ברצוננו להודות לחברי Skok המעבדה, במיוחד סוזנה יואיט, לדיונים והערות. עבודה זו נתמכת על ידי המכון הלאומי לבריאות מענקי R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS הוא לוקמיה ולימפומה חוקר חברה. JC הוא עמית אירווינגטון מכון לחקר הסרטן. MM נתמך על ידי קרן לאומי למדע חינוך גרנט אינטגרטיבית בוגר והמחקר Traineeship (NSF IGERT 0333389).

1. תיוג DNA Probe עם fluorophores: ניק תרגום (~ 6 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקי BAC-DNA (שהוכן על ידי מקסי הכנה) או פלסמידים או מוצרי PCR, כל resuspended בH 2 O, יכול לשמש לתיוג. שים לב שעבור אות דג חזקה, בדיקות צריכות לכלול לפחות 10 ק&quot;ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת DNA בRNase למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס (כל ריאגנטים מופיעים בטבלת 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תגובת תרגום הכינוי ל2 שעות ב 16 ° C (ראה לוחות 2 ו 3). שיטות חלופיות של תיוג ישיר ניתן להשתמש (לדוגמה: לדג, Invitrogen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את התגובה לשעה אחת ב-80 ° C או הלילה ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את גודל חללית על 2% agarose ג&#39;ל. המריחה צריכה להיות בין 100 ל 1000 נקודתי בסיס, עם הרוב בכ 300-500 נקודתי בסיס (שים לב שכתם Cy5-בדיקות אינו גלוי). אם ה-DNA אינה מתעכל מספיק, יותר DNA פול ואניDNase אני יכול להוסיף לתגובה וטופחתי לשעות ועוד שתיים על 16 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את בדיקות על 0.025 מסנני מ&quot;מ בשתי כוסות ליטר מלא עם H 2 0 לשתיים שעות בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף לגורמים החוסמים את הבדיקות כדלקמן: 10 מיקרוגרם של ה-DNA Cot-1, 10 מיקרוגרם של ה-DNA וHybloc 100 מיקרוגרם של זרע סלמון ל10 מיקרוגרם של בדיקות DNA. בדיקות DNA חנות ב -20 ° C. </li></ol> 2. בדיקת רטיבות / denaturation / חישול קדם (שעתי 3-4) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בין 0.3 מיקרוגרם ומיקרוגרם 1 מתוך הבדיקה DNA משמש לcoverslip. בדיקות לערבב עם 0.1 נפח של 3M NaAc (pH 5.2) ו -2.5 כרכים של 100% אתנול, דגירה במשך שעה אחת ב-80 ° C או הלילה ב -20 ° C וספין למטה ב13000 סל&quot;ד ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שים לב שהסכום של הבדיקה DNA עשוי להיות מותאם בהתאם לאיכות של ה-DNA ובאזור הגרעיני של הכלאה. שיטות חלופיות של תיוג ישיר עשויות לאפשר שימוש בכמויות מופחתות שלחללית. לצורך זיהוי של אותות דגי DNA מרובים על שקופית אחת, הבדיקות השונות ניתן זרזה יחד (למעט בדיקות שלא צריך להיות מראש annealed, כמו רצפים חוזרים). בדיקות עבור מספר ניסויים שבוצעו באותו הזמן ניתן גם זרזה יחד. פלטות צריכות להיות צבעוניות בקלילות על פי fluorophores משמש (אם כמויות קטנות של בדיקות הם זרזו, הגלולה לא יכולה להיות גלויה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדורים יבשים וresuspend אותם בחיץ הכלאה 15 μl (ראה טבלה 4) לcoverslip עם רועד (באמצעות אפנדורף thermomixer) בחושך ב37-45 מעלות צלזיוס (כ 20 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדיקות לפגל ל5 דקות ב75-95 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום anneal בדיקות על 37 מעלות צלזיוס במשך 30-60 דקות. אורכו של חישול מראש עשוי להיות מותאם בהתאם למורכבות והאיכות של הבדיקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל בדיקות לcoverslips להכלאה בין הלילה (ראה סעיף 3). </li></ol> 3. 3דגים ממדיים DNA - היום הראשון (~ 3 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים שאינם חסידים מרוכזים בנפח קטן של 1x PBS (~ 2x10 5 תאים ב1x PBS μl 5-10 לcoverslip) והפילו במרכז coverslip מצופה פולי-L-ליזין. תאי חסיד צריכים להיות מתורבתים בcoverslips לפחות 24 שעות (~ מפגש 70%) (coverslips יכול להיות מצופה עם 0.1% ג&#39;לטין). 