עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים DE018304, R01DE018281. KT נתמך על ידי GM07092 T32-34 ו - ידי מענק של אוניברסיטת צפון קרוליינה בצ&#39;אפל היל של הווארד יוז רפואי במכון (HHMI) באמצעות מד גראד לתוך היוזמה. מחשב נתמך על ידי T32 CA009156.

טרום מירנה מערכים qPCR פרופיל ניתן להגדיר בתור אוטומטי לחלוטין עם חופש לטקאן Evo רובוט (א) או על ידי ביד עם פיפטה מטריקס אלקטרוניקה רב (B). 1) מכינים את תערובת הורים, צלחות פריימר דגימות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות פריימר המכיל 186 זוגות פריימר בפורמט 96-היטב (כולל של 2 צלחות) בשעה 12:05 צריך להיות מאוחסן ב -80 ° C. הפשירי צלחות החוצה בטמפרטורת החדר, מערבולת בקצרה צנטריפוגות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את תערובת הורים, להפשיר SYBR גרין 2x מערבבים PCR בטמפרטורת החדר. התגובה של כל משתמש לערבב מאסטר 8ul עם פריימר 2ul. הרכב לערבב את אב לכל תגובה היא לערבב SYBR 4ul, 3ul מים PCR כיתה ו 10-20 ng DNA מדגם או cDNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור ההתקנה של כל צלחת פריימר 96-טוב, ארבעה צינורות לערבב אמן יהיה צורך. דוגמאות ניתן להפעיל 4 דגימות לכל צלחת (singlicate), 2 דוגמאות לכל צלחת (כפול) או מדגם יחיד ארבע פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו תערובת אמן על ידי שילוב, SYBR מים מדגם בכל אחד 4-2ml צינורות Eppendorf. הצינור אמור להכיל כל תערובת אמן מספיק כ 100 תגובות, המאפשר עודף עבור pipetting פסולת. וורטקס לערבב. </li></ol> א ההתקנה של assay טרום מירנה באמצעות לטקאן חופש Evo רובוט. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אתחול של הרובוט וטעינה של התוכנית Evoware, שטוף שלוש פעמים עם כל 30mls כדי לנקות מערכת של בועות האוויר יפריע pipetting דיוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת את הפלטפורמה הרובוט לכלול את הדברים הבאים: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית-384 גם צלחת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 96 גם פריימר צלחת (1) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאסטר מתערבב </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקת אקונומיקה המכיל 2% </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נוזל במיכל מלא מערכת </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזבוז רוקן מיכל </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין להפעיל רובוט אוטומטי על ידי בחירת &quot;הפעל&quot; פעמיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף התוכנית, להסיר 384-לאטום היטב צלחת עם נייר 480 איטום LightCycler ו צנטריפוגות בקצרה. המקום אטום צלחת 384 גם בעמדה 1 של המלון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור לשלב 2.2 וחזור על צלחת פריימר 2 מתערבב עם הורים חדשים צלחת 384, באר חדשה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת חתומה בעמדה 2 של המלון. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח תוכנית חדשה Evoware עבור טעינת Lightcycler מהמלון ובחר &quot;הפעלה&quot; פעמיים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חופש Evo יטען אוטומטית בכל צלחת לתוך LightCycler ולהפעיל את התוכנית הבאה SYBR ירוק I / HRM רכיבה על אופניים: Pre (1 מחזור): 50 מעלות במשך 5 דקות בקצב הרמפה של 4.8 ° / sec 95 מעלות במשך 5 דקות בקצב הרמפה של 4.8 ° / sec אמפר (45 מחזורים): 95 מעלות במשך 15 שניות בקצב הרמפה של 4.8 ° / sec 62 מעלות במשך 30 שניות כבש בקצב של 2.5 ° / sec (רכישת נתונים יחיד במהלך שלב זה) עקומת התכה: 95 מעלות למשך 5 שניות בקצב הרמפה של 4.8 ° / sec 60 מעלות למשך 1 דקה בקצב הרמפה של 2.5 ° / sec 95 ° רציפה בשיעור הרמפה של 0.11 ° / sec עם 5 רכישות לכל ° C מגניב: 50 מעלות במשך 30 שניות בקצב הרמפה של 25 ° / sec </li></ol></li></ol> ב ההתקנה של assay טרום מירנה בעזרת פיפטה רב אלקטרוניים