אנו מכירים תמיכה מהקיץ מחקר המלגה של אוניברסיטת דיקן דוכס (), איגוד לב האמריקאי (AHA) מלגת 11POST7160006 (CG), המכונים הלאומי לבריאות (NIH) מענקי R01-EY021872 מהלאומי Eye Institute (EED), R01HD04260 מ המכון הלאומי לבריאות ילד והתפתחות (נ&quot;ח), וR01DK072301 R01DK075972 מהמכון הלאומי לסוכרת והפרעות עיכול כליות (נ&quot;ח), והאיחוד האירופי (ממומן על ידי האיחוד האירופי 7 ה FP תחת GA ע&quot;נ 241,955, פרויקט SYSCILIA;. EED, נ&quot;ק) NK הוא ז&#39;אן נכבד וג&#39;ורג&#39; וו Brumley פרופסור.

1. ביואינפורמטיקה ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע אם הגן האנושי של עניין יש ortholog דג הזברה, ואם כן, כמה עותקים. אנו ממליצים תפציץ גומלין <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/" target="_blank">(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)</a> של החלבון האנושי נגד הגנום דג הזברה, ואת הפיצוץ הבא של דג הזברה הטובה ביותר להכות נגד הגנום האנושי. נכון orthologs יהיה הלהיט הכי טוב בכל מקרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הגודל של מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) של הגן האנושי. אם יותר מ 6 קילו, הדגם הזה הוא בלתי פתיר בהווה, בגלל מגבלות של איכות גבוהה בשעתוק במבחנה של תבניות ארוכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשיג או ליצור מבנה המכיל ORF האנושי בpCS2 + עמוד השדרה וקטור (או שווה ערך וקטור עם &#39;אתר השעתוק SP6 ו 3&#39; 5 הפולה אות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיצוב MO לחסום שחבור או תרגום של גן דג הזברה הממוקד. אם מספר עותקים קיימים בגנום דג הזברה, יסדואר הן שתי אופציות: א) תכנון של חודש נוסף, או ב) זיהוי של אתר אחוי נשמרים באופן מלא בין עותקים שכנגד מ.ו. אחת יכול להיות יעיל. כמה רצפים שפורסמו MO זמינים <a href="http://www.zfin.org" target="_blank">בwww.zfin.org.</a> </li></ol> 2. ניתוח ביטוי בעובר דג הזברה מתפתח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע אם ortholog דג הזברה בא לידי ביטוי בהקשר רלוונטי לspatiotemporal readout פנוטיפי. אם אין נתונים ביטוי זמינים לגן של עניין, לבצע שעתוק לאחור (RT)-PCR באמצעות cDNA מכל עוברי דג הזברה או הכלאה באתרו. (ראה 2,3). </li></ol> 3. Mutagenesis אתר מכוון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> primers mutagenesis עיצוב 25-45 בסיסים באורך, עם המוטציה הרצויה במרכז. טמפרטורת התכת פריימר צריכה להיות גדולה או שווה ל -78 ° C. עיצוב פריימר mutagenesis קדימה ולאחור כדי לחשל את ההפךגדילים של פלסמיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג פריימרים לאישור רצף של ORF לאחר mutagenesis; אלה צריכים אריח על פני ~ 300 סעיפי בסיס זוג כדי לכסות את כל ORF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את תגובת mutagenesis עם פולימראז באיכות גבוהה ומחזור כדלקמן (1: 95 מעלות צלזיוס 30 שניות, 2: 95 מעלות צלזיוס 30 שניות, 3: 55 מעלות צלזיוס דקות 1, 4: 68 מעלות צלזיוס 6 דקות, 5: עבור ל2 18x, 6: 4 מעלות צלזיוס לנצח, 7: הסוף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 הגבלת endonuclease μl DpnI לכל תגובה להסיר תבנית מפוגלת סכר; לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפוך 2 μl של תגובת mutagenesis לתוך 20 