עבודה זו נתמכה על ידי אגודת מקס פלנק.

1. יצירת פלסמידים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Subclone cDNAs עבור כל חלבון של עניין לשני וקטורי pLuc וpYFP, ​​תוך שימוש בטכניקות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות (איור 1). לפרוטוקולים מפורטים רואה הירוק ואח&#39; 13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף כל הבונה כדי לוודא שהחלבונים של עניין נמצאים במסגרת עם רצף לוק / YFP ללא קודונים להפסיק להתערב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע מבחני פונקציונליים כמו רצוי כדי לאשר שחלבוני ההיתוך לשמור על פעילות ביולוגית. במקרה שהוצג כאן לוקליזציה subcellular של חלבוני היתוך YFP הובררה על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך פלסמידים ביטוי לחלבוני בקרה מתאימים לוק וYFP על ידי הנדסת אותות מיקוד הרלוונטיים לוקטורי ביטוי pLuc וpYFP. במקרה שהוצג כאן, ליצור מבני לוק וYFP ממוקדים גרעיניים על ידי הוספת אות לוקליזציה גרעינית לוקטורי pLuc וpYFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשותמבנה שליטה חיובי שבו לוק וYFP הם התמזגו לתוך פוליפפטיד אחד. במקרה שהוצג כאן, לייצר שליטה חיובית שבו רצף קידוד YFP מוכנס לתוך וקטור pLuc. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר פלסמיד מילוי ניטראלי לשמש כדי להשוות את המסה של ה-DNA בתערובות transfection. השתמש פלסמיד שאין לו אמרגן אוקריוטים ועל כן יהיה תעתיק לא פעיל בתאי יונקים, כגון וקטור שיבוט חיידקים. </li></ol> 2. הכנה של ה-DNA תערובות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את הריכוז של כל פלסמידים שתוארו בסעיף 1 המבוסס על הספיגה ב 260 ננומטר (יחידת ספיגת 1 היא שווה ערך ל50 מיקרוגרם / מיליליטר של ה-DNA). לקבוע את המסה המולקולרית של כל פלסמיד על ידי הכפלת מספר זוגות בסיסים ידי 650 דא. השתמש בריכוז ומסה מולקולרית כדי לחשב את הריכוז טוחנת של כל הכנת פלסמיד. לדלל את הכנות פלסמיד דנ&quot;א לריכוז של 36 ננומטר. אלה יהיו המניות עובדותשישמש להכנת תערובות DNA עבור transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תערובת המכילה DNA שליטת 1,800 ננוגרם של פלסמיד מילוי בנפח סופי של μl 20 של מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תערובת DNA שליטה המכילה 5 μl של מבנה pLuc השליטה. הוספת פלסמיד המילוי להביא הכולל המוני DNA ל1,800 ננוגרם. מוסיף מים כדי להביא את הנפח הסופי 20 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תערובת DNA שליטה המכילה 5 μl של מבנה pLuc שליטה ו5 μl של מבנה pYFP שליטה. הוספת פלסמיד המילוי להביא הכולל המוני DNA ל1,800 ננוגרם. מוסיף מים כדי להביא את הנפח הסופי 20 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין תערובת DNA שליטה המכילה 5 μl של מבנה שליטה חיובי. הוספת פלסמיד המילוי להביא הכולל המוני DNA ל1,800 ננוגרם. מוסיף מים כדי להביא את הנפח הסופי 20 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ה-DNA הבא מתערבבת לבדיקת homodimerization של חלבון של העניין, X. לכל ערבוב של ה-DNA לשלב 5 μl של pLuc הרלוונטי לבנות ו5 μl של pyFP לבנות. הוספת פלסמיד המילוי להביא הכולל המוני DNA ל1,800 ננוגרם. מוסיף מים כדי להביא את הנפח הסופי 20 μl. א) pLuc שליטה וpYFP-X B) pLuc-X וpYFP בקרה ג) pLuc-X ו-X pYFP </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו את ה-DNA הבא מתערבבת לבדיקת אינטראקציה בין זוג