מטריקס: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום תוכנו של צינור לערבב מאסטר 1 למאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את פיפטה אלקטרונית לשאוב 16ul תמהיל הורים עם 2-8ul לוותר צעדים ואחריו צעד לטהר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הורים לערבב 1, לוותר 8ul לבאר כל האחרים צלחת 384, באר (מוגדר על המרווח-384 גם טיפ), החל A1 היטב. (כלומר בארות A1, C1, E1, וכו &#39;) במשך 8ul second לוותר, לעבור טור 3 (כלומר בארות A3, C3, E3, וכו&#39;) ולאחר מכן לטהר את מיכל פסולת טיפים להיפטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע את הדפוס הזה במשך 5 מחזורים שנותרו עד שתגיע A23 היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור עבור הורים לערבב 2, (החל גם A2, C2, E2, וכו &#39;); לערבב מאסטר 3 (החל B1, D1 היטב, F1, וכו&#39;); לערבב מאסטר 4 (החל B2, D2, F2, etc .). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור aliquotting צלחת פריימר, להגדיר פיפטה אלקטרונית לשאוב 2ul ולחלק 2ul עם הבאים צעד לטהר. לוותר 2ul של primers מהעמודה של צלחת 1-96 גם פריימר (א.ה.) לתוך צלחת 384 הבאר, בארות A1, C1, E1, וכו &#39;הטיהור על פני מיכל פסולת טיפים להיפטר. חזור על בארות A2, C2, E2, B1, D1, F1, ו-B2, D2, F2 וכו &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שורות 2-12 של primers 96, טוב, נעים על כל 2 עמודים עבור כל עמודה פריימר, עד צלחת מלאה 384-היטב כבר aliquotted. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם צלחות בנייר איטום LightCycler ו צנטריפוגות בקצרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום צלחות לתוך LightCycler 480 מחזור הצלחות על פי ההגדרות הבאות באמצעות גרין SYBR I / פורמט HRM זיהוי: Pre (1 מחזור): 50 מעלות במשך 5 דקות בקצב הרמפה של 4.8 ° / sec 95 מעלות במשך 5 דקות בקצב הרמפה של 4.8 ° / sec אמפר (45 מחזורים): 95 מעלות במשך 15 שניות בקצב הרמפהשל 4.8 ° / sec 62 מעלות במשך 30 שניות כבש בקצב של 2.5 ° / sec (רכישת נתונים יחיד במהלך שלב זה) עקומת התכה: 95 מעלות למשך 5 שניות בקצב הרמפה של 4.8 ° / sec 60 מעלות למשך 1 דקה בקצב הרמפה של 2.5 ° / sec 95 ° רציפה בשיעור הרמפה של 0.11 ° / sec עם 5 רכישות לכל ° C מגניב: 50 מעלות במשך 30 שניות בקצב הרמפה של 25 ° / sec </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור באמצעות צלחת פריימר 2, aliquotting לתוך צלחת 384, גם טריים באמצעות תערובות מאסטר מוכן טרי. </li></ol> סודות ההצלחה: מאפיין חשוב בעת תכנון מערכי ה-PCR היא כי כל 186 זוגות פריימר יש חישול בטמפרטורה זהה, כך צלחת ניתן להפעיל את אותו הדבר האופטימלי תוכנית הגדרות ה-PCR לרוץ. כל מערך חדש צריך להיבדק באמצעות שלוש שולטת לפני דגימות פועל. בקרות אלה הם: 1 לרוץ כל primers לרוץ עם מים או 0.1 x TE כדי לשלול זיהום פריימר. 1 להפעיל לסירוגין מים / TE ושליטה חיובית, על מנת להבטיח שום שריד. 3 פועל באמצעות השלט חיובית זאת, כדי להבטיח שחזור בין ריצות. תערובות הורים צריכים להיות מוכנים טרי, צלחות יש להפעיל בתוך 24 שעות עבור תוצאות אופטימליות צלחת נייר פריימר יש להסיר לאט להפחית את הסיכון של זיהום בין בארות. כאשר באמצעות רובוט עם טיפים קבוע, לשטוף באקונומיקה 2% יש צורך לשטוף את הטיפים בין כל שלב pipetting, ובעקבותיו שטף מים. זה מונע ומונע שריד, שעלולות לזהם נתונים להוביל לתוצאות חד משמעיות. לאחר הצלחת מנוהל באמצעות Lightcycler, זה לא אמור להיפתח שוב בחדר ההתקנה PCR. זה עוזר למנוע זיהום PCR. נציג תוצאות: תוצאות qPCR מיוצגים בדרך כלל על ידי ערכים CT כפי שנקבע מהתוכנה ניתוח Lightcycler. ריצה מוצלחת בדרך כלל מורכבת של מגוון רחב של CTS עבור דגימות, בדרך כלל בין 20-35 עבור דגימות חיוביות. דגימות מים בטווח טוב הם תמיד CT של&gt; 40 וכל דגימות או בארות ספציפי עם CT מעל 37 נחשבים שליליים או לא מזוהה. ככלל, דגימות מניב CT של &lt;10 גם כן אינן אמינות והן מחוץ ניתוח נוסף. ישנן מספר דרכים לנתח נתונים qPCR והכללה