Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni NIH DE018304, R01DE018281. KT è supportato da GM07092 T32-34 e da un finanziamento alla University of North Carolina a Chapel Hill da Howard Hughes Medical Institute (HHMI) attraverso il Med in Grad iniziativa. PC è supportato da T32 CA009156.

Il pre-miRNA array profiling qPCR può essere impostato come completamente automatico con una libertà Tecan Evo robot (A) oppure a mano con la pipetta multicanale elettronica Matrix (B). 1) Preparare la master mix, piatti primer e campioni. <ol><li> Piastre di fondo contenente 186 coppie di primer in formato a 96 pozzetti (totale di 2 piastre) a 12:05 devono essere conservati a -80 ° C. Scongelare le piastre a temperatura ambiente, vortex e centrifugare brevemente prima dell&#39;uso. </li><li> Per preparare il mix master, disgelo fuori SYBR Green 2x Mix PCR a temperatura ambiente. Ogni reazione usa mix 8ul maestro con primer 2ul. La composizione del master mix per ogni reazione viene mix SYBR 4UL, 3UL acqua grado PCR e 10-20 ng campione di DNA o cDNA. </li><li> Per la configurazione di ogni piatto fondo da 96 pozzetti, quattro tubi master mix sarà necessario. I campioni possono essere eseguiti 4 campioni per piastra (singlicate), 2 campioni per piastra (duplicato) o un singolo campione in quattro esemplari. </li><li> Preparare master mix unendo SYBR, acqua e campione in ciascuno di 4-2 ml provette Eppendorf. Ogni tubo deve contenere mix abbastanza principale per circa 100 reazioni, permettendo in eccesso per pipettaggio rifiuti. Vortex per mescolare. </li></ol> A. Configurazione di pre-miRNA test utilizzando il Freedom Tecan Evo robot. <ol><li> A seguito di inizializzazione del robot e il caricamento del programma Evoware, lavare tre volte con ogni 30mls per cancellare sistema di bolle d&#39;aria che interferiscono con la precisione di pipettaggio. </li><li> Installazione della piattaforma robot sono i seguenti: <ul><li> Etichettati 384 pozzetti </li><li> 96 pozzetti fondo (1) </li><li> Master Mix </li><li> Una attraverso contenente il 2% di candeggina </li><li> Un sistema di contenitori pieni di liquidi </li><li> Rifiuti contenitore vuoto </li></ul></li><li> Iniziare a conduzione robot automatizzati selezionando la voce &quot;Esegui&quot; due volte. </li><li> Alla fine del programma, rimuovere 384 pozzetti e sigillare con LightCycler 480 foglio di tenuta e centrifugare brevemente. Luogo sigillato piastra da 384 pozzetti in posizione 1 dell &#39;hotel. </li><li> Passare al punto 2.2 e ripetere per piastra di fondo 2 con mescola nuovo padrone e una nuova piastra da 384 pozzetti. <ol><li> Inserire la piastra di tenuta in posizione 2 dell &#39;hotel. </li></ol></li><li> Aperto il nuovo programma per Evoware Caricamento del LightCycler dall&#39;hotel e selezionare &quot;Esegui&quot; due volte. <ol><li> Freedom Evo caricherà automaticamente ogni piatto nel LightCycler ed eseguire il seguente SYBR-verde I / HRM programma dei cicli: Pre (1 ciclo): 50 ° per 5 minuti a velocità di rampa di 4,8 ° / sec 95 ° per 5 minuti a velocità di rampa di 4,8 ° / sec Amp (45 cicli): 95 ° per 15 secondi a velocità di rampa di 4,8 ° / sec 62 ° per 30 sec a velocità di rampa di 2,5 ° / sec (Single di acquisizione dati in questa fase) Curva di fusione: 95 ° per 5 secondi a velocità di rampa di 4,8 ° / sec 60 ° per 1 minuto a velocità di rampa di 2,5 ° / sec 95 ° continuo a velocità di rampa di 0,11 ° / sec con 5 acquisizioni per ° C Cool: 50 ° per 30 secondi a velocità di rampa di 25 ° / sec </li></ol></li></ol> B. Configurazione di pre-miRNA test utilizzando la pipetta multicanale elettronica Matrix: <ol><li> Il contenuto del tubo posto master mix 1 in un serbatoio. </li><li> Impostare la pipetta elettronica per aspirare 16ul di master mix con 2-8ul dispensare passi seguita da una fase di spurgo. </li><li> Per master mix 1, dispensare 8ul in ogni altro bene del 384 pozzetti (impostato a 384 pozzetti spaziatura punta), a partire dal pozzetto A1. (Cioè pozzi A1, C1, E1, ecc) Per il secondo 8ul dispensare, spostarsi in colonna 3 (ossia pozzi A3, C3, E3, ecc) e poi eliminare su un contenitore dei rifiuti e suggerimenti smaltire. </li><li> Seguite questo schema per i restanti 5 cicli fino a raggiungere ben A23. </li><li> Ripetere per master mix 2, (a cominciare da ben A2, C2, E2, ecc); Master Mix 3 (a partire B1 bene, D1, F1, ecc); Master Mix 4 (inizio in