החלבונים של עניין, X וי &#39;לכל תערובת DNA לשלב 5 μl של pLuc הרלוונטי לבנות ו5 μl של pYFP לבנות. הוספת פלסמיד המילוי להביא הכולל המוני DNA ל1,800 ננוגרם. מוסיף מים כדי להביא את הנפח הסופי 20 μl. א) pLuc שליטה וpYFP-X B) pLuc-X וpYFP בקרה ג) pLuc שליטה וpYFP-Y D) pLuc-Y וpYFP בקרה E) pLuc-X ו-Y pYFP F) pLuc-Y ו-X pYFP </li></ol> 3. Transfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר subconfluent HEK293 תאים מבקבוק 75 2 סנטימטר. לדלל 10% מהתאים בסך הכל ל13 מיליליטר של מדיום התרבות. לוותר 130 μl של השעיה תא לתוך באר כל לבןברור תחתית צלחת תרבית רקמת 96 היטב. תרבות תאים ל24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את מספר הבארות להיות transfected על ידי הכפלת מספר תערובות-DNA על ידי 3. תביא מדיום סרום ללא תרבות לטמפרטורת חדר. הכן תערובת אב המכילה 6.3 μl של מדיום סרום ללא ו0.18 מגיב transfection μl לכל טוב. מערבבים על ידי vortexing ו דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תערובת transfection על ידי הוספת 2 μl תמהיל ה-DNA כדי 20 μl של תמהיל אב סרום ללא בינוני / transfection מגיב. לא מערבולת. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transfect שלוש בארות עם כל תערובת transfection מחלק 6.5 μl של תערובת transfection לכל טוב. תרבות התאים לשעה 36-48 נוספת. </li></ol> 4. מדידה של ברט איתותים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר מצע לוציפראז לחיות תאים ב34 מ&quot;ג / מיליליטר בDMSO ידי vortexing. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל מצע לוציפראז לחיות תאים מחדש ב1:1,000 בעמ הבינוני דילול המצעמחדש לחמם 37 ° C. לאפשר 50 μl של מדיום דילול מצע לכל טוב. מערבולת לערבב. משקע עלול להיווצר, אבל לא יפריע לassay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את מדיום התרבות מצלחת 96 היטב. לוותר 50 μl של מצע לוציפראז לחיות תאים מדולל היטב כל אחד. תרבות תאים לפחות 2 שעה (עד 24hr). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המכסה מצלחת 96 היטב דגירה את הצלחת ל10 דקות בטמפרטורת חדר בתוך luminometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד פליטה מלוק וYFP אחד טובה בכל פעם. למדוד פליטה מלוק באמצעות מסנן חוסם אורכי גל ארוכים יותר מאשר 470 ננומטר. למדוד פליטה מYFP באמצעות מסנן להקה עובר 500-600 ננומטר. שלב את אותות פליטה מעל 10 שניות. </li></ol> 5. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע קריאות פליטת לוק מ3 הבארות שקיבלו רק את הפלסמיד המילוי. לחסר ערך זה מכל קריאות פליטת לוק האחרות כדי לייצר ערכי פליטה מופחת רקע לוק.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע קריאות פליטת YFP מ3 הבארות שקיבלו רק את הפלסמיד המילוי. לחסר ערך זה מכל קריאות פליטת YFP האחרות כדי לייצר ערכי פליטה מופחת רקע YFP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל טוב, יש לחלק את ערך הפליטה מופחת רקע YFP ידי ערך הפליטה מופחת רקע לוק לתת יחס ברט שלא תוקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממוצע יחסי ברט שלא תוקנו משלוש הבארות שהיו transfected עם רק פלסמיד pLuc השליטה. לחסר ערך זה מכל יחסי ברט לא מתוקנים האחרים כדי לתת את יחס ברט המתוקן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל אחת מהקבוצות שנותרו ביחסי ברט מתוקנים, ממוצע הערכים משלוש בארות transfected לקבל יחס ברט סופי. </li></ol>