תאים מוסמכים μl פי פרוטוקולים סטנדרטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק מושבות 3-4 ולחסן -5 מ&quot;ל של תקשורת LB המכיל אנטיביוטיקה מתאימה. לנער על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה ב 225 סל&quot;ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Miniprep דנ&quot;א ולקבוע את ריכוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף אתר המוטציה כדי לאשר את קיומו של המוטציה של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרצף כולו ORF כדי לאשר יושרת רצף. </li></ol> 4. תמלול mRNA במבחנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש pCS2 + תבנית לינארית, ליצור mRNA באמצעות כתרים mMessage mMachine SP6 הערכה (Ambion). אנו ממליצים להשתמש במחצית מכמות מרכיבי התגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את מדגם RNA עם ממטרים LiCl או כלורופורם פנול כמתואר בהוראות ערכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את הריכוז של ה-mRNA באמצעות הספיגה, להבטיח את תקינותו של ה-mRNA באמצעות ג&#39;ל אלקטרופורזה, ולאחסן את הדגימה בשלוש או יותר aliquots ב -80 ° C עד מוכן לשימוש. אנחנו לא ממליצים להקפיא להפשיר מחזורים מרובים של aliquots mRNA. </li></ol> 5. ב assay vivo של אובדן וריאנט של פונקציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג עוברי דג הזברה דג הזברה הזדווגויות טבעיות, ולשמור אותם על 28 מעלות צלזיוס עובר במים ב 6 או 10 מנות ס&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנהל עקומת תגובת מינון morpholino להעריך סגוליות פנוטיפ, יעילות ורעילה MO MO. הזרק עקומת מינון של בלפחות שלושה ריכוזים שונים בין 1-10 ng MO ל50-100 (שלב תא 1-4) עוברי דג הזברה / אצווה. MOS יעיל צריך להצמיח עלייה תלויה מינון של שיעור עוברים שנפגעו ביצווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוברי הפנוטיפ בשלב התפתחותי מתאים בהתבסס על ביטוי של גן דג הזברה הממוקד של ריבית ושלב שבו הפנוטיפ רלוונטי יקויימו. זה יכול להיות גם כמותי (כגון מדידה בין מבנים אנטומיים) או איכותי (על פי קריטריונים פנוטיפי סטנדרטיים). לכל זריקות קלע&gt; 24 hpf: יש להתייחס אל עוברים עם PTU (0.003% 1-פניל-2-thiourea בתקשורת עובר) בשעה 24 hpf לצמצום מרבי של היווצרות מלנוציט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחוי לחסימת MOS, יעיל MO מבחן על ידי מיצוי רנ&quot;א הכל מכל עובר lysates בנקודת הזמן של ניקוד פנוטיפי, ליצור ולנהל cDNA RT-PCR של גן המטרה באמצעות פריימרים איגוף אתר יעד מיזורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לוודא effic הדיכויiency של TB-MO, קציר שלם lysates חלבון עוברי ולנהל immunoblotting להשוות רמות של החלבון לעומת שליטה הממוקד. עם זאת, גישה זו אינה מקובלת על כל גני המטרה, כי יש תגובה הצולבת מוגבלת לנוגדנים מסחריים רבים לחלבוני דג הזברה. שתי שיטות עקיפות של מראה MO ספציפי, כוללות: א) הוכחה כי יש השפעה תלוית מינון בפנוטיפ; ו-B) מראה כי שיתוף הזרקה של mRNA wildtype עם TB-MO מצילה את הפנוטיפ ביעילות. מסיבות אלה, אנו ממליצים חוסם אחוי במידת האפשר, כי יעילות ניתן לפקח באופן ישיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הפנוטיפ הוא ציין המשך לשלב 5.7, אם לא פנוטיפ הוא ציין המשך לשלב 6.