B2, D2, F2, ecc .). </li><li> Per aliquotting di piatto fondo, impostare pipetta elettronica per aspirare e dispensare 2ul 2ul con un seguito passo di spurgo. Dispensare 2ul di primer da colonna 1 a 96 pozzetti fondo (AH) nel 384-pozzetti, pozzi A1, C1, E1, ecc Purge su un contenitore dei rifiuti e suggerimenti smaltire. Ripetere l&#39;operazione per pozzi A2, C2, E2, B1, D1, F1, e B2, D2, F2, ecc </li><li> Ripetere per le righe 2-12 di primer a 96 pozzetti, passando sopra ogni 2 colonne per ogni colonna fondo, fino a completa a 384 pozzetti è stato aliquotted. </li><li> Piastre di tenuta con un foglio di tenuta LightCycler e centrifugare brevemente. </li><li> Piastre in un luogo LightCycler 480 e del ciclo di piatti secondo le seguenti impostazioni utilizzando il SYBR Green I / formato di rilevamento gestione delle risorse umane: Pre (1 ciclo): 50 ° per 5 minuti a velocità di rampa di 4,8 ° / sec 95 ° per 5 minuti a velocità di rampa di 4,8 ° / sec Amp (45 cicli): 95 ° per 15 sec a velocità di rampadi 4,8 ° / sec 62 ° per 30 sec a velocità di rampa di 2,5 ° / sec (Single di acquisizione dati in questa fase) Curva di fusione: 95 ° per 5 secondi a velocità di rampa di 4,8 ° / sec 60 ° per 1 minuto a velocità di rampa di 2,5 ° / sec 95 ° continuo a velocità di rampa di 0,11 ° / sec con 5 acquisizioni per ° C Cool: 50 ° per 30 secondi a velocità di rampa di 25 ° / sec </li><li> Ripetere con fondo piatto 2, aliquotting in un piatto fresco da 384 pozzetti utilizzando miscele maestro preparati al momento. </li></ol> Segreti del successo: Una caratteristica importante quando si progetta array PCR è che tutte le 186 coppie di primer hanno la stessa temperatura di ricottura, in modo che il piatto può essere eseguito con le stesse impostazioni ottimale del programma eseguire PCR. Ogni nuovo array devono essere controllati utilizzando tre controlli prima della corsa dei campioni. Questi controlli sono: 1 pista di tutti i primer correre con acqua o 0,1 x TE per escludere la contaminazione primer. 1 pista di alternare acqua / TE e di controllo positivo, per assicurarsi che non riporto. 3 piste con lo stesso controllo positivo, per garantire la riproducibilità tra le esecuzioni. Mix master deve essere preparata, e piatti deve essere eseguito entro 24 ore per ottenere risultati ottimali Piastra di alluminio primer deve essere rimosso lentamente per ridurre il rischio di contaminazione tra pozzi. Quando si utilizza un robot con le punte fisse, lavare candeggina al 2% è necessario lavare le punte tra ogni semina, seguita da un filo d&#39;acqua. Questo previene ed elimina riporto, che potrebbero contaminare i dati e portare a risultati inconcludenti. Dopo che un piatto è gestito attraverso il LightCycler, non dovrebbe essere riaperto nella stanza di impostazione della PCR. Questo aiuta a prevenire la contaminazione della PCR. Rappresentante dei risultati: qPCR risultati sono in genere rappresentati da valori di CT, come determinato dal software di analisi LightCycler. Un grande successo di solito consiste in una gamma di TA per i campioni, in genere tra 20-35 per i campioni che sono positivi. I campioni di acqua in una buona corsa sono sempre a un TC&gt; 40 e di qualunque campione o pozzi specifiche con un CT oltre 37 sono considerati negativi o non rilevato. Come regola generale, i campioni ottenendo un CT di &lt;10 sono inaffidabili e sono esclusi da ulteriori analisi. Ci sono diversi modi per analizzare i dati qPCR e l&#39;inserimento dei controlli interni nei nostri test aiuta a controllare per la variazione di ingresso del campione. La pre-miR serie comprende un manuale di controllo U6, che è spesso utilizzato come gene di riferimento per normalizzare i valori di CT da campioni diversi. Questo valore normalizzato viene indicato come il delta CT valore (DCT). I risultati sono spesso rappresentate come le prime CT, il valore dCT o possono essere ulteriormente analizzati per valori standardizzati. Nella figura 1, l&#39;analisi della piena pre-microRNA array di quattro campioni diversi da un esperimento timecourse è presentato in formato carta di calore. L&#39;espressione relativa di ogni pre-microRNA è mostrato e tre grandi, gruppi distinti emerse. La maggior parte dei pre-MIRS analizzato subito piccole variazioni insignificanti come previsto (Figura 1A). Tuttavia, una piccola porzione di pre-microRNA sono risultati significativamente