<ol>
	<li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research.">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).</li><li>Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+protein+complexes+using+mass+spectrometry.">Analysis of protein complexes using mass spectrometry.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 645-654 (2007).</li><li>Berggard, T., Linse, S., James, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+detection+and+analysis+of+protein-protein+interactions.">Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions.</a> Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).</li><li>Ciruela, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+methods+in+the+study+of+protein-protein+interactions+in+living+cells.">Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells.</a> Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).</li><li>Pfleger, K. D., Eidne, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+insights+into+protein-protein+interactions+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Illuminating insights into protein-protein interactions using bioluminescence resonance energy transfer.</a> BRET). Nat Methods. 3, 165-174 (2006).</li><li>Boute, N., Jockers, R., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+resonance+energy+transfer+in+high-throughput+screening.">The use of resonance energy transfer in high-throughput screening.</a> BRET versus FRET. Trends Pharmacol Sci. 23, 351-354 (2002).</li><li>Pfleger, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+bioluminescence+resonance+energy+transfer+(eBRET)+for+monitoring+prolonged+protein-protein+interactions+in+live+cells.">Extended bioluminescence resonance energy transfer (eBRET) for monitoring prolonged protein-protein interactions in live cells.</a> Cell Signal. 18, 1664-1670 (2006).</li><li>Kocan, M., Dalrymple, M., Seeber, R., Feldman, B., Pfleger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+BRET+technology+for+the+monitoring+of+agonist-induced+and+agonist-independent+interactions+between+GPCRs+and+&#946;-arrestins.">Enhanced BRET technology for the monitoring of agonist-induced and agonist-independent interactions between GPCRs and &#946;-arrestins.</a> Frontiers in Endocrinology. 1, (2011).</li><li>Boute, N., Pernet, K., Issad, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+the+activation+state+of+the+insulin+receptor+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">Monitoring the activation state of the insulin receptor using bioluminescence resonance energy transfer.</a> Mol Pharmacol. 60, 640-645 (2001).</li><li>Perroy, J., Pontier, S., Charest, P. G., Aubry, M., Bouvier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+ubiquitination+in+living+cells+by+BRET.">Real-time monitoring of ubiquitination in living cells by BRET.</a> Nat Methods. 1, 203-208 (2004).</li><li>Roduit, R., Escher, P., Schorderet, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+DNA-binding+domain+of+NR2E3+affect+in+vivo+dimerization+and+interaction+with+CRX.">Mutations in the DNA-binding domain of NR2E3 affect in vivo dimerization and interaction with CRX.</a> PLoS One. 4, (2009).</li><li>Deriziotis, P., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenomics+of+speech+and+language+disorders:+the+road+ahead.">Neurogenomics of speech and language disorders: the road ahead.</a> Genome Biol. 14, 204 (2013).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).</li><li>Lai, C. S., Fisher, S. E., Hurst, J. A., Vargha-Khadem, F., Monaco, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+forkhead-domain+gene+is+mutated+in+a+severe+speech+and+language+disorder.">A forkhead-domain gene is mutated in a severe speech and language disorder.</a> Nature. 413, 519-523 (2001).</li><li>Fisher, S. E., Scharff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXP2+as+a+molecular+window+into+speech+and+language.">FOXP2 as a molecular window into speech and language.</a> Trends Genet. 25, 166-177 (2009).</li><li>Graham, S. A., Fisher, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decoding+the+genetics+of+speech+and+language.">Decoding the genetics of speech and language.</a> Curr Opin Neurobiol. 23, 43-51 (2013).</li><li>O'Roak, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exome+sequencing+in+sporadic+autism+spectrum+disorders+identifies+severe+de+novo+mutations.">Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations.</a> Nat Genet. 43, 585-589 (2011).</li><li>Horn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FOXP1+deletions+in+three+unrelated+patients+with+mental+retardation+and+significant+speech+and+language+deficits.">Identification of FOXP1 deletions in three unrelated patients with mental retardation and significant speech and language deficits.</a> Hum Mutat. 31, 1851-1860 (2010).</li><li>Hamdan, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+mutations+in+FOXP1+in+cases+with+intellectual+disability,+autism,+and+language+impairment.">De novo mutations in FOXP1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment.</a> Am J Hum Genet. 87, 671-678 (2010).</li><li>Talkowski, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequencing+chromosomal+abnormalities+reveals+neurodevelopmental+loci+that+confer+risk+across+diagnostic+boundaries.">Sequencing chromosomal abnormalities reveals neurodevelopmental loci that confer risk across diagnostic boundaries.</a> Cell. 149, 525-537 (2012).</li><li>Li, S., Weidenfeld, J., Morrisey, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+and+DNA+binding+activity+of+the+Foxp1/2/4+family+is+modulated+by+heterotypic+and+homotypic+protein+interactions.">Transcriptional and DNA binding activity of the Foxp1/2/4 family is modulated by heterotypic and homotypic protein interactions.</a> Mol Cell Biol. 24, 809-822 (2004).</li><li>MacDermot, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+FOXP2+truncation+as+a+novel+cause+of+developmental+speech+and+language+deficits.">Identification of FOXP2 truncation as a novel cause of developmental speech and language deficits.</a> Am J Hum Genet. 76, 1074-1080 (2005).</li><li>Vernes, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+analysis+of+mutations+implicated+in+a+human+speech+and+language+disorder.">Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder.</a> Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

