1. Ex-אובו תרבות לפרוטוקול: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור ביצים עוף מופרית <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצי תרנגולת מופרות ניתן לאחסן 13 ° C עד 5 ימים לפני הדגירה ללא ייזום ופיתוח. מקרר יין אדום יכול לשמור על טמפרטורה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצי דגירה בצד הקהה את בלחות של 60% החממה מתמיד עם נדנדה רציפה 37.5 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ערסלים (איור 1 א) <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו ¾ של 9 כוסות גרם פלסטיק עם מים סטריליים חם. רגיל 9 גרם כוס יש קוטר החלק העליון של 8 ס&quot;מ. מצאנו כי גודל זה היה הכי מתאים ליישום תרבות זמן רב המוצג כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור על 20 ס&quot;מ נצמד. Circumferentially להדביק על גבי כוס על ידי הנחת גומייה סביב. פלסטיק צריך להתפשט על גבי המים. חותכים את עודפי פלסטיק סביב הלהקה. מצאנו נצמד להיות המתאים ביותר עבור יישום זה מכיוון שהוא מונע הידבקות של חלמון, וכתוצאה מכך פיצול חלמון במהלך ההובלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נגבו את הפלסטיק עם kimwipes (קימברלי קלארק, Inc) הרטובות עם אתנול 70%. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ביצים באינקובטור לאחר 72 שעות של דגירה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר ביצים ידי ניגוב פני השטח עם kimwipes אתנול 70% הרטובות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הביצים אופקית עבור 1-2 דקות על מיקום תקין של העובר (איור 1b). קרטון ביצים יכול לשמש המטילה ביצי אופקית. עוברים יסתובב העליון אחרי 1-2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת העוברים על ערסלים בסביבה נקייה מחיידקים במנדף זרימה למינרית. <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת קצה חד (כמו קצה דלי מתכת או כוס זכוכית), הקש את הביצה בעדינות עד שלא שקע קטן על החלק התחתון של הביצה (איור 1 ג&#39;). זכרו, העובר ממוקם על upperside. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את אגודליו משני צדי השקע ולשלוף את הקליפות בנפרד אופקית (איור 1d). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את החלמון עם העובר וכן אלבומין על גבי ערסל (דמות 1e). אלבומין תספק סביבה לחה סביב החלמון לספוג זעזועים הנגרמת על ידי העברת מערכת וכן הוא מספק תזונה לעובר על נוהלי תרבות ארוכה. מים מתחת הערסל יבטיח העובר יישאר במקביל לקרקע במהלך התחבורה לשמש מוליך חום במהלך הדמיה אם תנור זרימת מים משמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העובר צריך להיות כבר ממוקמת על אם ההעברה נעשית כראוי. אם לא, להשתמש unsharp, חפץ סטרילי (טיפ בלאנט כלומר, מספריים מעוקל סגורה) ו ללטף directionally החלמון כזה העובר מסתובב למעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים בקוטר 10 ס&quot;מ צלחת פטרי על גבי הכוס לאטום את העובר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים כוס תרבות לתוך להגדיר את החממה על 37.5 ° C. אם חממה נייד משמש, הצבת ספטמבר 1-2 כוסות גרם מלא מים מזוקקים שומר על לחות ב ~ 60% (איור 1f). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם עוברים culturing מעבר ליום עובריים 7, חתיכות קליפת כתוש צריך להיות מפוזרים ברחבי הפריפריה של העובר כמקור לסידן להתפתחות עצם התבגרות. </li></ol> אביזרים וציוד חממה מחוץ הדמיה / מניפולציה: אמבט מים במחזור נבנה בבית כדי לשמור על טמפרטורת הדגירה בעוד הדמיה או מניפולציה (איור 3). אמבט מים שיכולים להתאים את הגביע מחובר דרך צינורות בגודל המתאים למאגר מים. דוד התנגדות מחממת את המים במאגר אשר מוסדר באופן ידני על ידי ביצוע טמפרטורת המים. משאבת המים מזרימה את המים. ייצוג Pictoral מתאר להקל הדמיה באמצעות ultrasongraphy / מיקרוסקופיה florescent (איור 3). <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. הכנת ערסל והעברת עוברים עוף ערסלים. <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. תוצאות נציג -. שונה עוף בשלב עוברי גדל באמצעות טכניקה לשעבר תרבות אובו עוברים מבית HH 17 ואילך ניתן לגדל באמצעות טכניקה זו. <img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. תמונות סכמטי ונציג של מערכת מחזור מים הפועל בשיתוף עם מערכת לשעבר אובו התרבות לשמור עוברים בטמפרטורת פיתוח אידיאלי. 2. יישומים נבחרים: I. Microinjection זו תרבות העובר מתאים ליישומים microinjection איפה הפתרונות צריכים להיות מוזרק אל vasculature הדמיה בניגוד מבוסס (כלומר, מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מיקרו שחושב טופוגרפיה וכו &#39;) (איור 4). להלן פרוטוקול microinjection: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את appara הזרקהTus <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופנה משך 0.75 כוס מזהה צינורות לתוך נימי microneedles קצה משופעים באמצעות microforge. גודל קצה הנדרשת תלויה בשיעור וריד קוטר / זרימה היעד הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חברו את המזרק 0.03 צינורות מזהה אינץ סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את צינורות עם הפתרון להיות מוזרק ולחבר את microneedle אל הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את microneedle על micromanipulator לבין מזרק לבעל מזרק או משאבת מזרק. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים מים סטריליים בגביע ובכך להעלות את העובר. חווינו כי חדירה נכונה של המחט לתוך כלי דם (כלומר, כלי vitelline), חדירה אופקית הכרחי. זה דורש העובר להיות על המטוס זהה את שולי הכוס. <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוציאו את הגומייה מחזיק את הפלסטיק מתחת העובר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרם צד אחד של הפלסטיק בעדינות להוסיף קצת מים סטריליים כדי הגביע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Secure את הגומייה על הפלסטיק שוב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק הפתרון כלי עובריים. מניסיוננו, כאשר פתרון מוזרק לכלי vitelline, microneedles צריכה להיות ה כ 1 / 10 בגודל של קוטר כלי לשמור זלוף ויעיל מבלי לגרום לדימום. <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משאבה הפתרון microneedle הבטחת אין היווצרות של בועות אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את קצה microneedle על כלי שנבחר. עבור כלי vitelline, בחירת אזור מזלג ייתן שטח מרבי לחדור אל הספינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דחוף את המחט לכיוון הספינה. הכלי יהיה הראשון לחזור. לאחר המחט חודרת, להתחיל זלוף. צבעו של הדם הזורם צריך לשנות עם זלוף. אם משנים את צבעם אינו נראה, המחט עשוי חדרו מתוך הספינה. במקרה כזה, לאט לאט לחזור microneedle ובמקביל שאיבה פתרון עד לשנות צבע כלי נתפסת. לאחר זלוף תושלם, לסגת microneedle מתוך הספינה. </li></ol></li></ol><img src="/files/ftp_upload/2154/2125fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4: Microinjection של פלורסנט לצבוע לתוך כלי הדם של העובר לשעבר אובו חומוס מתורבת. השנייה. נוהל Microsurgical - קשירת פרוזדורים שמאלי זו ההגדרה לשעבר אובו תרבות אידיאלית עבור יישומי ביצוע הניתוח על עוברי אפרוח שכן הוא מספק נגישות מלאה העובר. להלן פרוטוקול טכניקה דוגמה, עזב קשירת פרוזדורים (LAL) (איור 5). ההליך מבוצע כ 24 שעות לתוך התקופה תרבות (HH24): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הבוהן קשרים ~ 0.5 מ&quot;מ בקוטר 10-0 באמצעות תפר ניילון כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר, מקומי להסיר את קרום כוריוני ו allantoic על העובר והרם את העובר מהחלק האחורי כדי לסובב את זה במאונך כזה כי הצד השמאלי של העובר גלוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים בסדר, להסיר את קרום הלב על אטריום שמאל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את הקשר על אטריום שמאל ולהדק אותו. הקשר צריך להיות קשור כדי לאסור ~ 75% של זרימת הדם המקורית בצד שמאל. חותכים את הקצוות של הקשר עם microscissors ובזהירות להסיר ולסלק תפר עודף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את העובר בחזרה לכיוון המקורי (צד ימין למעלה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שולטת שאם יהיה כרוך בפרוצדורה זהה אך תפר תהיה רק ​​עבר ולא קשור. טיפול אפקטיבי LAL (75 מועקה%) יאושר ב 24 שעות שלאחר הניתוח, עוברים נפסל ייכללו. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2154/2154fig5.jpg" alt="איור 5" /> איור 5:. מלאה עובר שמאל פרוזדורים חומוס ligated החץ מראה את הפרוזדורים שמאל, שזה בערך 75% קטן יותר בעובר ligated.