diminuiti (Figura 1B) o aumentato notevolmente (Figura 1C) per tutto l&#39;esperimento timecourse. I livelli di espressione di ogni pre-microRNA sono stati normalizzati al timepoint 0h (campione 1) come un livello base. In alcuni casi, è possibile notare che alcune delle cluster pre-microRNA anche raggruppare insieme nell&#39;analisi heatmap (es: let-7, Figura 1B). A seconda della sperimentazione, i cluster possono emergere che dipendono da un&#39;infezione virale, tipo di espressione di cellule specifiche di pre-microRNA o pre-MIRS che sono regolati da una molecola comune o via di segnalazione. Il test di pre-microRNA che abbiamo sviluppato include anche una serie di note virale pre-microRNA e geni codificati da Sarcoma di Kaposi associato Herpesvirus (KSHV) e Epstein Barr Virus (EBV) in aggiunta alle pre-umano MIRS. Questi possono essere utilizzati come controlli positivi o negativi, a seconda della linea cellulare e lo stato virale dei campioni utilizzati. Nella figura 2, il TA media da un KSHV negativo campione eseguito in quadruplicato sono mostrati. È importante sottolineare che KSHV LANA non è stato rilevato in questo campione l&#39;array qPCR altamente sensibile. Tuttavia, U6 - il nostro controllo interno e di let-7 bis - altamente espresso umano pre-microRNA, sono stati espressi a livelli rilevabili. Infine, come previsto, il controllo negativo della PCR acqua di grado non ha dato un prodotto qPCR. Un altro indicatore di una corsa qPCR di successo è una buona analisi della curva di fusione, che può dare informazioni in potenziale contaminazione nei campioni. Per stabilire una temperatura di fusione, la piastra è riscaldata lentamente dopo la PCR è completa. Come i filamenti di DNA separati, SYBR green viene rilasciato, e il segnale di fluorescenza diminuisce. La temperatura alla quale questo drop verifica viene rappresentata graficamente, ed è conosciuta come la temperatura di fusione del campione. In base on la sequenza del DNA, i campioni fondono a temperature diverse le une dalle altre e dal controllo delle acque negativi, che non dovrebbe avere una temperatura di fusione in quanto non DNA è presente. I prodotti di PCR di ciascuna coppia di primer dovrebbe sciogliersi a temperature simili. Per esempio, la Figura 3 mostra l&#39;analisi della curva di fusione per due primers diversi utilizzando lo stesso campione in duplicato. E &#39;chiaro che la temperatura di fusione è diversa per le due coppie di primer, ma il campione si sta sciogliendo ad una temperatura esattamente lo stesso per ogni replica. Segni di un campione di cattivo o potenzialmente contaminati possono includere diversi picchi di fusione, il che suggerisce la presenza di due diverse fonti di input. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Pre-microRNA firme emergono attraverso il profiling usando un romanzo qPCR a base di array. La media è stata calcolata deltaCTU6 e valori standardizzati sono stati caricati nel software ArrayMinerTM, ottenendo 3 gruppi distinti visualizzato come heatmaps. (A) pre-microRNA con piccoli cambiamenti di espressione sono mostrati. Pre-microRNA i cui livelli sono risultati significativamente diminuiti (B) o aumentata (C) sono inoltre riportati. Blu corrisponde ad abbassare i livelli di espressione, mentre il rosso rappresenta un aumento dei livelli di espressione. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Inclusione dei controlli interni nella qPCR-based pre-microRNA array. I valori grezzi CT per 3 geni diversi e un modello di controllo non vengono visualizzati. U6 è usato come un controllo interno positivo mentre PCR H2O serve come il nostro controllo negativo. Let-7a-1-1 è un microRNA normalmente espressa in molti tipi cellulari diversi, mentre KSHV LANA può essere utilizzato sia come controllo positivo o negativo, in base allo stato virale della linea di cellule o tessuti utilizzati. <img src="/files/ftp_upload/2210/2210fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Picco di fusione analisi di pre-microRNA primer e la mancanza di contaminazione dei campioni. Le curve di fusione sono stati ottenuti utilizzando l&#39;analisi chiamando Tm nel software LightCycler. Due primer diversi (Primer A e B) per lo stesso campione in doppio sono mostrati. La temperatura di fusione per ogni primer è distinto. Tuttavia, il campione ha un solo picco, dimostrando la mancanza di contaminazione dei campioni.