העיצוב של מבני ביטוי חלבון ההיתוך הוא שלב קריטי בהקמת assay ברט. בניסויים שהוצגו כאן, החלבונים של העניין היו התמזגו C-הסופית של בלוציפראז או YFP. זה גם אפשרי, וייתכן שיהיה צורך, הפתיל חלבונים N-הסופית של בלוציפראז / YFP. עבור חלק מחלבונים, התכה עשויה להתקבל רק בבית או N-או C-הסופ...

גם הצמדה קלאסית והדור הבא רצף ניתוחים של הפרעות אדם מגלים את הרלוונטיות הקלינית של חלבונים מעורבים במגוון רחב של מסלולים ביולוגיים. זה קורה לעתים קרובות כי, לפני זיהוי שלהם במחקרים מסוג זה, יש כבר חקירה מועטת או ללא התפקיד הביולוגי של החלבונים האלה. השדרה פורה אחד להתחיל לחקור את התפקוד הביולוגי של חלבון של עניין היא לזהות אילו חלבונים אחרים הוא מקיים אינטראקציה עם בהקשר הפיזיולוגי שלו. אפיון רשתות מולקולריות באופן זה מספק תובנות לגבי המסלולים הביולוגיים העומדים בבסיס הפנוטיפ האנושי. ההקרנה בקנה מידה גדולה ביותר בשימוש לעתים קרובות גישות לזיהוי שותפי אינטראקציה מועמד לחלבונים של עניין הן שמרי הקרנת שתי היברידית 1 ופרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסת 2. שיטות אלו יכולות להיות מוצלחות מאוד שבמרמזות חלבוני אינטראקציה פוטנציאל, אבל arדואר חשוף לתוצאות חיוביות כוזבות. לפיכך, אישור של אינטראקציה זוהתה על ידי שמרי שני היברידיים או הקרנת ספקטרומטריית מסה דורש אימות של האינטראקציה באמצעות טכניקה שנייה. בדרך כלל שיתוף immunoprecipitation או assay הנפתח משמש למטרה זו 3. אחד חסרונות של שימוש בטכניקות כגון לאימות הוא הדרישה לתמוגה תא, שהורסת את התנאים תאיים שעשויה להיות חיוני לשמירה על אינטראקציות חלבון מסוימות. חסרון שני הוא שאינטראקציות חלבון חלשות או חולפות עשויות להיות מופרים במהלך שלבי כביסה. יתר על כן, מבחני אלה דורשים ידיים על זמן משמעותיים, מוגבלים במספר הדגימות שניתן לעבד בו זמנית, ולעתים קרובות דורשים אופטימיזציה זמן רב של חומרים כימיים ופרוטוקולים. כדי להתגבר על חלק מהבעיות הקשורות לשיתוף immunoprecipitation ניסויים, כמה מבחני שפותחו על בסיס ניאון וbiolumחלבוני inescent שניתן להשתמש בתאים חיים. מבחני הראשונים מסוג זה היו מבוססים על הקרינה (או פורסטר) העברת התהודה אנרגיה (סריג), ההעברה לא מקרינה אנרגיה בין שני חלבוני ניאון עם פליטה חופפות וספקטרום עירור 4. היעילות של העברת אנרגיה היא מאוד מרחק תלוי, ולכן התבוננות בתופעת סריג דורשת כי fluorophores תורם acceptor להיות בקרבת מקום. לבדיקת אינטראקציה בין שני חלבונים של עניין, חלבון אחד מתבטא כהתמזגות עם fluorophore התורם (החלבון פלואורסצנטי נפוץ ציאן; CFP), והשני כהתמזגות עם fluorophore acceptor (החלבון פלואורסצנטי נפוץ צהוב; YFP). אינטראקציה בין שני החלבונים של עניין עשויה להביא fluorophores תורם acceptor מספיק הקרוב ללהתרחש העברת אנרגיה, מה שיגרום לעלייה במדידת הפליטה של ​​אור מביחס acceptor YFP לתורם CFP. FRET היה מוצלח באיתור אינטראקציות בין חלבונים בתאים חיים 4. החסרון העיקרי של שימוש בסריג לאיתור חלבונים אינטראקציות הוא הדרישה לתאורה חיצונית לעירור של fluorophore התורם. תוצאות תאורה חיצוניות ברקע גבוה באות הפליטה, עירור לא רצוי של acceptor, וphotobleaching של שניהם תורמים וfluorophores acceptor. השפעות אלה מפחיתים את הרגישות של assay לאיתור חלבונים אינטראקציות. שינוי של assay סריג שמתגבר על הבעיה של רקע גבוה מתאורה חיצונית הוא העברת פליטת אור התהודה האנרגיה 5,6 assay (ברט). במערכת ברט fluorophore התורם הוא הוחלף על ידי אנזים בלוציפראז. לכן האנרגיה לעירור של fluorophore acceptor נוצרה בתוך המערכת על ידי החמצון של מצע לוציפראז, עיבוד תאורה חיצונית מיותרת. ברובתצורה נפוצה של assay זה, התורם הוא Renilla reniformis לוציפראז וacceptor הוא YFP (לדיון של תורם חלופי וחלבונים acceptor לראות Pfleger et al. 5). בהתאם לכך, במערכת זו, חלבון של עניין הוא קבע את לוציפראז וחלבון באופן פוטנציאלי, באינטראקציה לYFP, או להיפך. Assay ברט דורש תוספת של coelenterazine כמצע ללוציפראז. בגלל coelenterazine הוא תא חדיר, ניתן לבצע מבחני ברט בתאים חיים. עם זאת, coelenterazine ילידים אינם יציב בתמיסה מימית, ואת פירוט האנזים עצמאי של coelenterazine הן מפחית את ריכוז המצע זמין עבור assay ומייצר autoluminescence, אשר מפחיתה את הרגישות של מדידות של פעילות לוציפראז. השימוש בברט בתאים חיים כבר בהנחייתם של פיתוח coelenterazines המוגן, שהם יציבים בתמיסה מימית אבל הם ביקע ידי esterase cytosolicים לאחר דיפוזיה על פני קרום התא כדי לייצר coelenterazine