<ol>
	<li>Zamir, E. A., Czirok, A., Cui, C., Little, C. D., Rongish, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesodermal+cell+displacements+during+avian+gastrulation+are+due+to+both+individual+cell-autonomous+and+convective+tissue+movements.">Mesodermal cell displacements during avian gastrulation are due to both individual cell-autonomous and convective tissue movements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19806-19811 (1980).</li><li>Ehrman, L. A., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+regulation+in+the+heart+forming+region+of+avian+embryos.">Lack of regulation in the heart forming region of avian embryos.</a> Dev Biol. 207, 163-175 (1999).</li><li>Clark, E. B., Hu, N., Rosenquist, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+conotruncal+constriction+on+aortic-mitral+valve+continuity+in+the+stage+18,+21+and+24+chick+embryo.">Effect of conotruncal constriction on aortic-mitral valve continuity in the stage 18, 21 and 24 chick embryo.</a> Am J Cardiol. 53, 324-327 (1984).</li><li>deAlmeida, A., McQuinn, T., Sedmera, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+ventricular+preload+is+compensated+by+myocyte+proliferation+in+normal+and+hypoplastic+fetal+chick+left+ventricle.">Increased ventricular preload is compensated by myocyte proliferation in normal and hypoplastic fetal chick left ventricle.</a> Circ Res. 100, 1363-1370 (2007).</li><li>Nakamura, H., Funahashi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+DNA+into+chick+embryos+by+in+ovo+electroporation.">Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation.</a> Methods. 24, 43-48 (2001).</li><li>Butcher, J. T., McQuinn, T. C., Sedmera, D., Turner, D., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transitions+in+early+embryonic+atrioventricular+valvular+function+correspond+with+changes+in+cushion+biomechanics+that+are+predictable+by+tissue+composition.">Transitions in early embryonic atrioventricular valvular function correspond with changes in cushion biomechanics that are predictable by tissue composition.</a> Circ Res. 100, 1503-1511 (2007).</li><li>McQuinn, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-frequency+ultrasonographic+imaging+of+avian+cardiovascular+development.">High-frequency ultrasonographic imaging of avian cardiovascular development.</a> Dev. Dyn. 236, 3503-3513 (2007).</li><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies.">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. , (2007).</li><li>Auerbach, R., Kubai, L., Knighton, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+procedure+for+the+long-term+cultivation+of+chicken+embryos.">A simple procedure for the long-term cultivation of chicken embryos.</a> Dev Biol. 41, 391-394 (1974).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