18x18 ל24-24 coverslips מ&quot;מ המרובע מונחים בצלחות 6-כן, ובכל רחבי הפרוטוקול, 2 מ&quot;ל של כל פתרון משמש גם ל( 1.5 המ&quot;מ coverslips לחלופין עגול יכולה להיות ממוקם בצלחות 12/24-well). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן תאים בparaformaldehyde 2% / 1x PBS, 7-7.4 pH, למשך 10 דקות בRT (מניות PFA 4% ניתן aliquoted, מאוחסן ב -20 ° C). Paraformaldehyde ניתן לרכוש בתמיסה (16%), או פתרוני מניות 4% יכולים להיות מוכן מאבקה / prills. אבקת Paraformaldehyde מומסת ב1x PBS ב&gt; 60 ° C (pH ניתן להעלות 8-9 כדי להקל על פירוק), מקורר על קרח, להתאיםאד החומציות 7-7.4, מסונן aliquoted בבזים ואוחסנו במשך שבועות ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלוש שטיפות ב1x PBS, permeabilize תאים בקרח קר 0.4% Triton-X-100 / 1x PBS למשך 5 דקות על קרח. אורך permeabilization יכול להיות מותאם בהתאם לתא מסוג NB:. אם דגי DNA הוא בשילוב עם immunofluorescence, immunostaining יש לבצע בשלב זה (ראה סעיף 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלוש שטיפות ב1x PBS, תאי אינקובטורים עם 0.1 מיקרוגרם / μl RNase ב1x PBS לשעה 1 ב 37 ° C. Coverslips ממוקם תא בצד למטה על ירידה של 100 μl של פתרון בparafilm או שקופית בתא לח. Coverslips מכן הוציא בזהירות עם מלקחיים. אם כל התנגדות הוא נתקל, coverslips צריך להיות מוצף ב1x PBS כדי למנוע ניזק לתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלוש שטיפות ב1x PBS, permeabilize תאים בקרח קר 0.7% Triton-X-100 / 0.1 מ &#39;HCl למשך 10 דקות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלוש שטיפותייn 1x PBS, תאים לפגל ב1.9 מ &#39;HCl למשך 30 דקות ב RT. לחלופין, תאים ניתן מפוגלים ב50% פוראמיד / 2x SSC ב75-80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות. שימו לב שאורך הכלאה (וטמפרטורה) יכול להיות מותאם בהתאם לתא מהסוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי שלוש שטיפות ב1x PBS קר כקרח, להכליא תאים עם בדיקות במהלך לילה על 37 מעלות צלזיוס בתא חשוך ולח. Coverslips ממוקם תא בצד למטה על ירידה של 15 μl של חללית בשקופית, ונחתם במלט גומי. </li></ol> 4. 3-ממדי חיסוני-FISH - היום הראשון (~ 6-7 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגים בשילוב immunofluorescence / DNA, אימונו-מכתים צריכות להתבצע לאחר permeabilization ב0.4% Triton-X-100 (שלב 3.3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאים בחסימת פתרון למשך 30 דקות ב RT (2.5% שור אלבומין (BSA), 10% סרום עיזים רגיל, 0.1% Tween-20). פתרון החסימה מסונן, aliquoted ב1.5 Eppendorfs מ&quot;ל ומאוחסן למ &#39;onths ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאים עם הנוגדן הראשוני שהועלה נגד החלבון או שינוי היסטון עניין דילול בפתרון חסימה, לשעה אחת בRT בתא לח. כאן אנו מראים דוגמה של נוגדנים נגד-139 סרין phosphorylated של H2AX (γ-H2AX, Millipore; ראה טבלה 5 לפרטים נוספים). Coverslips ממוקם תא בצד למטה על ירידה של 100 μl של פתרון בparafilm או שקופית בתא לח. Coverslips מכן הוציא בזהירות עם מלקחיים (מוצף 1x PBS במידת צורך). שים לב שהדילול ואורך דגירה יכולים להיות מותאם בהתאם לאיכות של הנוגדנים ותאים של סוגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים ב0.2% BSA / 0.1% Tween-20 / 1x PBS, שלוש פעמים 5 דקות בRT עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת תאים עם הנוגדן המשני fluorophore מצומדות המתאים דילול בחסימת פתרון לשעה אחת בRT בחדר חשוך ולח. כאן אנו מראים דוגמה לזיהוי עםנוגדן עז משני אנטי עכבר (אלקסה פלואוריד 488 או 555, Invitrogen; ראה טבלה 5 לפרטים נוספים). נוגדנים משניים Hapten-מצומדות (ביוטין, digoxigenin, וכו &#39;) יכולים לשמש גם. במקרה זה, צעד נוסף לגילוי נאות (streptavidin, נגד חפירות, וכו &#39;) יכול להתבצע לפני או אחרי על לילה הכלאת DNA-FISH. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את תאים ב0.1% Tween-20 / 1x PBS, שלוש פעמים 5 דקות בRT עם רועד בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים שלאחר התיקון בparaformaldehyde 2% / 1x PBS עבור 10 דקות ב RT בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך דגי DNA כאמור לעיל מהדגירה בRNase (שלב 3.4). </li></ol> 5. דנ&quot;א 3-ממדי דגים / חיסוני-FISH - היום השני (~ 2 שעות) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות בטון גומי, coverslips מבול עם 2x SSC, להסיר בזהירות עם מלקחיים ולמקם אותם בבארות המכילות תמיסת שטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים ב2x SSC למשך 30 דקות ב 37 ° C בחושך עם רעד.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים ב2x SSC למשך 30 דקות ב RT בחושך עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים ב1x SSC למשך 30 דקות ב RT בחושך עם רועד שימו לב כי במקרה של denaturation עם פוראמיד, מתרחצת צריך להיות מוחלף על ידי הבא:. כביסות 3 ב 50% פוראמיד / 2x SSC ו 3 כביסות ב2x SSC, 5 דקות כל אחת, ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר בתאים להאריך בינוני גוברים זהב מכיל 1.5 מיקרוגרם / המ&quot;ל DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) לcounterstaining של DNA המוחלט. Coverslips ממוקם תא בצד למטה על ירידה של 10-15 μl של הרכבה בינונית בשקופית וחתומה בציפורניים. שקופיות נשמרות לחודשים ב -20 ° C. </li></ol> 6. מיקרוסקופיה וניתוח 3D <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות 3D ניתן לרכוש עם מיקרוסקופ מערכות שונות. בניסויים שלנו, חלקים אופטיים מופרדים 0.3 מיקרומטר נאספים על מערכת Leica SP5 confocal AOBS (Beam ספליטר Acousto-אופטי). שימו לב שההפרדה בין opticaמטוסי הליטר יכולים להיות מותאמים בהתאם לסוג הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ערימות של תמונות 3D ניתן לנתח באמצעות תוכנות וכלים שונים. אנו משתמשים בתוכנת J תמונה כדי להעריך מדידות מרחק בין לוקוסים של ריבית ולנתח סוגים שונים של עמותה של הלוקוסים של ריבית עם תאים תת גרעיניים או חלבונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הניתוחים הסטטיסטיים מבוצעים כדי להשוות בין שניים (או יותר) תנאים ביולוגיים שונים עם pairwise הערכה (הים) משמעות: השוואה בין סוגי תאים שונים או בשלבים, השוואה בין מוקדי עניין שונים. בכל המבחנים הסטטיסטיים, P-ערכי ≤ 5.00E-2 (= 0.05) נלקחים להיות משמעותי (1.00E-2 ≤ P ≤ 5.00E-2 * משמעותיים; 1.00E-3 ≤ P ≤ 1.00E-2 * * משמעותי מאוד, P &lt;1.00E-3 *** מאוד משמעותי). </li></ol> ניתוח סטטיסטי של ההתפלגות השלמה של מרחקים בין שני אללים. אנחנו ג 1onstruct עקומות תדר הפצה מצטברות על פני כל טווח המרחקים שנמדדו בין 2 alleles.To להעריך את החשיבות של הבדלים בהפצות של מרחקים אמפיריים בין allelic אנו משתמשים פרמטרית שתי מדגם קולמוגורוב סמירנוב-המבחן (KS) 13,14. ניתוח סטטיסטי של קשר הדוק (כלומר זיווג) של שני האללים באמצעות מרחק אופטימלי חתוך. כדי לזהות המגוון של רוב ההבדלים חזקים במרחקים בין שני אללים או לוקוסים, אנו משתמשים בסדרה של שני זנב מבחן פישר מדויק 15 שניות. כלומר, בכל מרחק שנמדדנו לבדוק אם תנאי אחד הוא ייצוג יתר משמעותי במרחקים קצרים יותר בין שתי דגימות. המינימום בהפצה של P-ערכים מציין את הטווח של מרחקים שאמורים להיחשב כחתוכים לעמותה קרובה (כלומר זיווג) של שני אללים. בהמשך הבדיקה המדוקדקת של שני זנבות הפישר משמשת to להעריך את המשמעות של זיווג של שני אללים בערך זיהה החתך 15. תיקוני בדיקות מרובים שיחולו בחשבון למספר הכולל של בדיקות שבוצעו פישר 16. ניתוח סטטיסטי של עמותה של מוקד העניין עם תאים תת גרעיניים או חלבונים. מבחן דו זנב פישר המדויק משמש ללנתח את המשמעות של קשר בין מוקד העניין עם תאים או חלבונים 15 שונים.