<ol>
	<li>Bustin, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+Guidelines:+Minimum+Information+for+Publication+of+Quantitative+Real-Time+PCR+Experiments.">The MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments.</a> Clinical Chem. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Fr&#233;geau, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Processing+of+Forensic+Casework+Samples+using+Robotic+Workstations+Equipped+with+Nondisposable+Tips+-+Contamination+Prevention.">Automated Processing of Forensic Casework Samples using Robotic Workstations Equipped with Nondisposable Tips - Contamination Prevention.</a> J. Forensic Sci. 53 (3), 53-533 (2008).</li><li>O'hara, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-micro+RNA+Signatures+Delineate+Stages+of+Endothelial+Cell+Transformation+in+Kaposi+Sarcoma.">Pre-micro RNA Signatures Delineate Stages of Endothelial Cell Transformation in Kaposi Sarcoma.</a> PLoS Pathog. 5 (4), e1000389-e1000389 (2009).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

QPCR è un saggio altamente sensibile che può essere utilizzato per confrontare i livelli di espressione genica tra i campioni in studio, e di determinare positività in caso di virus. Il vantaggio di utilizzare array qPCR è la possibilità di eseguire molti primer (nel nostro caso, 186 coppie di primer) per ogni campione in un breve periodo di tempo. Utilizzando un robot pipettamento come la libertà Tecan Evo, la quantità di tempo necessario per impostare un esperimento up può essere ulteriormente ridotto, e l&#39...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Freedom Evo 150</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Tecan</td>
<td>30017587</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Matrix Electronic Multichannel Pipette</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>2001-MTX</td>
<td>(or any comparable Thermo Scientific multichannel that can pipette the volumes described above)</td>
</tr>
<tr>
<td>Matrix Integrity Filter Tips, Sterile</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific</td>
<td>7435</td>
<td>(or comparable tip for multichannel used)</td>
</tr>
<tr>
<td>Lightcycler 480 SYBR Green 1 Master</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04 707 516 001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lightcycler 480 Instrument II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05015243001</td>
<td>384-well version</td>
</tr>
<tr>
<td>Lightcycler 480 Multiwell Plate 384, white</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04729749001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LightCycler 480 Sealing Foil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>04729757001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LightCycler 480 Multiple Plate Analysis Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche</td>
<td>05075122001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Eliminase Decontaminant</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Decon Laboratories</td>
<td>04-355-31</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