גישה אופטית ניסויים בעוברים העופות הוא מאתגר בשל אילוצים של קליפת ביצה. Windowing משמעותי מגבילה את מספר microvessels נגיש גישות הזרקת microsurgical 8. כתוצאה מכך רק עוברי מוקדם ניתן להשפיע תצפית רציפה אינו אפשרי. מוקדם לשעבר אובו תרבויות באמצעות צלחות פטרי היו של שימוש מו?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Fertile white Leghorn chicken eggs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Model GB1, Avery Incubators, Hugo CO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Saran Wrap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kimwipes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Kimberly-Clark, Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rubber bands</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Warm sterile water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>9 oz plastic cup</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>100 mm diameter Petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1602N thermal air</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>GQF Manufacturing CO, Savannah GA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescein-conjugated dextran (2 MDa, 1% w/v in phosphate buffered saline)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma Aldrich Inc.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microforge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Glassworx, Inc, St Louis MO</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glass capillary tubes (0.75 mm ID)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Sarasota FL</td>
<td>Model M3301L</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fluorescent microscopy</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Zeiss</td>
<td>Z20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fine 55-forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments, Sarasota FL</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10-0 nylon surgical suture</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ethicon</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1mm OD</td>
</tr>
<tr>
<td>3 mL syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>200 &mu;L pipetter and pipette tips</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an ex-ovo chicken embryo culture system suitable for imaging and microsurgery applications