<ol>
	<li>Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-chromosome+inactivation+in+mouse+embryonic+stem+cells:+analysis+of+histone+modifications+and+transcriptional+activity+using+immunofluorescence+and+FISH.">X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH.</a> Methods in enzymology. , 376-405 (2004).</li><li>Cremer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+3D+fluorescence+in+situ+hybridization+for+imaging+interphase+chromosomes.">Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes.</a> Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).</li><li>Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+immunofluorescence,+RNA+fluorescent+in+situ+hybridization,+and+DNA+fluorescent+in+situ+hybridization+to+study+chromatin+changes,+transcriptional+activity,+nuclear+organization,+and+X-chromosome+inactivation.">Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation.</a> Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).</li><li>Solovei, I., Cremer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-FISH+on+cultured+cells+combined+with+immunostaining.">3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining.</a> Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).</li><li>Markaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+3D-FISH+and+super-resolution+structured+illumination+microscopy+for+studies+of+3D+nuclear+architecture:+3D+structured+illumination+microscopy+of+defined+chromosomal+structures+visualized+by+3D+(immuno)-FISH+opens+new+perspectives+for+studies+of+nuclear+architecture.">The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture.</a> BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).</li><li>Heard, E., Bickmore, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+gene+regulation+and+chromosome+territory+organisation.">The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation.</a> Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).</li><li>Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+sequence:+cellular+organization+of+genome+function.">Beyond the sequence: cellular organization of genome function.</a> Cell. 128, 787-800 (1016).</li><li>Fraser, P., Bickmore, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+organization+of+the+genome+and+the+potential+for+gene+regulation.">Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation.</a> Nature. 447, 413-417 (2007).</li><li>Cremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+territories--a+functional+nuclear+landscape.">Chromosome territories--a functional nuclear landscape.</a> Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).</li><li>Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+function+of+nuclear+bodies.">Biogenesis and function of nuclear bodies.</a> Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).</li><li>Dostie, J., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+organization+in+the+nucleus+-+charting+new+territory+across+the+Hi-Cs.">Chromosome organization in the nucleus - charting new territory across the Hi-Cs.</a> Current opinion in genetics &amp; development. 22, 125-131 (2012).</li><li>van Steensel, B., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics+tools+for+unraveling+chromosome+architecture.">Genomics tools for unraveling chromosome architecture.</a> Nature. 28, 1089-1095 (2010).</li><li>Massey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Kolmogorov-Smirnov+Test+for+Goodness+of+Fit.">The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit.</a> Journal of the American Statistical Association. 253, 1951 (1951).</li><li>Collins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RUNX+transcription+factor-mediated+association+of+Cd4+and+Cd8+enables+coordinate+gene+regulation.">RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation.</a> Immunity. 34, 303-314 (2011).</li><li>Fisher, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+interpretation+of+&#967;2+from+contingency+tables,+and+the+calculation+of+P.">On the interpretation of &#967;2 from contingency tables, and the calculation of P.</a> Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).</li><li>Benjamini, Y. H., Yosef, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+false+discovery+rate:+a+practical+and+powerful+approach+to+multiple+testing.">Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing.</a> Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).</li><li>Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+changes+in+accessibility,+nuclear+positioning,+recombination,+and+transcription+at+the+Igkappa+locus.">Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus.</a> J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).</li><li>Fuxa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pax5+induces+V-to-DJ+rearrangements+and+locus+contraction+of+the+immunoglobulin+heavy-chain+gene.">Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene.</a> Genes Dev. 18, 411-422 (2004).</li><li>Goldmit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+ontogeny+of+the+Igk+locus+during+B+cell+development.">Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development.