profiling of pre-micro rnas and micrornas using quantitative real-time pcr (qpcr) arrays

Quantitativa real-time PCR (QPCR) è emerso come uno strumento preciso e prezioso nel profilo livelli di espressione genica. Uno dei suoi vantaggi è un limite di rilevazione più basso rispetto ad altri metodi di profili di espressione genica durante l&#39;utilizzo di piccole quantità di ingresso per ciascun test. Automatizzate di configurazione qPCR ha migliorato questo settore, consentendo una maggiore riproducibilità. La sua configurazione comoda e rapida permette di high-throughput esperimenti, che consente la profilazione di molti geni diversi simultaneamente in ogni esperimento. Questo metodo insieme ai controlli piastra interna riduce anche variabili sperimentali comuni ad altre tecniche. Abbiamo recentemente sviluppato un test qPCR per la profilatura di pre-microRNA (pre-miRNA) utilizzando un set di 186 coppie di primer. I microRNA sono emersi come una nuova classe di piccoli RNA non codificanti, con la possibilità di regolare molti mRNA target a livello post-trascrizionale. Questi piccoli RNA vengono prima trascritti dalla RNA polimerasi II come un miRNA primario (pri-miRNA) trascrizione, che viene poi tagliata in miRNA precursore (pre-miRNA). Pre-miRNA vengono esportati nel citoplasma dove Dicer unirà il ciclo tornante cedere miRNA maturi. Aumenti dei livelli di miRNA possono osservare sia il precursore e livelli di miRNA maturo e profilatura di entrambe queste forme possono essere utili. Ci sono diversi test disponibili in commercio per il miRNA maturo, ma il loro costo elevato potrebbe scoraggiare i ricercatori questa tecnica di profilatura. Qui, si discute una soluzione conveniente, affidabile, SYBR metodo basato qPCR di profili pre-miRNA. Cambiamenti nei livelli di pre-miRNA spesso riflettere i cambiamenti miRNA maturo e può essere un utile indicatore di espressione miRNA maturi. Tuttavia, profilazione simultanea di entrambi i pre-miRNA e miRNA maturo può essere ottimale in quanto possono contribuire le informazioni ridondanti e permettono di percepire il trattamento di microRNA. Inoltre, la tecnica qui descritta può essere ampliata fino a comprendere la profilazione dei set di librerie per altri percorsi specifici o agenti patogeni.

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Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Dimostreremo la configurazione e l&#39;analisi di pre-microRNA 96-array e per QPCR usando un robot così come a mano con una pipetta multicanale Thermo Scientific Matrix.

Profilatura di pre-micro-RNA e microRNA con Quantitative Real-time PCR (qPCR) Array

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

profiling-pre-micro-rnas-micrornas-using-quantitative-real-time-pcr

Research

JoVE Journal

Biology

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

17.2K Views.  University of North Carolina at Chapel Hill. Dimostreremo la configurazione e l'analisi di pre-microRNA 96-array e per QPCR usando un robot così come a mano con una pipetta multicanale Thermo Scientific Matrix.

