הפרוטוקול שלנו מציג שיטה יעילה ביותר וקלה לשחזור לכימות DNA חד-גדילי, המהווה סמן של לחץ שכפול במגוון קווי תאים. בנוסף, הפשטות שלו מאפשרת יישומים ומסכים בעלי תפוקה גבוהה. בפרט, שיטה זו מאפשרת כימות מהיר של לחץ שכפול, סימן היכר של מספר סוגי סרטן השחלות.
זה גם מקובל על תוכנת ניתוח אוטומטי המארח, עוד יותר להגדיל את היעילות. דנ"א חד-גדילי נחשב כיום באופן פעיל כסמן ביולוגי לתגובה לכימותרפיה המכוונת למסלולי תיקון DNA. לפיכך, שיטה זו ישימה מאוד בתרחיש זה.
עקה שכפול קיימת מעבר להקשרים של סרטן השחלות או BRCA1, סרטן חסר BRCA2. ולכן, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של סוגי תאים אחרים או הקשרים של מחלות. כדי להתחיל, הפוך החלקות כיסוי מצופות פוליליזין על ידי הוספת החלקות כיסוי בקוטר 12 מ"מ ותמיסת פוליליזין לצינור חרוטי 50 מיליליטר, והנח על נדנדה למשך 15 דקות.
שאפו את הפתרון על מכסה מנוע של תרבית רקמות. שטפו את החלקות הכיסוי על ידי הוספת מים סטריליים, והניחו את הצינור המכיל את החלקות הכיסוי בחזרה על הנדנדה למשך חמש דקות. לאחר שטיפת הכיסוי מחליקה שלוש פעמים, שאפו מים מהצינור ופזרו את החלקות הכיסוי על כלי סטרילי.
שאפו את המים הנותרים ותנו להם להתייבש במכסה המנוע של תרבית הרקמה למשך שעה או עד שלא יישארו טיפות מים. לאחר הייבוש, אוטמים את התבשיל עם פרפילם ומניחים אותו על 4 מעלות צלזיוס. כדי למנוע ניתוק של התאים מחליקי הכיסוי במהלך שלב החילוץ שלפני המיצוי, הניחו פתק כיסוי מצופה פוליליזין אחד בכל באר של צלחת בת 24 בארות.
ברגע שתאי OVCAR3 מגיעים למפגש של 70% עד 80%, שאפו את התווך מהצלחת ושטפו את התאים עם 5 עד 7 מיליליטר PBS. שאפו את PBS מהצלחת. לאחר שאיפת PBS, להוסיף 1 מיליליטר של 0.25% טריפסין ומניחים את המנה באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 8 עד 10 דקות או עד התאים להרים מתחתית הצלחת.
לאסוף את התאים עם 5 עד 10 מיליליטר של בינוני ולהוסיף את השעיית התא צינור חרוט. ספור את התאים באופן ידני עם hemocytometer באמצעות הליכים סטנדרטיים. לאחר מכן, לדלל את תרחיף התא, ולקבל מספר שיניב 70 עד 80% מפגש לאחר שלוש אוכלוסיות.
הוסף 1 מיליליטר של תרחיף תאים על פתקי כיסוי פוליליזין שהונחו בבארות של צלחת 24 בארות, וגדל את התאים בתווך התרבית בתנאים סטנדרטיים. לאחר הכפלת אוכלוסייה אחת, שאפו את המדיה הקיימת מהצלחת ופעמו את התאים עם 10 IdU מיקרומולרי עבור שתי הכפלות האוכלוסייה הבאות. כדי לקצור את התאים, החליפו את המדיום ב-0.5% PBSTx קר כקרח על קרח למשך חמש דקות.
לקיבוע תאים, יש לשאוף PBSTx ולדגור על התאים במשך 15 דקות עם 3% פרפורמלדהיד בטמפרטורת החדר. לאחר שלוש עד ארבע שטיפות עם PBS, יש לשמור על תאים קבועים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. לאחר הקיבוע, יש לחדור לתאים באמצעות 0.5% PBSTx על קרח למשך חמש דקות, תוך הקפדה על כיסוי כל חלקת הכיסוי.
לאחר שטיפת התאים שלוש עד ארבע פעמים עם מיליליטר אחד של 0.2% PBST בטמפרטורת החדר, שאפו את ה-PBST וחסמו את הדגימות באמצעות 5% BSA שנעשו ב-PBS למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. עבור immunostaining, להכין תא אחיד על ידי הנחת מגבת נייר רטובה על Tupperware תחתית שטוחה. מכסים את מכסה הצלחת בעל 24 הבארות בפרפילם.
הניחו אותו בתא הלח והניחו את פתקי הכיסוי על מכסה הצלחת. הוסף 60 מיקרוליטר של נוגדן עכבר ראשוני מדולל נגד BrdU בחלק העליון של חלקת הכיסוי. לחלופין, כדי להפחית את הנוגדן מהתייבשות ולהשתמש בפחות נפח, הניחו טיפה של נוגדן מדולל על הפרפילם והפכו עליו את החלקת הכיסוי.
ואז לדגור במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, שואפים את הנוגדן העיקרי. החזירו את פתקי הכיסוי לצלחת בת 24 בארות ושטפו אותם עם 0.2% PBST ארבע פעמים.
מוסיפים נוגדן משני מדולל על הכיסוי כפי שהודגם קודם לכן, ודגרים במשך שעה בחושך בטמפרטורת החדר. תייג שקופית מיקרוסקופ והרכיב את החלקת הכיסוי על השקופיות עם אמצעי הרכבה DAPI. אחסנו שקופיות בחושך בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות אם יש צורך לרפא או להקשיח את אמצעי ההרכבה.
הגרעינים שמקורם בתאים שלא טופלו וטופלו בהידרוקסיאוריאה של 0.5 מילימולר הוכתמו והיו ניתנים לזיהוי בתעלות DAPI ו-IdU. ניתוח תמונות אלה מורכב מכימות מספר המוקדים בכל גרעין. מספר המוקדים פרופורציונלי למידת לחץ השכפול.
חשוב לקחת בחשבון את זמן ההכפלה של קו התאים המועדף מכיוון שזמן פעימת IdU עשוי להשתנות לתקופות הכפלה ארוכות או קצרות יותר. לחלופין, אנו יכולים לחקור תאים עבור חלבון שכפול A כדי לאשר את התוצאות ולהעריך תגובות שונות של עקה שכפול בתאים. טכניקה זו משמשת עבור קווי תאים רבים יחד עם כל גורם נזק לדנ"א כדי לבחון הצטברות של DNA מתוח יחיד.
לפיכך, שיטה זו נגישה וישימה.
