ה-MRI האנטומית. שדה הראייה הוא 32 מ&quot;מ. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3: שתי דוגמאות של ES גבוה מיקרו בקנה מידה ברזולוציהR תמונות של מדגם photolithographically שנוצר עם אבקת N C 60 @ (משמאל) גבישים פאראמגנטיים LiPc (מימין) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4: אופיינית האן הדמיה רצף הדופק מראה את מיקרוגל (MW) ואת שיפוע, G x, y G ו-G z פולסים. <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5: אופיינית גלם נתונים שקיעת דם מיקרו תמונות: a, b, ו-c הם נתונים גולמיים של המדגם cyanobacterium עם תאורה לא קלה נמדד τ = 500600700 ns, בהתאמה. פריטים D, E, ו - זהים a, b, ו-c, אבל עם תאורה אור. עוצמה היא להתוות סולם שרירותי (אך עולה בקנה אחד בתוך כל קבוצה של שלוש תמונות הגלם נתונים כהה או בהיר) <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig6.jpg" alt="איור 6" /> איור 6: תמונה Amplitude המתאים ריכוז קיצוני הפתרון (בקנה מידה שרירותי). <img src="/files/ftp_upload/2122/2122fig7.jpg" alt="איור 7" /> איור 7: T 2 תמונות המקביל [O 2] ערכי תחת (מימין) בתנאי חושך (משמאל) אור.

<ol>
	<li>Halevy, R., Tormyshev, V., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-imaging+of+Oxygen+Concentration+near+Live+Photosynthetic+Cells+by+Electron+Spin+Resonance.">Micro-imaging of Oxygen Concentration near Live Photosynthetic Cells by Electron Spin Resonance.</a> Biophysical Journal. , (2010).</li><li>Blank, A., Suhovoy, E., Halevy, R., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESR+imaging+in+solid+phase+down+to+sub-micron+resolution:+methodology+and+applications.">ESR imaging in solid phase down to sub-micron resolution: methodology and applications.</a> J Phys Chem. 11, 6689-6699 (2009).</li><li>Gallez, B., Swartz, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+EPR:+when,+how+and+why?.">In vivo EPR: when, how and why?.</a> NMR Biomed. 17, 223-225 (2004).</li><li>Eaton, G. R., Eaton, S. S., Ohno, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> EPR imaging and in vivo EPR. , (1991).</li><li>Matsumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+tumor+oxygenation+and+microvascular+permeability+using+Overhauser+enhanced+MRI.">Simultaneous imaging of tumor oxygenation and microvascular permeability using Overhauser enhanced MRI.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 17898-17903 (2009).</li><li>Talmon, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Diffusion+in+Porous+Media+by+PGSE.">Molecular Diffusion in Porous Media by PGSE.</a> ESR. J Phys Chem. , (2010).</li><li>Halevy, R., Talmon, Y., Blank, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photolithographic+production+of+glass+sample+holders+for+improved+sensitivity+and+resolution+in+ESR+microscopy.">Photolithographic production of glass sample holders for improved sensitivity and resolution in ESR microscopy.</a> Applied Magnetic Resonance. 31, 591-598 (2007).</li><li>Allen, M. M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+Division+of+Some+Unicellular+Blue-Green+Algae.">Growth and Division of Some Unicellular Blue-Green Algae.</a> J Gen Microbiol. 51, 199-199 (1968).</li><li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generic+Assignments,+Strain+Histories+and+Properties+of+Pure+Cultures+of+Cyanobacteria.">Generic Assignments, Strain Histories and Properties of Pure Cultures of Cyanobacteria.</a> J Gen Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li><li>Blank, A., Talmon, Y., Shklyar, M., Shtirberg, L., Harneit, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+diffusion+in+liquid+phase+by+electron+spin+resonance.">Direct measurement of diffusion in liquid phase by electron spin resonance.</a> Chem Phys Lett. 465, 147-152 (2008).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