הבנת יחסי הגומלין בין גורמים גנטיים microenvironmental כי ההתפתחות העוברית כונן רגיל פגום מהותית על גילוי אסטרטגיות טיפוליות חדשות. התקדמויות טכנולוגיית הדמיה אפשרו חקירה כמותית של הארגון והתבגרות של התוכנית הגוף, אבל המורפוגנזה עובריים בשלב מאוחר יותר הוא פחות ברור. עוברי עוף הם בעלי חיים בעלי חוליות אטרקטיבי מודל המערכת עבור יישום זה בגלל קלות של תרבות מניפולציה כירורגית. עוברי מוקדם יכול להיות מתורבת לזמן קצר על טבעות נייר סינון, המאפשר גישה אופטיים המלא ל דפוסים התא מחקרים 1,2 הגורל. לימוד תהליכים התפתחותיים מתקדמות כגון המורפוגנזה לב מבוצעים באופן מסורתי דרך חלון של קליפת 3-5, אבל הטכניקה הזו מגבילה גישה אופטית בשל גודל חלון. אנחנו קודם לכן פיתחו שיטה פשוטה לתרבות עוברים כל לשעבר אובו על סירות לשקול משושה עד 10 ימים, מה שאיפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה באמצעות אולטרסאונד 6,7. תרבויות אלו היו קשים בתחבורה, להגביל את סוגי כלי הדמיה עבור ניסויים לחיות. כאן אנו מציגים שיפור מערכת קרב פחות תרבות עם תא, חסכונית סביבתי נייד. ביצים סדוקות על ערסל נוצר על ידי קרום פוליאוריטן (נצמד) מודבקת circumferentially על כוס פלסטיק מלאה חלקית עם מים סטריליים. מידות ההיקף והעומק של הערסל שניהם קריטי לשמור על מתח הפנים, בעוד המכניקה של הערסל מים מתחת עזר לשכך ויברציות המושרה על ידי התחבורה. טביעת רגל קטנה במחזור אמבט מים פותחה גם כדי לאפשר בקרת טמפרטורה רציף במהלך הניסויים. אנו מדגימים את היכולת עוברי התרבות בדרך זו לפחות במשך 14 ימים ללא פגם morphogenic או עיכוב להעסיק זו מערכת microsurgical מספר יישומי הדמיה.

Watch this Scientific Journal Video about An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications at JoVE.com

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

במאמר זה, אנו מציגים מתודולוגיה פשוטה כדי לאפשר לטווח ארוך<em&gt; לשעבר אובו</em&gt; העובר העופות תרבות. טכניקה זו היא אידיאלית עבור ניסויים האורך הדורשים נגישות אופטי מלא ו / או תחבורה סטרילי בעוברים העופות.

לשעבר אובו העובר עוף התרבות מתאים ליישומים הדמיה microsurgery מערכת

Understanding the relationships between genetic and microenvironmental factors that drive normal and malformed embryonic development is fundamental for ...

an-ex-ovo-chicken-embryo-culture-system-suitable-for-imaging

Research

JoVE Journal

Biology

An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

22.9K Views.  Cornell University. במאמר זה, אנו מציגים מתודולוגיה פשוטה כדי לאפשר לטווח ארוך לשעבר אובו העובר העופות תרבות. טכניקה זו היא אידיאלית עבור ניסויים האורך הדורשים נגישות אופטי מלא ו / או תחבורה סטרילי בעוברים העופות.

Video: An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications

Windowing Chicken Eggs for Developmental Studies

The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has allowed for experiments to map cell fates using several approaches, including chick quail chimeras and focal dye labeling.  In addition, it allows for molecular perturbations of several types, including placement of protein-coated beads and introduction of plasmid DNA using in ovo electroporation.  These experiments have yielded important data on the development of the central and peripheral nervous systems.  For many of these studies, it is necessary to open the eggshell and reclose it without perturbing the embryo's growth.  The embryo can be examined at successive developmental stages by re-opening the eggshell.  While there are several excellent methods for opening chicken eggs, in this article we demonstrate one method that has been optimized for long survival times.  In this method, the egg rests on its side and a small window is cut in the shell.  After the experimental procedure, the shell is used to cover the egg for the duration of its development.  Clear plastic tape overlying the eggshell protects the embryo and helps retain hydration during the remainder of the incubation period.  This method has been used beginning at two days of incubation and has allowed survival through mature embryonic ages.