של בקרה פנימית assay שלנו מסייע לשלוט על וריאציה של קלט המדגם. מערך טרום miR כולל פריימר לשלוט U6, המשמש לעתים קרובות גן התייחסות לנרמל את ערכי ה-CT מ מדגמים שונים. ערך זה מנורמל שמכונה ה-CT דלתא ערך (DCT). התוצאות בגרף לעתים קרובות כמו CT הגלם, ערך או DCT ניתן לנתח נוסף לערכים סטנדרטיים. באיור 1, ניתוח של המערך מראש microRNA מלא של ארבעה מדגמים שונים של ניסוי timecourse מוצג בפורמט המפה חום. הביטוי היחסי של microRNA מראש כל מוצג שלוש הגדולות, באשכולות נפרדים יצא. רוב מראש מירס עברו ניתוח קטן, שינוי משמעותי כצפוי (איור 1A). עם זאת, חלק קטן מראש רנ&quot;א היו ירדו משמעותית (איור 1B) או גדל באופן דרמטי (תרשים 1C) לאורך הניסוי timecourse. רמות הביטוי של microRNA מראש היו כל מנורמל של timepoint 0h (מדגם 1) כמו ברמה בסיסית. במקרים מסוימים, ייתכן לציין כי חלק מראש רנ&quot;א התקבצו גם מקבץ יחד בניתוח Heatmap (לשעבר: לתת-7 א, 1B איור). בהתאם הניסוי, אשכולות עלול להתגלות כי תלויים זיהום ויראלי, סוג התא הביטוי הספציפי של טרום טרום רנ&quot;א או מירס כי מוסדרים על ידי מולקולה משותפת או מסלול איתות. Assay microRNA מראש כי פיתחנו גם כוללת מספר ידוע מראש רנ&quot;א נגיפי, גנים המקודדים על ידי סרקומה של קפוסי Associated ההרפס (KSHV) ו אפשטיין בר וירוס (EBV) בנוסף טרום מירס האדם. אלה יכולים לשמש שולטת חיובית או שלילית, בהתאם לקו תא ומצב ויראלי של דגימות בשימוש. באיור 2, CTS הממוצע ממדגם KSHV שלילי ריצה ארבע פעמים מוצגים. חשוב לציין, KSHV לנה לא זוהה במדגם זה על ידי מערך qPCR רגיש מאוד. עם זאת, U6 - הבקרה הפנימית שלנו ולתת-7 א - הביעו מאוד אנושי מראש microRNA, באו לידי ביטוי בכל הרמות לזיהוי. לבסוף, כצפוי, הביקורת השלילית של מים PCR כיתה לא הניב מוצר qPCR. אינדיקטור נוסף של מפעיל qPCR מוצלח הוא נמס טוב עקומת ניתוח, אשר יכול לתת תובנה זיהום פוטנציאליים דגימות. כדי ליצור טמפרטורת ההתכה, צלחת מחוממת לאט אחרי PCR תושלם. כמו גדילי הדנ&quot;א נפרדים, SYBR ירוק הוא שוחרר, אותות הקרינה פוחתת. הטמפרטורה שבה זה drאופ מתרחש בגרף, והוא ידוע בתור טמפרטורת ההיתוך של המדגם. בהתאם רצף ה-DNA, דגימות להמיס בטמפרטורות שונות זו מזו משליטת מים שלילי, אשר לא צריכה להיות טמפרטורת ההתכה מאז ה-DNA לא קיים. המוצרים PCR מתוך כל זוג צריך פריימר להמיס בטמפרטורות דומות. לדוגמה, איור 3 מראה עקומת התכה ניתוח שני פריימרים שונים באמצעות מדגם זהה כפולים. ברור כי את טמפרטורת ההתכה שונה עבור שני זוגות פריימר אבל המדגם הוא נמס בטמפרטורת בדיוק את אותו הדבר עבור לשכפל כל אחד. סימנים של מדגם רע או מזוהמים יכולים לכלול מספר פסגות ההיתוך, דבר המצביע על נוכחות של שני מקורות שונים של קלט. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. טרום microRNA חתימות לצאת דרך אפיון באמצעות qPCR מבוסס הרומן המערך. DeltaCTU6 הממוצעת חושבה וערכים סטנדרטיים הועמסו תוכנה ArrayMinerTM, מניב 3 אשכולות שונים מוצג כ heatmaps. (א) Pre-רנ&quot;א עם שינויים קטנים ביטוי מוצגים. טרום רנ&quot;א אשר היו רמות ירד משמעותית (ב) או מוגבר (ג) מוצגים גם. כחול תואם רמות נמוכות יותר של ביטוי בעוד אדום מייצג עלייה ברמות הביטוי. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. הכללה של בקרות פנימיות במערך מראש microRNA qPCR מבוססות. הערכים גלם CT עבור 3 גנים שונים שליטה תבנית לא מוצגים. U6 משמש בקרה פנימית חיובית בעוד PCR H2O משמש שליטה שלילי שלנו. בואו-7a-1-1 הוא microRNA הביעו בדרך כלל הרבה סוגי תאים שונים תוך KSHV לנה יכול לשמש כביקורת חיובית או שלילית, על סמך מעמד ויראלי של קו תא או רקמה בשימוש. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. התכה ניתוח שיא של microRNA מראש primers וחוסר זיהום המדגם. עקומות התכה התקבלו באמצעות ניתוח קורא אני בתוכנה LightCycler. שני פריימרים שונים (פריימר A ו-B) עבור מדגם זהה לרוץ לשכפל מוצגים. טמפרטורת ההתכה של כל צבע יסוד שונה. עם זאת, במדגם יש רק אחד השיא, הוכחת העדר זיהום המדגם.