</a> Nature. 6, 198-203 (2005).</li><li>Hewitt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+between+the+Igk+and+Igh+immunoglobulin+loci+mediated+by+the+3'+Igk+enhancer+induces+'decontraction'+of+the+Igh+locus+in+pre-B+cells.">Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3' Igk enhancer induces 'decontraction' of the Igh locus in pre-B cells.</a> Nature. 9, 396-404 (2008).</li><li>Johnson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-7+Functionally+Segregates+the+Pro-B+Cell+Stage+by+Regulating+Transcription+of+Recombination+Mediators+across+Cell+Cycle.">IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle.</a> Journal of Immunology. , (2012).</li><li>Karnowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+and+nuclear+repositioning+of+the+lambda5+gene+locus+at+the+pre-b+cell+stage+requires+Aiolos+and+OBF-1.">Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1.</a> PLoS ONE. 3, e3568 (2008).</li><li>Kosak, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subnuclear+compartmentalization+of+immunoglobulin+loci+during+lymphocyte+development.">Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development.</a> Science. 296, 158-162 (2002).</li><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yin+Yang+1+is+a+critical+regulator+of+B-cell+development.">Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development.</a> Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).</li><li>Parker, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pre-B-cell+receptor+induces+silencing+of+VpreB+and+lambda5+transcription.">The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription.</a> Embo J. 24, 3895-3905 (2005).</li><li>Roldan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locus+'decontraction'+and+centromeric+recruitment+contribute+to+allelic+exclusion+of+the+immunoglobulin+heavy-chain+gene.">Locus 'decontraction' and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene.</a> Nature immunology. 6, 31-41 (2005).</li><li>Skok, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonequivalent+nuclear+location+of+immunoglobulin+alleles+in+B+lymphocytes.">Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes.</a> Nature. 2, 848-854 (2001).</li><li>Skok, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+contraction+by+looping+of+the+Tcra+and+Tcrb+loci+in+rearranging+thymocytes.">Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes.</a> Nature immunology. 8, 378-387 (2007).</li><li>Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multifunctional+element+in+the+mouse+Igkappa+locus+that+specifies+repertoire+and+Ig+loci+subnuclear+location.">A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location.</a> Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).</li><li>Hewitt, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RAG-1+and+ATM+coordinate+monoallelic+recombination+and+nuclear+positioning+of+immunoglobulin+loci.">RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci.</a> Nature immunology. 10, 655-664 (2009).</li><li>Deriano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RAG2+C+terminus+suppresses+genomic+instability+and+lymphomagenesis.">The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis.</a> Nature. 471, 119-123 (2011).</li><li>Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+repositioning+of+genes+in+the+nucleus+of+lymphocytes+preparing+for+cell+division.">Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division.</a> Molecular cell. 3, 207-217 (1999).</li><li>Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H2AX:+the+histone+guardian+of+the+genome.">H2AX: the histone guardian of the genome.</a> DNA repair. 3, 959-967 (2004).</li><li>Croft, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+the+localization+and+morphology+of+chromosomes+in+the+human+nucleus.">Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus.</a> The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).</li><li>Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced.">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li><li>Walter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+many+colors+in+FISH+on+3D-preserved+interphase+nuclei.">Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei.</a> Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).</li><li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+wave+of+cellular+imaging.">A new wave of cellular imaging.</a> Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).</li><li>Dobbie, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMX:+a+new+platform+for+multimodal,+multichannel+wide-field+imaging.">OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).</li><li>Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization+with+high-complexity+repeat-free+oligonucleotide+probes+generated+by+massively+parallel+synthesis.">Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis.</a> Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