הפעיל בתוך התא 7. בעקבות תוספת של מצע לתאים לבטא לוציפראז וחלבוני YFP-Fusion, העברת אנרגיה וכתוצאה מאינטראקציות בין חלבונים היא לכמת על ידי ניטור פליטה מלוציפראז וYFP. מכיוון שניתן לנטר אינטראקציות חלבון ישירות בתאים חיים בצלחות רב גם, assay ברט מהווה שיטה פשוטה, ניתן להרחבה לאימות אינטראקציות המשוערות שהיא עלות והזמן יעיל. בנוסף לאימות interactors המשוער שזוהה במחקרי הקרנת proteomic, מערכת ברט יכולה לשמש גם לinteractors מועמד מבחן הנובע ממחקרים ביוכימיים ומבניים מוקדמים בחלבון של עניין. ברגע שהקיום של אינטראקציה בין חלבונים כבר נקבע (בין אם באמצעות assay ברט או בטכניקות אחרות), קיימת פוטנציאל לassay ברט להיות EMPloyed נוסף כדי לאפיין את האינטראקציה. לדוגמא, ניתן למפות אזורי האינטראקציה על ידי יצירת גרסאות מקוצצות של החלבונים, ואת מעורבותם של שאריות ספציפיות באינטראקציה ניתן להדגים על ידי יצירת מוטציות נקודתיות. יתר על כן, השפעת הוויסות של שינויי posttranslational או מולקולות קטנות (כגון סמים או ligands) על אינטראקציות בין חלבונים יכולה להיחקר 8-10. Assay ברט יש גם פוטנציאל גדול לחקר מוטציות שזוהו ב-DNA מטופל. במקרים בהם תפקיד סיבתי מוטציה כבר נקבע, שחקר את ההשפעה של המוטציה על אינטראקציות בין חלבונים באמצעות ברט עשוי לחשוף עוד על אטיולוגיה המולקולרית של פנוטיפ 11. מאז כניסתו של מתודולוגיות הדור הבא של רצף, זה נפוץ יותר ויותר במשך כמה מוטציות שעלולים להיות מזיקות להיות מזוהות בתוך פרט, ובמקרה זה ברור שהם releVant לפנוטיפ 12. במצב זה assay ברט עשוי להיות בעל ערך בהערכת ההשפעה של מוטציות על תפקוד חלבון ומכאן את הרלוונטיות שלהם להפרעה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1333">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Nanodrop 8000</td>
			<td style="width:123px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:780px;">Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">96 microwell plates, flat bottom, white</td>
			<td>Greiner Bio One</td>
			<td>655098</td>
			<td style="width:780px;">White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:276px;">Infinite F200Pro plate reader with control software</td>
			<td>TECAN</td>
			<td></td>
			<td style="width:780px;">Use the &#39;Blue 1&#39; and &#39;Green 1&#39; filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pLuc, pYFP, positive control plasmid</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasmids available from the authors upon request.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pGEM-3Zf(+)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2271</td>
			<td>Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEK293 cells</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>85120602</td>
			<td>Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">DMEM, high glucose, with phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966</td>
			<td style="width:780px;">This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 &#176;C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.</td>
		</tr>
		<tr height="67">
			<td height="67" style="height:67px;">DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21063</td>
			<td style="width:780px;">This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 &#176;C waterbath before use.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">OptiMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31985</td>
			<td style="width:780px;">OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10270</td>
			<td>For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;">GeneJuice transfection reagent</td>
			<td>Novagen</td>
			<td>70967</td>
			<td style="width:780px;">If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer&#39;s instructions.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td style="width:780px;">Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">EnduRen live-cell substrate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E6481</td>
			<td style="width:780px;">Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 &#176;C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer

מבחני מבוססים על פליטת אור התהודה העברת אנרגיה (ברט) לספק אמצעי רגיש ואמין כדי לפקח על אינטראקציות בין חלבונים בתאים חיים. ברט הוא ההעברה לא מקרינה אנרגיה מאנזים לוציפראז &#39;תורם&#39; לחלבון פלואורסצנטי &#39;acceptor&#39;. בתצורה הנפוצה ביותר של assay זה, התורם הוא לוציפראז reniformis Renilla וacceptor הוא חלבון צהוב פלורסנט (YFP). בגלל היעילות של העברת אנרגיה היא מאוד מרחק תלוי, התבוננות בתופעת ברט דורשת שהתורם acceptor להיות בקרבת מקום. לבדיקת אינטראקציה בין שני חלבונים של עניין בתאי יונקים בתרבית, חלבון אחד מתבטא כהתמזגות עם לוציפראז והשני כהתמזגות עם YFP. אינטראקציה בין שני החלבונים של עניין עשויה להביא תורם acceptor מספיק קרוב ללהתרחש העברת אנרגיה. לעומת טכניקות אחרות לחקירת חלבונים בteractions, assay ברט הוא רגיש, דורש ידיים על קצת זמן וכמה חומרים כימיים, והוא מסוגל לזהות אינטראקציות שהם חלשים, ארעיים, או תלויים בסביבה ביוכימית נמצאת בתוך תא חי. לכן גישה אידיאלית למאשרים אינטראקציות המשוערות שהוצעו על ידי שמרי שני היברידיים או ספקטרומטריית מסת מחקרי פרוטאומיקה, ובנוסף הוא מותאם היטב לאזורי מיפוי אינטראקציה, בוחן את ההשפעה של שינויים שלאחר translational על אינטראקציות בין חלבונים, ו בוחן את ההשפעה של מוטציות שזוהו ב-DNA מטופל.