פרוטוקול זה מראה כיצד שקיעת דם מיקרו הדמיה יכול להיות מיושם על המפה ריכוז החמצן ליד דגימות קטנות לחיות. ברזולוציה מרחבית של ~ 30 x 30 x 100 מיקרומטר הוא הוכיח, עם רגישות הקרוב מיקרו ריכוז החמצן ותת רגישות femtomole חמצן מוחלט לכל voxel. השימוש שקיעת דם מיקרו הדמיה למיפוי החמצן ליד התאים משלים את הטכניקות הקיימות כיום מבוססות על מיקרו אלקטרודות או פלואורסצנטי / זרחני. יתר על כן, עם החללית פאראמגנטיים נכונה, זה יהיה ישים בקלות עבור תאיים חמצן מיקרו הדמיה, יכולת אשר שיטות אחרות למצוא קשה מאוד להשיג. בעתיד הקרוב אנו מתכננים להמשיך ולשפר את המתודולוגיה לספק תמונות מדגם לחיות עם רזולוציה של מיקרונים אחדים, מתן פרמטרים כגון ניגודיות ריכוז תחמוצת סופר, חומציות (pH), מקדם בדיקה דיפוזיה, כמובן, ריכוז החמצן. יכולות אלה משלימים האופטי מבוסס מתודולוגיות הנוכחי הן מבחינת סוג בניגוד וגם דוגמאות של מאפיינים (למשל, לא שקוף דגימות עבה, במקרים מסוימים, מדידות תאיים לעומת תאיים).

<table border="1">
	<thead>
		<tr>
			<th>Material Name</th>
			<th>Type</th>
			<th>Company</th>
			<th>Catalogue Number</th>
			<th>Comment</th>
		</tr>
	</thead>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Kendro</td>
			<td>Heraus, 75003235</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perdeuterated triarylmethyl (trityl) radical</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Synthesized at Novosibirsk using the method described in reference 6.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BG-11 buffer</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For instruction preparation, see Scheme 1 and references 8, 9. </td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>Microliter 7000.5</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultraviolet Curing</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Norland Products, Inc.</td>
			<td>NOA63, or NOA61.</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electron spin resonance micro-imaging of live species for oxygen mapping

פרוטוקול זה מתאר ספין האלקטרון תהודה (שקיעת דם) מיקרו הדמיה שיטת מיפוי תלת ממדי של רמות החמצן בסביבה המיידית של תאים חיים עם מיקרון בקנה מידה ברזולוציה 1. החמצן הוא אחד מולקולות החשובות ביותר במחזור החיים. היא משמשת acceptor מסוף אלקטרונים של זרחון חמצוני במיטוכונדריה והוא משמש בייצור של מינים חמצן תגובתי. מדידות של חמצן חשובה לחקר פונקציות המיטוכונדריה ואת חילוף החומרים, מסלולי איתות, ההשפעות של גירויים שונים, חדירות הממברנה, והבחנה המחלה. צריכת חמצן ולכן הוא סמן אינפורמטיבי של חילוף החומרים הסלולר, אשר החלים רחב במערכות ביולוגיות שונות המיטוכונדריה לתאים לאורגניזמים כולו. בשל חשיבותו, שיטות רבות פותחו עבור מדידות של חמצן במערכות חיים. ניסיונות נוכחי לספק ברזולוציה גבוהה הדמיה חמצן מתבססים בעיקר על הקרינה אופטיים ושיטות זרחני כי אינם מצליחים לספק תוצאות משביעות רצון כפי שהם מעסיקים בדיקות רעילות עם תמונה גבוהה ורגישות חמצן נמוכה. שקיעת דם, אשר מודד את האות בדיקות פאראמגנטיים אקסוגניים במדגם, ידוע לספק מדידות מדויקות מאוד של ריכוז החמצן. במקרה טיפוסי, מדידות שקיעת דם המפה הרחבת lineshape של בדיקה ו / או רגיעה בזמן קיצור כי הם קשורים ישירות לריכוז חמצן המקומית. (החמצן הוא פאראמגנטיים, לכן כאשר מתנגשות עם החללית פאראמגנטיים אקסוגניים, זה קוצר פעמים הרפיה שלה.) באופן מסורתי, אלו סוגים של ניסויים מתבצעות עם רזולוציה נמוכה, מילימטר בקנה מידה שקיעת דם הדמיה חיות קטנות. כאן אנו מראים כיצד שקיעת דם הדמיה יכולה גם להתבצע בהיקף מיקרון עבור הבדיקה של דגימות חי קטן. שקיעת דם מיקרו הדמיה היא מתודולוגיה חדשה יחסית המאפשרת רכישה של אותות שקיעת דם מרחבית נפתרה עם רזולוציה מתקרב 1 מיקרון בטמפרטורת החדר 2. המטרה העיקרית של נייר פרוטוקול זה היא להראות כיצד השיטה החדשה, יחד עם חמצן רגיש בדיקות החדש שפותח, יכול להיות מיושם על מיפוי של רמות חמצן בדגימות לחיות קטנות. ברזולוציה מרחבית של ~ 30 x 30 x 100 מיקרומטר הוא הוכיח, עם רגישות הקרוב מיקרו ריכוז החמצן ותת רגישות femtomole חמצן מוחלט לכל voxel. השימוש שקיעת דם מיקרו הדמיה למיפוי החמצן ליד התאים משלים את הטכניקות הקיימות כיום מבוססות על מיקרו אלקטרודות או פלואורסצנטי / זרחני. יתר על כן, עם החללית פאראמגנטיים נכונה, זה יהיה גם ישים בקלות עבור תאיים חמצן מיקרו הדמיה, יכולת אשר שיטות אחרות למצוא קשה מאוד להשיג.