הטכניקות המפורטות לעיל שמשו במעבדה שלנו לנתח את הרגולציה של רקומבינציה V (D) J של אימונוגלובולין ולוקוסי TCRA / ד בפיתוח לימפוציטים 30,31. אנו בטוחים כי טכניקה זו יכולה להיות מותאמת לזיהוי של חלבונים שונים גרעיניים, תאים גרעיניים ולוקוסים, בסוגי תאים שונים. ?...

מנגנוני ממסד epigenetic הדק וירושה של פרופילי תעתיק ספציפיים התפתחותיים ותא מסוג. ברמה אחת זה כרוך אפנון של אריזת הכרומטין שמגדירה אזורים גנטיים פעילים או שקטים. בקנה מידה גדול יותר, ארגון 3D הגלובלי של הגנום גרעיני והאדריכלות גם לשחק תפקיד בשליטה על דפוסי תעתיק. לפיכך, נתיחה של תכונות epigenomic אלה חיוני להבנה מלאה של איך גנים מוסדרים 6-11. שילוב דגי DNA immunofluorescence ו3D מספקים הזדמנות ייחודית כדי להשלים ניתוחים מולקולריים והביוכימי ידי הערכת אינטראקציות / עמותות של רצפי DNA ו / או חלבונים בתוך הגרעין ספציפיות. יתר על כן, אילו טכניקות תפוקה גבוהה הגנום כגון הכרומטין immunoprecipitation (שבב ואילך) או קונפורמציה לכידת כרומוזום בשילוב עם רצף עמוק (4C-seq, 5C, Hi-C) מספקות dat הגלובליעל אוכלוסיות תאים 12, טכניקות דגי immunofluorescence / דנ&quot;א לאפשר ניתוחים ברמת התא הבודדה. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי בו זמני של שינויי היסטון ידי רצפי DNA וimmunofluorescence ידי דגי DNA אחרי מיקרוסקופיה וניתוחי 3D (חיסוני דגי 3D). היתרון של פרוטוקול זה הוא ההדמיה המשולבת של דנ&quot;א ושימור של מבנים חלבוניים. הניסיון שלנו בתחום זה אפשר לנו לשפר ולפשט את פרוטוקולים קיימים. למרות שיש לנו להשתמש בפרוטוקול זה כדי לזהות הפסקות גדילי הדנ&quot;א כפולים בהלימפוציטים עוברים רקומבינציה, שיטה זו יכולה להיות מיושמת על חלבונים אחרים וסוגי תאים אחרים.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב / חומרים </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> דיג </td><td> # BP2470 </td><td></td></tr><tr><td> RNase </td><td> סיגמא </td><td> # R4642 </td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td> סיגמא </td><td> # DNTP100 </td><td></td></tr><tr><td> אלקסה dUTP </td><td> Invitrogen </td><td> # C11397 ל-C-11401 </td><td></td></tr><tr><td> Cy3 או Cy5 dUTP </td><td> דיג </td><td> # 45-001-xxx </td><td></td></tr><tr><td> אני DNase </td><td> רוש </td><td> # 04536282001 </td><td></td></tr><tr><td> DNA פול אני </td><td> Biolabs </td><td> # M0209 </td><td></td></tr><tr><td> 0.025 מסנני מיקרומטר </td><td> Milliporדואר </td><td> # VSWP02500 </td><td></td></tr><tr><td> Cot-1-DNA 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> Invitrogen </td><td> # 18440 </td><td></td></tr><tr><td> Hybloc DNA 1 מ&quot;ג / מ&quot;ל </td><td> אפלייד גנטיקה </td><td> # MHB </td><td></td></tr><tr><td> זרע סלמון </td><td> סיגמא </td><td> # D1626 </td><td> האבקה לresuspended ב 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל בH 2 O </td></tr><tr><td> NaAc (נתרן יצטט, pH 5.2, פתרון חיץ) </td><td> סיגמא </td><td> # S7899 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll 400 (מול כיתת Biol) </td><td> דיג </td><td> # 525 </td><td></td></tr><tr><td> Polyvinylpyrrolidone (מול כיתת Biol) </td><td> דיג </td><td> # BP431 </td><td></td></tr><tr><td> אבקת סולפט dextran </td><td> סיגמא </td><td> # D8906 </td><td></td></tr><tr><td> (מלוח סודיום פוספט-EDTA) 20x פתרון SSPE </td&gt; <td> דיג </td><td> # BP1328 </td><td></td></tr><tr><td> פוראמיד </td><td> דיג </td><td> # BP227 </td><td></td></tr><tr><td> Coverslips </td><td> דיג </td><td> # 12-548-B </td><td></td></tr><tr><td> שקופיות </td><td> דיג </td><td> # 12-550 </td><td></td></tr><tr><td> צלחות 6-כן </td><td> דיג </td><td> # 0720080 </td><td></td></tr><tr><td> PBS, 10x </td><td> דיג </td><td> # MT-46-013-CM </td><td></td></tr><tr><td> פתרון פולי-L-ליזין </td><td> סיגמא </td><td> # P8920 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyde, prills, 95% </td><td> סיגמא </td><td> # 441244 </td><td></td></tr><tr><td> טריטון-X-100, מול Biol כיתה </td><td> סיגמא </td><td> # T8787 </td><td></td></tr><tr><td> BSA (אלבומין סרום שור) Fraction V </td><td> דיג </td><td> # BP 1600 </td><td></td></tr><tr><td> סרום עיזים רגיל </td><td> מעבדות וקטור </td><td> # S-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Tween-20, מול Biol כיתה </td><td> סיגמא </td><td> # P9416 </td><td></td></tr><tr><td> SSC (ציטראט נתרן המלוח) 20x פתרון </td><td> דיג </td><td> # BP1325 </td><td></td></tr><tr><td> להאריך מגיב antifade זהב </td><td> Invitrogen </td><td> # P36930 </td><td></td></tr><tr><td> DAPI (4 &#39;,6-diamidino-2-phenylindole) </td><td> סיגמא </td><td> # D9542 </td><td></td></tr><tr><td> המלט הטוב ביותר מבחן אחד מעייל גומי </td><td> חנויות לציוד אומנות או במשרד </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> טבלת 1. ריאגנטים ספציפיים וציוד קטן. </td></tr></tbody></table>