Video: Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and accuracy of the assay. These primer/probe sets are pre-designed to &gt;98% of the human and mouse genomes and feature significant improvements from previously available technologies. These improvements were made possible by virtue of a novel design algorithm, developed by Thermo Scientific bioinformatics experts.
Several convenient features have been incorporated into the Solaris qPCR Assay to streamline the process of performing quantitative real-time PCR. First, the protocol is similar to commonly employed alternatives, so the methods used during qPCR are likely to be familiar. Second, the master mix is blue, which makes setting the qPCR reactions easier to track. Third, the thermal cycling conditions are the same for all assays (genes), making it possible to run many samples at a time and reducing the potential for error. Finally, the probe and primer sequence information are provided, simplifying the publication process.
Here, we demonstrate how to obtain the appropriate Solaris reagents using the GENEius product search feature found on the ordering web site (www.thermo.com/solaris) and how to use the Solaris reagents for performing qPCR using the standard curve method.

The Solaris qPCR Gene Expression Assays are novel pre-designed qPCR primer/probe combinations designed to simplify the qPCR process without sacrificing the specificity and robustness of the assay.

Quantitativa Real-Time PCR utilizzando il Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Ricerca

Biologia

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

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Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

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Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

Determinare profili di espressione genetica in C. elegans Utilizzo Microarray e Real-time PCR

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We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base excision repair (BER) molecular beacons. The substrate (beacon) is comprised of a deoxyoligonucleotide containing a single base lesion with a 6-Carboxyfluorescein (6-FAM) moiety conjugated to the 5'end and a Dabcyl moiety conjugated to the 3' end of the oligonucleotide. The BER molecular beacon is 43 bases in length and the sequence is designed to promote the formation of a stem-loop structure with 13 nucleotides in the loop and 15 base pairs in the stem1,2. When folded in this configuration the 6-FAM moiety is quenched by Dabcyl in a non-fluorescent manner via F&ouml;rster Resonance Energy Transfer (FRET)3,4. The lesion is positioned such that following base lesion removal and strand scission the remaining 5 base oligonucleotide containing the 6-FAM moiety is released from the stem. Release and detachment from the quencher (Dabcyl) results in an increase of fluorescence that is proportionate to the level of DNA repair. By collecting multiple reads of the fluorescence values, real-time assessment of BER activity is possible. The use of standard quantitative real-time PCR instruments allows the simultaneous analysis of numerous samples. The design of these BER molecular beacons, with a single base lesion, is amenable to kinetic analyses, BER quantification and inhibitor validation and is adaptable for quantification of DNA Repair activity in tissue and tumor cell lysates or with purified proteins. The analysis of BER activity in tumor lysates or tissue aspirates using these molecular beacons may be applicable to functional biomarker measurements. Further, the analysis of BER activity with purified proteins using this quantitative assay provides a rapid, high-throughput method for the discovery and validation of BER inhibitors.

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Quantitativa, in tempo reale Analisi dell&#39;attività riparazione per escissione Base in lisati cellulari Utilizzando Molecular Beacons Lesione specifici

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Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

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Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

Base-Probe Real-time PCR Approcci per la misurazione quantitativa dei microRNA

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic chromosome, synIII1, and one synthetic chromosome arm, synIXR2, have been constructed and their in vivo function validated in the absence of the corresponding wild type chromosomes. An important design feature of Sc2.0 chromosomes is the introduction of PCRTags, which are short, re-coded sequences within open reading frames (ORFs) that enable differentiation of synthetic chromosomes from their wild type counterparts. PCRTag primers anneal selectively to either synthetic or wild type chromosomes and the presence/absence of each type of DNA can be tested using a simple PCR assay. The standard readout of the PCRTag assay is to assess presence/absence of amplicons by agarose gel electrophoresis. However, with an average PCRTag amplicon density of one per 1.5 kb and a genome size of ~12 Mb, the completed Sc2.0 genome will encode roughly 8,000 PCRTags. To improve throughput, we have developed a real time PCR-based detection assay for PCRTag genotyping that we call qPCRTag analysis. The workflow specifies 500 nl reactions in a 1,536 multiwell plate, allowing us to test up to 768 PCRTags with both synthetic and wild type primer pairs in a single experiment.

Designer chromosomes of the Synthetic Yeast Genome project, Sc2.0, can be distinguished from their native counterparts using a PCR-based genotyping assay called PCRTagging, which has a presence/absence endpoint. Here we describe a high-throughput real time PCR detection method for PCRTag genotyping.