<ol>
	<li>Bustin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments.">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Fr&#233;geau, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Processing+of+Forensic+Casework+Samples+using+Robotic+Workstations+Equipped+with+Nondisposable+Tips+-+Contamination+Prevention.">Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips - Contamination Prevention.</a> J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).</li><li>O'hara, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-micro+RNA+Signatures+Delineate+Stages+of+Endothelial+Cell+Transformation+in+Kaposi+Sarcoma.">Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

QPCR הוא assay רגישה מאוד, כי ניתן להשתמש כדי להשוות רמות ביטוי הגנים בין דגימות במחקר, כמו גם כדי לקבוע חיוביות במקרה של וירוסים. היתרון של שימוש במערכים qPCR הוא היכולת להריץ primers רבים (במקרה שלנו, 186 זוגות פריימר) עבור מדגם זה בתקופה קצרה של זמן. באמצעות רובוט pipetting כגון חופש...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Freedom Evo 150</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tecan</td>
<td>30017587</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Matrix Electronic Multichannel Pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>2001-MTX</td>
<td>(or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above)</td>
</tr>
<tr>
<td>Matrix Integrity Filter Tips, Sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>7435</td>
<td>(or comparable tip for multichannel used)</td>
</tr>
<tr>
<td>Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04 707 516 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lightcycler 480 Instrument II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05015243001</td>
<td>384-well version</td>
</tr>
<tr>
<td>Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04729749001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LightCycler 480 Sealing Foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04729757001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05075122001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eliminase Decontaminant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Decon Laboratories</td>
<td>04-355-31</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