The ease of accessibility of the embryo has allowed for experiments to map cell fates using several approaches, including chick quail chimeras and focal dye labeling. In this article we demonstrate one egg preparation method that has been optimized for long survival times.

עוף Windowing ביצים למחקרים התפתחותיים

The study of development has been greatly aided by the use of the chick embryo as an experimental model.  The ease of accessibility of the embryo has ...

Bioelectric Analyses of an Osseointegrated Intelligent Implant Design System for Amputees

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform routine activities, but prosthetic suspensions using traditional socket technology can prove to be cumbersome and uncomfortable for a person with limb loss.  Moreover, for those with high proximal amputations, limited residual limb length may prevent exoprosthesis attachment all together. Osseointegrated implant technology is a novel operative procedure which allows firm skeletal attachment between the host bone and an implant. Preliminary results in European amputees with osseointegrated implants have shown improved clinical outcomes by allowing direct transfer of loads to the bone-implant interface.  Despite the apparent advantages of osseointegration over socket technology, the current rehabilitation procedures require long periods of restrictive load bearing prior which may be reduced with expedited skeletal attachment via electrical stimulation.  The goal of the osseointegrated intelligent implant design (OIID) system is to make the implant part of an electrical system to accelerate skeletal attachment and help prevent periprosthetic infection. To determine optimal electrode size and placement, we initiated proof of concept with computational modeling of the electric fields and current densities that arise during electrical stimulation of amputee residual limbs.  In order to provide insure patient safety, subjects with retrospective computed tomography scans were selected and three dimensional reconstructions were created using customized software programs to ensure anatomical accuracy (Seg3D and SCIRun) in an IRB and HIPAA approved study.  These software packages supported the development of patient specific models and allowed for interactive manipulation of electrode position and size. Preliminary results indicate that electric fields and current densities can be generated at the implant interface to achieve the homogenous electric field distributions   required to induce osteoblast migration, enhance skeletal fixation and may help prevent periprosthetic infections.  Based on the electrode configurations experimented with in the model, an external two band configuration will be advocated in the future.

There is a need to develop alternative prosthesis attachment due to limb loss attributed to vascular occlusive diseases and trauma. The goal of the work is to introduce an osseointegrated intelligent implant design system to increase skeletal fixation and reduce periprosthetic infection rates for patients needing osseointegrated technology.

ניתוח Bioelectric של מערכת Osseointegrated שתל Intelligent Design עבור קטועי גפיים

The projected number of American amputees is expected to rise to 3.6 million by 2050.  Many of these individuals depend on artificial limbs to perform ...

Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works

Chicken eggs in the early phase of breeding are between in vitro and in vivo systems and provide a vascular test environment not only to study angiogenesis but also to study tumorigenesis. After the chick chorioallantoic membrane (CAM) has developed, its blood vessel network can be easily accessed, manipulated and observed and therefore provides an optimal setting for angiogenesis assays. Since the lymphoid system is not fully developed until late stages of incubation, the chick embryo serves as a naturally immunodeficient host capable of sustaining grafted tissues and cells without species-specific restrictions. In addition to nurturing developing allo- and xenografts, the CAM blood vessel network provides a uniquely supportive environment for tumor cell intravasation, dissemination, and vascular arrest and a repository where arrested cells extravasate to form micro metastatic foci.
For experimental purposes, in most of the recent studies the CAM was exposed by cutting a window through the egg shell and experiments were carried out in ovo, resulting in significant limitations in the accessibility of the CAM and possibilities for observation and photo documentation of effects. When shell-less cultures of the chick embryo were used1-4, no experimental details were provided and, if published at all, the survival rates of these cultures were low. We refined the method of ex ovo culture of chick embryos significantly by introducing a rationally controlled extrusion of the egg content. These ex ovo cultures enhance the accessibility of the CAM and chick embryo, enabling easy in vivo documentation of effects and facilitating experimental manipulation of the embryo. This allows the successful application to a large number of scientific questions: (1) As an improved angiogenesis assay5,6, (2) an experimental set up for facilitated injections in the vitreous of the chick embryo eye7-9, (3) as a test environment for dissemination and intravasation of dispersed tumor cells from established cell lines inoculated on the CAM10-12, (4) as an improved sustaining system for successful transplantation and culture of limb buds of chicken and mice13 as well as (5) for grafting, propagation, and re-grafting of solid primary tumor tissue obtained from biopsies on the surface of the CAM14.
In this video article we describe the establishment of a refined chick ex ovo culture and CAM assay with survival rates over 50%. Besides we provide a step by step demonstration of the successful application of the ex ovo culture for a large number of scientific applications. 
Daniel S. Dohle, Susanne D. Pasa, and Sebastian Gustmann contributed equally to this study.