Analisi qPCRTag - A High Throughput, Real Time PCR Assay per Sc2.0 genotipizzazione

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This approach is appropriate for examining physiological changes in target gene expression levels. However, absolute quantification using better statistical analysis is preferable for a comprehensive assessment of gene expression levels. Absolute quantification is still not in common use. This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using RT-qPCR with or without pre-amplification.
A fixed volume (200 &#181;L) of EDTA-plasma was prepared from the blood collected from the femoral vein of conscious cynomolgus monkeys (n = 50). Total RNA was extracted using commercially available system. Plasma miRNAs were quantified by probe-based RT-qPCR assays which contains miRNA-specific forward/reverse PCR primer and probe. Standard curves for absolute quantification were generated using commercially available synthetic RNA oligonucleotides. A synthetic cel-miR-238 was used as an external control for normalization and quality assessment. The miRNAs that showed quantification cycle (Cq) values above 35 were pre-amplified prior to the qPCR step.
Among the 8 miRNAs examined, miR-122, miR-133a, and miR-192 were detectable without pre-amplification, whereas miR-1, miR-206, and miR-499a required pre-amplification because of their low expression levels. MiR-208a and miR-208b were not detectable even after pre-amplification. Sample processing efficiency was evaluated by the Cq values of the spiked cel-miR-238. In this assay method, technical variation was estimated to be less than 3-fold and the lower limit of quantification (LLOQ) was 102 copy/&#181;L, for most of the examined miRNAs.
This protocol provides a better estimate of the quantity of plasma miRNAs, and allows quality assessment of corresponding data from different studies. Considering the low number of miRNAs in body fluids, pre-amplification is useful to enhance detection of poorly expressed miRNAs.

This report describes a protocol for measuring the absolute levels of plasma miRNA, using quantitative real-time reverse transcription PCR with or without pre-amplification. This protocol affords better understanding of the quantity of plasma miRNAs and allows qualitative assessment of corresponding data from different studies or laboratories.

Quantificazione assoluta dei livelli di MicroRNA del Plasma nella scimmia cynomolgus, mediante trascrizione d'inversione quantitativa Real-Time PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Real-Time Monitoring of Aurora kinase A Activation using Conformational FRET Biosensors in Live Cells

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon its autophosphorylation on Thr288. AURKA abundance peaks in mitosis, where it controls the stability and the fidelity of the mitotic spindle, and the overall efficiency of mitosis. Although well characterized at the structural level, a consistent monitoring of the activation of AURKA throughout the cell cycle is lacking. A possible solution consists in using genetically-encoded F&#246;rster&#8217;s Resonance Energy Transfer (FRET) biosensors to gain insight into the autophosphorylation of AURKA with sufficient spatiotemporal resolution. Here, we describe a protocol to engineer FRET biosensors detecting Thr288 autophosphorylation, and how to follow this modification during mitosis. First, we provide an overview of possible donor/acceptor FRET pairs, and we show possible cloning and insertion methods of AURKA FRET biosensors in mammalian cells. Then, we provide a step-by-step analysis for rapid FRET measurements by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) on a custom-built setup. However, this protocol is also applicable to alternative commercial solutions available. We conclude by considering the most appropriate FRET controls for an AURKA-based biosensor, and by highlighting potential future improvements to further increase the sensitivity of this tool.

The activation of the multifunctional Ser/Thr kinase AURKA is hallmarked by its autophosphorylation on Thr288. Fluorescent probes relying on FRET can discriminate between its inactive and activated states. Here, we illustrate some strategies for probe engineering, together with a rapid FRET protocol to follow the kinase activation throughout mitosis.

Monitoraggio in tempo reale dell'attivazione dell'aurora chinasi A utilizzando biosensori FRET conformazionali in cellule vive

Epithelial cancers are often hallmarked by the overexpression of the Ser/Thr kinase Aurora A/AURKA. AURKA is a multifunctional protein that activates upon ...