profiling of pre-micro rnas and micrornas using quantitative real-time pcr (qpcr) arrays

כמותי בזמן אמת PCR (QPCR) התפתחה ככלי מדויק יקר פרופיל רמות ביטוי הגנים. אחד היתרונות הרבים גבול גילוי נמוכה בהשוואה לשיטות אחרות של פרופילי ביטוי גנים, תוך שימוש בכמויות קטנות של קלט עבור כל assay. התקנה אוטומטית qPCR השתפר בתחום הזה על ידי המאפשר שחזור יותר. ההתקנה נוחה ומהירה שלה מאפשר תפוקה גבוהה ניסויים, המאפשרת אפיון של גנים רבים ושונים בו זמנית בכל ניסוי. שיטה זו, יחד עם צלחת בקרות פנימיות גם מקטין את משתני הניסוי המשותף טכניקות אחרות. אנחנו לאחרונה פיתחה assay qPCR עבור פרופילים של טרום רנ&quot;א (טרום miRNAs) באמצעות סדרה של 186 זוגות פריימר. מיקרו RNA צמחו כמעמד של רומן קטן, ללא קידוד RNAs עם היכולת לווסת את מטרות mRNA רבים ברמה שלאחר תעתיק. RNAs אלה קטן מתועתקים הראשונה מירנה תעתיק הראשי (פרי, מירנה), אשר ביקע מכן לתוך מירנה המבשר (טרום מירנה) על ידי RNA פולימראז II. טרום miRNAs מיוצאים הציטופלסמה שבה דייסר cleaves את הלולאה מכבנה להניב miRNAs בוגרת. עליות ברמות מירנה ניתן לצפות ב מבשר והן רמות מירנה בוגרת פרופיל של שתי צורות אלה יכול להיות שימושי. ישנם מבחני זמינים מסחרית מספר miRNAs בוגרת, אך העלות הגבוהה שלהם עשוי להרתיע חוקרים טכניקה זו פרופיל. כאן, אנו דנים חסכונית, אמינות, SYBR מבוססי שיטה qPCR של אפיון מראש miRNAs. שינויים מירנה מראש רמות לעתים קרובות לשקף שינויים מירנה בוגרת יכולה להיות אינדיקציה שימושית הביטוי מירנה בוגרת. עם זאת, פרופיל סימולטני של שתי טרום miRNAs ו miRNAs בוגרת יכול להיות אופטימלי כפי שהם יכולים לתרום מידע nonredundant ולספק תובנות עיבוד microRNA. יתרה מכך, טכניקה המתואר כאן ניתן להרחיב להקיף את פרופיל של קבוצות אחרות ספריית המסלולים או פתוגנים ספציפיים.