Watch this Scientific Journal Video about Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping at JoVE.com

Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

פרוטוקול זה מתאר שיטה הדמיה תלת ממדי מיקרון בקנה מידה של ריכוז החמצן בסביבה המיידית של תאים חיים במיקרוסקופ על ידי ספין האלקטרון תהודה.

אלקטרונים ספין תהודה מיקרו הדמיה המינים Live עבור מיפוי חמצן

This protocol describes an electron spin resonance (ESR) micro-imaging method for three-dimensional mapping of oxygen levels in the immediate environment ...

electron-spin-resonance-micro-imaging-live-species-for-oxygen

Research

JoVE Journal

Biology

22.2K Views.  The Technion, Israel Institute of Technology. פרוטוקול זה מתאר שיטה הדמיה תלת ממדי מיקרון בקנה מידה של ריכוז החמצן בסביבה המיידית של תאים חיים במיקרוסקופ על ידי ספין האלקטרון תהודה.

Video: Electron Spin Resonance Micro-imaging of Live Species for Oxygen Mapping

A Noninvasive Hair Sampling Technique to Obtain High Quality DNA from Elusive Small Mammals

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using noninvasive sampling techniques to investigate population genetics and demography of wild populations1. This approach has proven to be especially useful when dealing with rare or elusive species2. While a number of these methods have been developed to sample hair, feces and other biological material from carnivores and medium-sized mammals, they have largely remained untested in elusive small mammals. In this video, we present a novel, inexpensive and noninvasive hair snare targeted at an elusive small mammal, the American pika (Ochotona princeps). We describe the general set-up of the hair snare, which consists of strips of packing tape arranged in a web-like fashion and placed along travelling routes in the pikas&#x2019; habitat. We illustrate the efficiency of the snare at collecting a large quantity of hair that can then be collected and brought back to the lab. We then demonstrate the use of the DNA IQ system (Promega) to isolate DNA and showcase the utility of this method to amplify commonly used molecular markers including nuclear microsatellites, amplified fragment length polymorphisms (AFLPs), mitochondrial sequences (800bp) as well as a molecular sexing marker. Overall, we demonstrate the utility of this novel noninvasive hair snare as a sampling technique for wildlife population biologists. We anticipate that this approach will be applicable to a variety of small mammals, opening up areas of investigation within natural populations, while minimizing impact to study organisms.

We present a noninvasive sampling approach to efficiently collect hair samples from elusive small mammals, as shown for the American pika. We demonstrate the utility of this method by extracting DNA from sampled hair and amplifying several types of molecular markers commonly used in studies of wildlife ecology and conservation.

שיער פולשנית דגימה טכניקה לקבל DNA באיכות גבוהה מ יונקים קטנים החמקמק

Noninvasive genetic sampling approaches are becoming increasingly important to study wildlife populations. A number of studies have reported using ...

Detection of Nitric Oxide and Superoxide Radical Anion by Electron Paramagnetic Resonance Spectroscopy from Cells using Spin Traps