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפנוטיפים איכותיים, בחר מנת מיזורי שב50-75% מעוברים מושפעים; לפנוטיפים כמותיים, בחר מנת מיזורי שבמידת פנוטיפי היא שונה באופן משמעותי מפראי סוג (p &lt;0.001). הזרק קבוצות חדשות של דג הזברה EMBryos (שלב תא 1-4, n = 50-100/batch) עם קוקטייל המכיל את המינון &quot;assay&quot; של מיזורי ועקומת מינון של mRNA WT האנושי (הנע בין PG-mRNA 10-200; מינונים אלה להבטיח overexpression המשמעותי מעל נקודת ההתחלה של כל תמליל אחת, המייצגת 0.25-0.5% של ה-mRNA הפולה הכוללת בעובר דג הזברה). 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רעול פנים לנהל ניקוד של קבוצות הזרקה; לבחור את מינון ה-mRNA WT עם ההצלה המשמעותית ביותר בהשוואה למיזורי לבד, זה המינון &quot;assay&quot; של ה-mRNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק קבוצות חדשות (שלב תא 1-4, n = 50-100/batch) עם מינון assay של מיזורי ומינון assay של mRNA האנושי מוטציה. עוברי הפנוטיפ בשלב המתאים ולהשוות תוצאות כדי להציל את ה-mRNA אנושי WT באמצעות מבחן סטטיסטי מתאים (מבחן t או צ&#39;י בריבוע). ראה איור 1 לתוצאות והמשיכו לשלב 7. להזריק את מינוני assay של WT וmRNA מוטציה לבד לשלוט על השפעות רעילות mRNA. </li></ol> 6. ב assay vivo של Variant דוםinant שלילי או רווח של אפקטי Function <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם לא הפסד של הפנוטיפ פונקציה הוא ציין (שלב 5.5) או אם ה-mRNA מוטציה מעוררת פנוטיפים לא שונים באופן משמעותי מMO לבד (שלב 5.7), להזריק עקומת מינון הנעה בין ה-mRNA אנושי PG WT 10-200 (מומלץ 25, 50 , ו100 עמ &#39;כבדיקה ראשונית) לקבוצות עובר (שלב תא 1-4; 50-100 עוברים / אצווה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב המתאים (ראה 5.3 לעיל), לנהל ניקוד פנוטיפי, ולקבוע את המינון הגבוה ביותר שבי אין מספר משמעותי סטטיסטי של עוברים מתים ו / או מושפע בהשוואה לקבוצת ביקורת uninjected. זהו המינון &quot;assay&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק מנת assay של mRNA האנושי מוטציה (שלב תא 1-4; 50-100 עוברים / אצווה). עוברי פנוטיפ ולהשוות את תוצאות לניקוד ממינון assay של הזרקת mRNA האנושית WT או ריכוז MO assay. ראה איור 1 לתוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תוצאות אינן נבדל MO, לכייל mRNA מוטציה אנושי עם mRNA WTולהשוות לWT האנושי וזריקות mRNA שעברו מוטציה. שיפור של פנוטיפים עם קבוצות ה-mRNA-מוזרק מוטציה בתוספת WT מציין שלילי דומיננטי. שום שיפור מצביע על רווח של פונקציה. </li></ol> 7. להתרבות בתוצאות בדיקת vivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור במבחני vivo מינימום של שלוש פעמים. </li></ol> 8. שלב את דג הזברה בנתוני pathogenicity vivo עם קווים אחרים של ראיות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשוות את הנתונים המתקבלים מניסויים pathogenicity דג הזברה ל: נתונים גנטיים בתוך אילן (אם רלוונטי), נתונים בתדירות אוכלוסיית ביקורת, במבחנה (מבחני מבוססי תאים של יציבות חלבון, לוקליזציה סלולרית, תפוקת איתות, או פעילות האנזימטית). </li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