Chick ex ovo Culture and ex ovo CAM Assay: How it Really Works

The chick chorioallantoic membrane (CAM) is a unique, naturally immunodeficient supportive culture environment to study angiogenesis and tumorigenesis. This video article demonstrates the different steps in chick ex ovo culture, application of potentially angiogenic substances and successful inoculation of tumor cells and tissues on the surface of the CAM.

אפרוח אובו לשעבר תרבות אובו לשעבר CAM Assay: איך זה באמת עובד

Chicken eggs in the early phase of breeding are between in vitro and in vivo systems and provide a vascular test environment not only to study ...

Xenotransplantation of Human Stem Cells into the Chicken Embryo

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the behavior of cells in a standardized in vivo environment. The main advantages of the chicken embryo include low cost, high accessibility, ease of surgical manipulation and lack of a fully developed immune system. Xenotransplantation into chicken embryos can provide valuable information about cell proliferation, differentiation and behavior, the responses of cells to signals in defined embryonic tissue niches, and tumorigenic potential. Transplanting cells into chicken embryos can also be a step towards transplantation experiments in other animal models. Recently the chicken embryo has been used to evaluate the neurogenic potential of human stem and progenitor cells following implantation into neural anlage1-6. In this video we document the entire procedure for transplanting human stem cells into the developing central nervous system of the chicken embryo. The procedure starts with incubation of fertilized eggs until embryos of the desired age have developed. The eggshell is then opened, and the embryo contrasted by injecting dye between the embryo and the yolk. Small lesions are made in the neural tube using microsurgery, creating a regenerative site for cell deposition that promotes subsequent integration into the host tissue. We demonstrate injections of human stem cells into such lesions made in the part of the neural tube that forms the hindbrain and the spinal cord, and into the lumen of the part of the neural tube that forms the brain. Systemic injections into extraembryonic veins and arteries are also demonstrated as an alternative way to deliver cells to vascularized tissues including the central nervous system. Finally we show how to remove the embryo from the egg after several days of further development and how to dissect the spinal cord free for subsequent physiological, histological or biochemical analyses.

In this paper we present a method for transplanting human stem cells into various regions of the central nervous system of the chicken embryo. This provides an in vivo model for assessing the proliferation and differentiation of various types of human stem cells in embryonic tissue environments.

Xenotransplantation בתאי גזע אנושיים לתוך העובר עוף

The chicken embryo is a classical animal model for studying normal embryonic and fetal development and for xenotransplantation experiments to study the ...

The Method of Rodent Whole Embryo Culture using the Rotator-type Bottle Culture System

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development and growth of mammalian embryos are critically dependent on the function of the placenta, WEC technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages during embryonic day (E) 6.5-E12.5 in the mouse or E8.5-E14.5 in the rat 2, 3, 4. In WEC, we can directly target desired areas of embryos using fine glass capillaries because embryos can be manipulated under the microscope. Therefore, rodent WEC is very useful technique when we want to study dynamic developmental processes of postimplanted mammalian embryos. Up to date, several types of WEC systems have been developed 1. Among those, the rotator-type bottle culture system is most popular and suitable for long-term culture of embryos at midgestation, i.e., after E9.5 and E11.5 in the mouse and rat, respectively 1. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat WEC after E12.5 using a refined model of the original rotator system, which was designed by New and Cockroft 5, 6, and introduce various applications of WEC technique for studies in mammalian developmental biology.