העיקרון של assay ברט המתואר באיור 2. התקנת assay בשימוש בכל הניסויים שהוצגו כאן מתוארת באיור 3. זיהוי של אות ברט חזקה מתאי transfected עם חלבון היתוך לוציפראז-YFP אישר כי העברת אנרגיה הייתה ניתן לצפייה בהתקנה ניסיונית זה (איור 4). <p class="jove_content" style=";text-alig...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer at JoVE.com

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

אינטראקציות בין החלבונים הן יסוד לכל התהליכים התאיים. באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה, את האינטראקציה בין זוג החלבונים יכולה להיות במעקב בתאים חיים ובזמן אמת. יתר על כן, ההשפעות של מוטציות שעלולים להיות פתוגניים ניתן להעריך.

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

investigating-protein-protein-interactions-live-cells-using

Research

JoVE Journal

Biology

22.8K Views.  Max Planck Institute for Psycholinguistics.  אינטראקציות בין החלבונים הן יסוד לכל התהליכים התאיים. באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה, את האינטראקציה בין זוג החלבונים יכולה להיות במעקב בתאים חיים ובזמן אמת. יתר על כן, ההשפעות של מוטציות שעלולים להיות פתוגניים ניתן להעריך. 

Video: Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Microfluidic Co-culture of Epithelial Cells and Bacteria for Investigating Soluble Signal-mediated Interactions

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has been proposed that the microenvironment that the pathogen encounters in the commensal layer is important in determining the extent of colonization. Current culture methods for investigating pathogen colonization are not well suited for investigating this hypothesis as they do not enable co-culture of bacteria and epithelial cells in a manner that mimics the GI tract microenvironment. Here we describe a microfluidic co-culture model that enables independent culture of eukaryotic cells and bacteria, and testing the effect of the commensal microenvironment on pathogen colonization. The co-culture model is demonstrated by developing a commensal Escherichia coli biofilm among HeLa cells, followed by introduction of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) into the commensal island, in a sequence that mimics the sequence of events in GI tract infection.

This protocol describes a microfluidic co-culture model for simultaneous and localized culture of epithelial cells and bacteria. This model can be used for investigating the role of different soluble molecular signals on pathogenesis as well as screen the effectiveness of putative probiotic bacterial strains.