Watch this Scientific Journal Video about Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays at JoVE.com

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

נדגים את ההתקנה וניתוח של microRNA טרום 96-היטב עבור מערכים QPCR באמצעות רובוט, כמו גם על ידי ביד עם פיפטה מדעי רב מטריקס Thermo.

פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ&quot;א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

profiling-pre-micro-rnas-micrornas-using-quantitative-real-time-pcr

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

17.2K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. נדגים את ההתקנה וניתוח של microRNA טרום 96-היטב עבור מערכים QPCR באמצעות רובוט, כמו גם על ידי ביד עם פיפטה מדעי רב מטריקס Thermo.

Video: Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

כמותי Real-Time PCR באמצעות המדעית Thermo Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

ניתוח של ביטוי גנים בורר אש אמרלד ( Agrilus planipennis) באמצעות Real Time-PCR כמותי

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates. The assay yields rates of DNA Repair activity amenable to kinetic analysis and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor lysates or with purified proteins.

כמותי, בזמן אמת, ניתוח של פעילות כריתת מאגר תיקון lysates סלולריים ניצול הנגע ספציפיים משואות מולקולרית

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different lineages. A single cell transcriptome assay can be a new approach for dissecting individual variation. We have developed the single cell qRT-PCR method, and confirmed that this method works well in several gene expression profiles. In single cell level, each human embryonic stem cell, sorted by OCT4::EGFP positive cells, has high expression in OCT4, but a different level of NANOG expression. Our single cell gene expression assay should be useful to interrogate population heterogeneities.

Single cell gene expression assay is needed for understanding stem cell heterogeneities.

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

מדידות בזמן אמת של חלבון ממברנה: קולט אינטראקציות שימוש תהודה Plasmon Surface (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

בזמן אמת המבוסס על הבדיקה PCR גישות למדידת כמותית של מיקרו-רנ&quot;א

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This approach is appropriate for examining physiological changes in target gene expression levels. However, absolute quantification using better statistical analysis is preferable for a comprehensive assessment of gene expression levels. Absolute quantification is still not in common use. This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using RT-qPCR with or without pre-amplification.
A fixed volume (200 &#181;L) of EDTA-plasma was prepared from the blood collected from the femoral vein of conscious cynomolgus monkeys (n = 50). Total RNA was extracted using commercially available system. Plasma miRNAs were quantified by probe-based RT-qPCR assays which contains miRNA-specific forward/reverse PCR primer and probe. Standard curves for absolute quantification were generated using commercially available synthetic RNA oligonucleotides. A synthetic cel-miR-238 was used as an external control for normalization and quality assessment. The miRNAs that showed quantification cycle (Cq) values above 35 were pre-amplified prior to the qPCR step.
Among the 8 miRNAs examined, miR-122, miR-133a, and miR-192 were detectable without pre-amplification, whereas miR-1, miR-206, and miR-499a required pre-amplification because of their low expression levels. MiR-208a and miR-208b were not detectable even after pre-amplification. Sample processing efficiency was evaluated by the Cq values of the spiked cel-miR-238. In this assay method, technical variation was estimated to be less than 3-fold and the lower limit of quantification (LLOQ) was 102 copy/&#181;L, for most of the examined miRNAs.
This protocol provides a better estimate of the quantity of plasma miRNAs, and allows quality assessment of corresponding data from different studies. Considering the low number of miRNAs in body fluids, pre-amplification is useful to enhance detection of poorly expressed miRNAs.

This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using quantitative real-time reverse transcription PCR with or without pre-amplification. This protocol affords better understanding of the quantity of plasma miRNAs and allows qualitative assessment of corresponding data from different studies or laboratories.

כימות מוחלטת של פלזמה רמות MicroRNA בקופים Cynomolgus, באמצעות שעתוק במהופך בזמן אמת PCR כמותי

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

ניטור בזמן אמת של אורורה קינאז הפעלה באמצעות Biosensors FRET קונפורמציה בתאים חיים

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...