combined immunofluorescence and dna fish on 3d-preserved interphase nuclei to study changes in 3d nuclear organization

פלורסנט כלאה באתר באמצעות בדיקות DNA על 3-ממדי גרעינים נשמרו אחרי מיקרוסקופיה confocal 3D (דגי DNA 3D) מייצג את הדרך הישירה ביותר כדי לחזות את המיקום של לוקוסים גנטיים, כרומוזומלית תתי אזורים או שטחים שלמים בתאים בודדים. סוג זה של ניתוח מספק תובנה הארכיטקטורה העולמית של הגרעין, כמו גם את ההתנהגות של לוקוסים הגנומי ספציפיים ואזורים בתוך השטח הגרעיני. Immunofluorescence, לעומת זאת, מאפשר זיהוי של חלבונים גרעיניים (ההיסטונים שונים, משתנה ומכפילי היסטון, מכונות וגורמי שעתוק, תת תאים גרעיניים, וכו &#39;). האתגר הגדול בשילוב דגי DNA immunofluorescence ו3D הוא, מצד אחד לשמר epitope זוהה על ידי הנוגדן כמו גם ארכיטקטורת 3D של הגרעין, ומצד שני, על מנת לאפשר את החדירה של הבדיקה DNA כדי לזהות לוקוסים גנטיים או טריטוריות כרומוזום 1-5. כאן אנו מספקים פרוטוקול שמשלב הדמיה של שינויי הכרומטין עם לוקוסים הגנומי גרעינים נשמרו 3D.

ה-DNA וחיסוני דגים רגילים במעבדת Skok ללמוד את השינויים בארגון גרעיני הקשורים בתהליך של רקומבינציה V (D) J של לוקוסי קולט אנטיגן במהלך פיתוח הלימפוציטים B ו-T. הטכניקות המפורטות לעיל תאפשרנה לנו i) למדוד מרחקים בין שני הקצוות של לוקוס (התכווצות) ii) למדוד מרחקים בין האללים (לוק...

Watch this Scientific Journal Video about Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization at JoVE.com

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי בו זמני של שינויי היסטון ידי רצפי DNA וimmunofluorescence ידי דגי DNA אחרי מיקרוסקופיה וניתוחים (דגי 3D החיסוני DNA) 3D.

Immunofluorescence שילוב ודגי DNA על 3D-השתמרו גרעיני Interphase לחקר שינויים בארגון גרעיני 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

combined-immunofluorescence-dna-fish-on-3d-preserved-interphase

Research

JoVE Journal

Biology

18.2K Views.  New York University School of Medicine. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי בו זמני של שינויי היסטון ידי רצפי DNA וimmunofluorescence ידי דגי DNA אחרי מיקרוסקופיה וניתוחים (דגי 3D החיסוני DNA) 3D.

Video: Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

בדיקת רגישות חזותית על מהירות ועל כיוון התנועה של לטאות

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

DNA-based Fish Species Identification Protocol

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. This versatile method employs PCR amplification of genomic DNA extracted from fish samples, followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis to generate fragment patterns that can be resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer and matched to the correct species using RFLP pattern matching software.
The fish identification method uses a simple, reliable, spin column- based protocol to isolate DNA from fish samples. The samples are treated with proteinase K to release the nucleic acids into solution. DNA is then isolated by suspending the sample in binding buffer and loading onto a micro- spin cup containing a silica- based fiber matrix. The nucleic acids in the sample bind to the fiber matrix. The immobilized nucleic acids are washed to remove contaminants, and total DNA is recovered in a final volume of 100 &mu;l. The isolated DNA is ready for PCR amplification with the provided primers that bind to sequences found in all fish genomes. The PCR products are then digested with three different restriction enzymes and resolved on the Agilent 2100 Bioanalyzer. The fragment lengths produced in the digestion reactions can be used to determine the species of fish from which the DNA sample was prepared, using the RFLP pattern matching software containing a database of experimentally- derived RFLP patterns from commercially relevant fish species.