Microfluidic משותף התרבות של תאים וחיידקים אפיתל לחקירת מסיסים אותות בתיווך אינטראקציות

The human gastrointestinal (GI) tract is a unique environment in which intestinal epithelial cells and non-pathogenic (commensal) bacteria coexist. It has ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

חקירת רקמות ו איברים ספציפיים התגובות Phytochrome באמצעות FACS בסיוע נייד מסוג פרופיל ביטוי ספציפי ארבידופסיס thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular environment. The Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay1 allows researchers to visualize protein-protein interactions in living cells and has become an essential research tool. This assay is based on the facilitated association of two fragments of a fluorescent protein (GFP) that are each fused to a potential interacting protein partner. The interaction of the two protein partners would facilitate the association of the N-terminal and C-terminal fragment of GFP, leading to fluorescence. For plant researchers, onion epidermal cells are an ideal experimental system for conducting the BiFC assay because of the ease in obtaining and preparing onion tissues and the direct visualization of fluorescence with minimal background fluorescence. The Helios Gene Gun (BioRad) is commonly used for bombarding plasmid DNA into onion cells. We demonstrate the use of Helios Gene Gun to introduce plasmid constructs for two interacting Arabidopsis thaliana transcription factors, SEUSS (SEU) and LEUNIG HOMOLOG (LUH)2 and the visualization of their interactions mediated by BiFC in onion epidermal cells.

Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

This article illustrates how to properly use the BioRad Helios Gene Gun to introduce plasmid DNA into onion epidermal cells and how to test for protein-protein interactions in onion cells based on the principle of Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC)

Bimolecular השלמה פלואורסצנטי (BiFC) Assay עבור אינטראקציה בין חלבונים בתאים בצל באמצעות אקדח הליוס ג&#39;ין

Investigation of gene function in diverse organisms relies on knowledge of how the gene products interact with each other in their normal cellular ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

In-vivo גילוי של חלבונים אינטראקציות על מיקרו-בדוגמת משטחים

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

הדמיה חלבונים אינטראקציות In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Real-time Monitoring of Ligand-receptor Interactions with Fluorescence Resonance Energy Transfer

FRET is a process whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to a ground-state acceptor molecule through long-range dipole-dipole interactions1. In the present sensing assay, we utilize an interesting property of PDA: blue-shift in the UV-Vis electronic absorption spectrum of PDA (Figure 1) after an analyte interacts with receptors attached to PDA2,3,4,7. This shift in the PDA absorption spectrum provides changes in the spectral overlap (J) between PDA (acceptor) and rhodamine (donor) that leads to changes in the FRET efficiency. Thus, the interactions between analyte (ligand) and receptors are detected through FRET between donor fluorophores and PDA. In particular, we show the sensing of a model protein molecule streptavidin. We also demonstrate the covalent-binding of bovine serum albumin (BSA) to the liposome surface with FRET mechanism. These interactions between the bilayer liposomes and protein molecules can be sensed in real-time. The proposed method is a general method for sensing small chemical and large biochemical molecules. Since fluorescence is intrinsically more sensitive than colorimetry, the detection limit of the assay can be in sub-nanomolar range or lower8. Further, PDA can act as a universal acceptor in FRET, which means that multiple sensors can be developed with PDA (acceptor) functionalized with donors and different receptors attached on the surface of PDA liposomes.

We demonstrate FRET between conjugated polymer polydiacetylene (PDA) and fluorophore attached to the surface of PDA liposomes for the sensing of biomolecules. PDA liposomes also contained receptor molecules on their surfaces for biomolecules to be used as probes. Ligand-receptor interactions lead to changes in the FRET efficiency between the fluorophore and PDA which is the basis of the sensing mechanism.

ניטור בזמן אמת של אינטראקציות יגנד רצפטור עם פלואורסצנטי תהודת העברת אנרגיה

FRET is a process  whereby energy is non-radiatively transferred from an excited donor molecule to  a ground-state acceptor molecule through long-range ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

חלבונים אינטראקציות דמיינו ידי bimolecular הקרינה complementation בProtoplasts הטבק ועלים

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה Plasmon Surface (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

זיהוי אתרי אינטראקציה בין חלבונים באמצעות פפטיד מערכים

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...