Whole embryo culture technique allows us to culture mouse and rat embryos ex vivo condition during limited periods corresponding to midgestation stages. In this video protocol, we demonstrate our standard procedures of rat whole embryo culture after E12.5 using the rotator-type bottle culture system.

שיטת התרבות העובר שלמים מכרסמים באמצעות Rotator מסוג התרבות מערכת בקבוק

Whole embryo culture (WEC) technique has been developed in 1950's by New and his colleagues, and applied for developmental biology 1. Although development ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

מערכת סגורה Cell תרבות פרוטוקול באמצעות כלי HYPERStack עם טכנולוגיה חומר חדיר גז

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

The chicken embryo provides an excellent model system for studying gene function and regulation during embryonic development. In ovo electroporation is a powerful method to over-express exogenous genes or down-regulate endogenous genes in vivo in chicken embryos1. Different structures such as DNA plasmids encoding genes2-4, small interfering RNA (siRNA) plasmids5, small synthetic RNA oligos6, and morpholino antisense oligonucleotides7 can be easily transfected into chicken embryos by electroporation. However, the application of in ovo electroporation is limited to embryos at early incubation stages (younger than stage HH20 - according to Hamburg and Hamilton)8 and there are some disadvantages for its application in embryos at later stages (older than stage HH22 - approximately 3.5 days of development). For example, the vitelline membrane at later stages is usually stuck to the shall membrane and opening a window in the shell causes rupture of the vessels, resulting in death of the embryos; older embryos are covered by vitelline and allantoic vessels, where it is difficult to access and manipulate the embryos; older embryos move vigorously and is difficult to control the orientation through a relatively small window in the shell.
In this protocol we demonstrate an ex ovo electroporation method for gene transfer into chicken embryos at late stages (older than stage HH22). For ex ovo electroporation, embryos are cultured in Petri dishes9 and the vitelline and allantoic vessels are widely spread. Under these conditions, the older chicken embryos are easily accessed and manipulated. Therefore, this method overcomes the disadvantages of in ovo electroporation applied to the older chicken embryos. Using this method, plasmids can be easily transfected into different parts of the older chicken embryos10-12.

Gene Transfer into Older Chicken Embryos by ex ovo Electroporation

A method of gene transfer into chicken embryos at later incubation stages (older than Hamburger and Hamilton stage (HH) 22) is described. This method overcomes disadvantages of in ovo electroporation applied to older chicken embryos and is a useful technique to study gene function and regulation at older developmental stages.

ין העברת לעוברי עוף מבוגרים יותר על ידי<em&gt; לג&#39;ימי לשעבר</em&gt; Electroporation

The chicken embryo provides an  excellent model system for studying gene function and regulation during  embryonic development. In ovo electroporation is ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

עכבר עוברי פיתוח במערכת סרום ללא תרבות שלמה עובר

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

<em&gt; Ex vivo</em&gt; מערכת תרבות ללמוד התפתחות בלוטת התריס

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Preparation of Rat Serum Suitable for Mammalian Whole Embryo Culture

Mammalian whole embryo culture (WEC) is a widely used technique for examining pharmacological toxicity in developing mouse and rat embryos and for investigating the mechanisms of developmental processes. Immediately centrifuged (IC) rat serum is commonly used for WEC and is essential for the growth and development of cultured mouse and rat embryos ex vivo. For the culture of midgestation embryos (i.e., E8.0-12.5 for the mouse, and E10.0-14.5 for the rat), 100% rat serum is the best media for supporting the growth of the embryo ex vivo. To prepare rat serum suitable for WEC, the collected blood should be centrifuged immediately to separate the blood cells from the plasma fraction. After centrifugation, the fibrin clot forms in the upper layer; this clot should be squeezed gently using a pair of sterile forceps and subsequently centrifuged to completely separate the blood cells from the serum. In this video article, we demonstrate our standard protocol for the preparation of optimal IC rat serum, including blood collection from the abdominal aorta of male rats and extraction of the serum by centrifugation.

Mammalian whole embryo culture (WEC) is widely used in teratology and developmental biology. Immediately centrifuged rat serum is commonly provided as a medium for both mouse and rat WEC. In this video, we demonstrate our standard protocol for the preparation of high-quality rat serum suitable for mammalian WEC.