This publication describes how to use the Agilent Fish Species Identification System to identify the species of a fish by extracting DNA and performing PCR and RFLP analysis.

ה-DNA מבוססי פרוטוקול זיהוי דגים המינים

We have developed a fast, simple, and accurate DNA-based screening method to identify the fish species present in fresh and processed seafood samples. ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

דגי ה-DNA 3D חזקים באמצעות בדיקות שכותרתו ישירות

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

הערכת תרומות מינים ספציפיות כדי Craniofacial פיתוח באמצעות מפלצות שליו-ברווז

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

DNA-RNA בשילוב פלורסנט<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) לחקר איון כרומוזום X בתאי גזע הבדיל נקבה עכבר עוברי

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high radiation doses. Addressing questions related to environmental, occupational and public health safety in a proper and scientifically justified manner heavily relies on the ability to accurately measure the biological effects of low dose pollutants, such as ionizing radiation and chemical substances. DNA damage and repair are the most important early indicators of health risks due to their potential long term consequences, such as cancer. Here we describe a protocol to study the effect of chronic in vivo exposure to low doses of &#947;- and &#946;-radiation on DNA damage and repair in mouse spleen cells. Using a commonly accepted marker of DNA double-strand breaks, phosphorylated histone H2AX called &#947;H2AX, we demonstrate how it can be used to evaluate not only the levels of DNA damage, but also changes in the DNA repair capacity potentially produced by low dose in vivo exposures. Flow cytometry allows fast, accurate and reliable measurement of immunofluorescently labeled &#947;H2AX in a large number of samples. DNA double-strand break repair can be evaluated by exposing extracted splenocytes to a challenging dose of 2 Gy to produce a sufficient number of DNA breaks to trigger repair and by measuring the induced (1 hr post-irradiation) and residual DNA damage (24 hrs post-irradiation). Residual DNA damage would be indicative of incomplete repair and the risk of long-term genomic instability and cancer. Combined with other assays and end-points that can easily be measured in such in vivo studies (e.g., chromosomal aberrations, micronuclei frequencies in bone marrow reticulocytes, gene expression, etc.), this approach allows an accurate and contextual evaluation of the biological effects of low level stressors.

Measuring DNA Damage and Repair in Mouse Splenocytes After Chronic In Vivo Exposure to Very Low Doses of Beta- and Gamma-Radiation

A protocol to evaluate changes in DNA damage levels and DNA repair capacity that may be induced by chronic in vivo low dose irradiation in mouse spleen lymphocytes, by measuring phosphorylated histone H2AX, a marker of DNA double-strand breaks, using flow cytometry is presented.

מדידת נזק לדנ&quot;א ותיקון בSplenocytes העכבר לאחר כרוני<em&gt; In vivo</em&gt; חשיפה למינונים נמוכים מאוד של בטא וגמא-קרינה

Low dose radiation exposure may produce a variety of biological effects that are different in quantity and quality from the effects produced by high ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

בידוד של אזורים הגנומי ספציפיים וזיהוי של Associated מולקולות על ידי enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

שיטות מחקר לשינויים הגלום צבירת חלבון עם הגיל ב Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Sequential Immunofluorescence and Immunohistochemistry on Cryosectioned Zebrafish Embryos

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish embryo is an excellent tool for examining such interactions with an in vivo model. Whole-mount immunohistochemical and immunofluorescence assays are frequently applied in zebrafish embryos to assess protein expression. However, it can be difficult to achieve accurate mapping of co-localized proteins in three-dimensional space. In addition, some studies may require the use of two antibodies that are not compatible with the same technique (e.g., antibody 1 is only suitable for immunohistochemistry and antibody 2 is only suitable for immunofluorescence). The purpose of the method described herein is to perform sequential immunofluorescence and/or immunohistochemistry on individual cryosections derived from early-stage zebrafish embryos. Here we describe the use of sequential rounds of immunofluorescence, imaging, immunohistochemistry, imaging for a single cryosection in order to achieve precise identification of protein expression at the single-cell level. This methodology is suitable for any study in early-stage zebrafish embryos that requires accurate identification of multiple protein targets in individual cells.

This protocol demonstrates sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosections from early-stage zebrafish embryos enabling precise colocalization analyses in specific cell populations.

מרפאוולוגיה רציפה ואימונוהיסטוכימיה על קריוסינות עוברי דג

Investigation of intercellular interactions often requires discrete labeling of specific cell populations and precise protein localization. The zebrafish ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.