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in unregulated concentrations are detrimental to cell viability1, 2. While living systems have evolved with endogenous and dietary antioxidant defense mechanisms to regulate ROS generation, ROS are produced continuously as natural by-products of normal metabolism of oxygen and can cause oxidative damage to biomolecules resulting in loss of protein function, DNA cleavage, or lipid peroxidation3, and ultimately to oxidative stress leading to cell injury or death4. 
Superoxide radical anion (O2&bull;-) is the major precursor of some of the most highly oxidizing species known to exist in biological systems such as peroxynitrite and hydroxyl radical. The generation of O2&bull;- signals the first sign of oxidative burst, and therefore, its detection and/or sequestration in biological systems is important. In this demonstration, O2&bull;- was generated from polymorphonuclear neutrophils (PMNs). Through chemotactic stimulation with phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), PMN generates O2&bull;- via activation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase5. 
Nitric oxide (NO) synthase which comes in three isoforms, as inducible-, neuronal- and endothelial-NOS, or iNOS, nNOS or eNOS, respectively, catalyzes the conversion of L- arginine to L-citrulline, using NADPH to produce NO6. Here, we generated NO from endothelial cells. Under oxidative stress conditions, eNOS for example can switch from producing NO to O2&bull;- in a process called uncoupling, which is believed to be caused by oxidation of heme7 or the co-factor, tetrahydrobiopterin (BH4)8.
There are only few reliable methods for the detection of free radicals in biological systems but are limited by specificity and sensitivity. Spin trapping is commonly used for the identification of free radicals and involves the addition reaction of a radical to a spin trap forming a persistent spin adduct which can be detected by electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy. The various radical adducts exhibit distinctive spectrum which can be used to identify the radicals being generated and can provide a wealth of information about the nature and kinetics of radical production9.
The cyclic nitrones, 5,5-dimethyl-pyrroline-N-oxide, DMPO10, the phosphoryl-substituted DEPMPO11, and the ester-substituted, EMPO12 and BMPO13, have been widely employed as spin traps--the latter spin traps exhibiting longer half-lives for O2&bull;- adduct. Iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 is commonly used to trap NO due to high rate of adduct formation and the high stability of the spin adduct14.

Electron paramagnetic resonance (EPR) spectroscopy was employed to detect nitric oxide from bovine aortic endothelial cells and superoxide radical anion from human neutrophils using iron (II)-N-methyl-D-glucamine dithiocarbamate, Fe(MGD)2 and 5,5-dimethyl-1-pyroroline-N-oxide, DMPO, respectively.

זיהוי של תחמוצת החנקן אניון קיצוני superoxide ידי ספקטרוסקופיה פאראמגנטיים אלקטרונים תהודה בין תאים באמצעות מלכודות ספין

Reactive nitrogen/oxygen species (ROS/RNS) at low concentrations play an important role in regulating cell function, signaling, and immune response but in ...

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or eliminated either catalytically or spontaneously. Due to the short life spans of most ROS and the diversity of their sources and subcellular localizations, a complete picture can be obtained only by careful measurements using a combination of protocols. Here, we present a set of three different protocols using OxyBurst Green (OBG)-coated beads, or dihydroethidium (DHE) and Amplex UltraRed (AUR), to monitor qualitatively and quantitatively various ROS in professional phagocytes such as Dictyostelium. We optimised the beads coating procedures and used OBG-coated beads and live microscopy to dynamically visualize intraphagosomal ROS generation at the single cell level. We identified lipopolysaccharide (LPS) from E. coli as a potent stimulator for ROS generation in Dictyostelium. In addition, we developed real time, medium-throughput assays using DHE and AUR to quantitatively measure intracellular superoxide and extracellular H2O2 production, respectively.

We adapted a set of protocols for the measurement of reactive oxygen species (ROS) that can be applied in various amoeba and mammalian cellular models for qualitative and quantitative studies.

איתור, חזותי וquantitating הדור של מינים חמצן תגובתי במערכת מודל אמבה

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular biology has been greatly fueled by the discovery of noncoding RNAs as major players in post-transcriptional regulation. Such a revolutionary perspective has been accompanied and triggered by the development of powerful technologies for profiling short RNAs expression, both at the high-throughput level (genome-wide identification) or as single-candidate analysis (steady state accumulation of specific species). Although several state-of-art strategies are currently available for dosing or visualizing such fleeing molecules, Northern Blot assay remains the eligible approach in molecular biology for immediate and accurate evaluation of RNA expression. It represents a first step toward the application of more sophisticated, costly technologies and, in many cases, remains a preferential method to easily gain insights into RNA biology. Here we overview an efficient protocol (Enhanced Northern Blot) for detecting weakly expressed microRNAs (or other small regulatory RNA species) from Drosophila melanogaster whole embryos, manually dissected larval/adult tissues or in vitro cultured cells. A very limited amount of RNA is required and the use of material from flow cytometry-isolated cells can be also envisaged.

Enhanced Northern Blot Detection of Small RNA Species in Drosophila Melanogaster

The aim of this publication is to visualize and discuss the operative steps of an Enhanced Northern Blot protocol on RNA extracted from Drosophila melanogaster embryos, cells, and tissues. This protocol is particularly useful for the efficient detection of small RNA species.

Enhanced צפון כתם איתור של RNA קטן מינים ב<em&gt; תסיסנית</em

The last decades have witnessed the explosion of scientific interest around gene expression control mechanisms at the RNA level. This branch of molecular ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

אפיון של אירועים קלציפיקציה שימוש אופטי חיה מיקרוסקופית אלקטרונים טכניקות בתוך ימית תולעת-שפופרת

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using short synthetic DNA fragments or plasmids as templates and then extrapolating the results to the whole genome. Alternatively, the number of ribonucleotides present in a genome may be estimated using alkaline gels or Southern blots. More recent in vivo approaches employ Next-generation sequencing allowing genome-wide mapping of ribonucleotides, providing the position and identity of embedded ribonucleotides. However, they do not allow quantitation of the number of ribonucleotides which are incorporated into a genome. Here we describe how to simultaneously map and quantitate the number of ribonucleotides which are incorporated into human mitochondrial DNA in vivo by Next-generation sequencing. We use highly intact DNA and introduce sequence specific double strand breaks by digesting it with an endonuclease, subsequently hydrolyzing incorporated ribonucleotides with alkali. The generated ends are ligated with adapters and these ends are sequenced on a Next-generation sequencing machine. The absolute number of ribonucleotides can be calculated as the number of reads outside the recognition site per average number of reads at the recognition site for the sequence specific endonuclease. This protocol may also be utilized to map and quantitate free nicks in DNA and allows adaption to map other DNA lesions that can be processed to 5&#180;-OH ends or 5&#180;-phosphate ends. Furthermore, this method can be applied to any organism, given that a suitable reference genome is available. This protocol therefore provides an important tool to study DNA replication, 5&#180;-end processing, DNA damage, and DNA repair.

Here we describe a method amenable to simultaneously quantitate and genome-wide map ribonucleotides in highly intact DNA at single-nucleotide resolution, combining enzymatic cleavage of genomic DNA with its alkaline hydrolysis and subsequent 5&#180;-end sequencing.

מיפוי בו זמנית, כימות של Ribonucleotides ב- DNA מיטוכונדריאלי אנושי

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

חוקרים את מזיקה אפקטים של נמוך לחץ פלזמה עיקור על ההישרדות של Bacillus subtilis הנבגים באמצעות Live התא מיקרוסקופ

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Stimulation of Stem Cell Niches and Tissue Regeneration in Mouse Skin by Switchable Protoporphyrin IX-Dependent Photogeneration of Reactive Oxygen Species In Situ

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient production of ROS in situ efficiently activates cell proliferation in stem cell niches and stimulates tissue regeneration as strongly manifested through the acceleration of burn healing and hair follicle growth processes. The protocol is based on a regulatable photodynamic treatment that treats the tissue with precursors of the endogenous photosensitizer protoporphyrin IX and further irradiates the tissue with red light under tightly controlled physicochemical parameters. Overall, this protocol constitutes an interesting experimental tool to analyze ROS biology.

The aim of this protocol is to induce transient in vivo production of nonlethal levels of reactive oxygen species (ROS) in mouse skin, further promoting physiological responses in the tissue.

גירוי נישות תאי גזע והתחדשות רקמות בעור עכבר על ידי פוטוגנרציה תלוית פרוטופורפירין IX ניתנת להחלפה של מיני חמצן תגובתי באתרם

Here, we describe a protocol to induce switchable in vivo photogeneration of endogenous reactive oxygen species (ROS) in mouse skin. This transient ...

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not accurately capture the effects of agrochemical exposure on honey bee queens. As the sole producer of fertilized eggs inside a honeybee colony, the queen is arguably the most important single member of a functioning colony unit. Therefore, understanding how agrochemicals affect queen health and productivity should be considered a critical aspect of pesticide risk assessment. Here, an adapted method is presented to expose honey bee queens and worker queen attendants to agrochemical stressors administered through a worker diet, followed by tracking egg production in the laboratory and assessing first instar eclosion using a specialized cage, referred to as a Queen Monitoring Cage. To illustrate the method&#39;s intended use, results of an experiment in which worker queen attendants were fed diet containing sublethal doses of imidacloprid and effects on queens were monitored are described.

This protocol was developed to enhance the understanding of how agrochemicals affect honey bee (Apis mellifera) reproduction by establishing methods to expose honey bee queens and their worker caretakers to agrochemicals in a controlled, laboratory setting and carefully monitoring their relevant responses.

הערכת הסיכון האגרוכימי למלכות דבורת הדבש המויזות

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...