השיטות שתוארו כאן מייצגים פרוטוקול כללי החלים על assay של שינויי nonsynonymous קשורים למגוון של פנוטיפים מחלה גנטיים אנושיים (טבלה 2, איור 3). הגישות שלנו הוכיחו שימושיות כדי להעריך את ההשפעה הפוטנציאלית של וריאציה על פנוטיפים מחלה, ועל מנת לסייע לנתח מנגנוני מחלה (כגון תרומה של מוטציות שליליות דומיננטיות לתסמונת Bardet-Biedl, הפרעה בעיקר 17 אוטוזומלית רצסיבית). נכון להיום, באמצעות הפיתוח של עץ ההחלטה שהוצג, יש לנו מודל בעלות סבירה וזמן העולה על 200 גנים הקשורים קשר סיבתי עם הפרעות גנטיות, לעודף של 1,000 אללים. למרות שלא נדון בהרחבה כאן, יש לנו גם הראו כי שיטות אלה הן מתאימים למודל סוגים אחרים של נגעים גנטיים, כגון גרסאות של מספר עותקים (CNVs), כמו גם ואינטראקציות גנטיות. ניתוח של אירועים כאלה הם מעבר להיקף שלתיאור השיטה הנוכחי, למרות שהם ביסודו להסתמך על אותו העיקרון של בדיקה שיטתית של גני המועמדים (כולל זוגות של גנים שהוחדרו במקביל) כדי לקבוע אינדוקציה או החמרה של פנוטיפים קליני מתאימים. לדוגמה, כדי להבהיר שמתוך 29 גנים ב16p11.2 CNV יכול להיות רלוונטי לmicrocephaly הנצפה נצפה בחולים עם כפילויות של מקטע גנומי 660 KB, mRNAs המקביל לכל אחד מ29 גנים במיגזר הוזרקו וראש מדידות גודל נערכו ב2 DPF ו5 DPF, חושפות את התרומה עיקרית של תעתיק יחיד, KCTD13. 21 בנוסף, יש לנו להשתמש במודל זה כדי אינטראקציות גנטיות assay של נגעי גנומי בחולים עם תסמונת שניהם Bardet-Biedl ומחלת הירשפרונג. 22 על ידי השוואה של דיכוי MO מהגנים סיבתיים של שתי הזהויות הקליניות בנפרד ובו זמנית, שהיינו מסוגל לזהות את הפנוטיפ שנוצר כbeing אינטראקציה סינרגיסטית ולא רק חומרת תוסף. למרות שהוקם רגישות גבוהה (98%) וסגוליות (&gt; 82%) לגרסות התורמים לciliopathies 17, אין לנו עדיין מספיק נתונים כדי לקבוע אם אלה הם להכליל את כל readouts פנוטיפי במודלים של דג הזברה. לשם כך, מספר גדול של אללים, חזה גנטי להיות או שפיר או פתוגניים, חייב להיבדק בתוך כל קטגוריה פנוטיפי. זה יהיה חשוב במיוחד לביצוע מבחני כאלה בהגדרה הקלינית, שבו פרשנות פונקציונלית של VUSs יכול להודיע ​​אבחון וניהול רק אם הבנה חזקה של תוצאות חיוביות שגויות וגם שליליים שווא יכולה ללוות את המסירה של תוצאות כאלה לרופאים וחולים. עם זאת, שיטות אלה יכולים לתרום באופן משמעותי לכיוון הבנה טובה יותר של הנוף של מחלה גנטית אנושית. אנו צופים כי מודלים אלה לא רק לשמש כfounשעשועים לפרשנות משופרת של מידע גנטי קליני, אלא גם להיות מועסקים כמודלים שימושיים לנהל מסכי טיפוליים. בנתונים vivo יכול להיות גם בהשוואה לתחזיות חישוביות סיליקו ממקורות כגון PolyPhen 23, לנפות 24, SNPs &amp; Go 25, או MutPred 26 כדי להראות התאמה. שימו לב כי במחקר קודם של חיזוי מסדי נתונים SNPs &amp; Go וMutPred נמצאו להיות מדויק ביותר, עם דיוקים להגיע רק 0.82 ו 0.81, בהתאמה. 27 אמנם יש לנו התווינו את החוסן של שיטות אלה לקבוצת משנה של מומים אנטומיים ילדים (טבלת 2, איור 3), פנוטיפים מסוימים הם פחות צייתנים בשיטות אלה. על אף חריגים מסוימים, ישנם שלושה סוגים עיקריים של הפרעות לא מקובל הפרוטוקול שלנו. הפרעות מבוגרי תחילה (כגון מחלת פרקינסון) מהוות אתגר למודל במערכת עוברית. להאט פרוגפנוטיפים ניווניות ression (כגון דמנציה frontotemporal) עשויים לדרוש יותר זמן מאשר חלון DPF שבע פעילות MO לייצר פנוטיפ. טכנולוגיות מציאה גן אחרות כגון RNAi וsiRNA זמינים כדי להפריע או לבזות את יעד הגן, אבל זה הוכח שאף אחד ספציפי כ, יציב, שאינו רעיל, או ארוך טווח כחודש 28, ובכך גם הגבלת הזמן עבור phenotyping. שלישית, כמה מבנים בעלי חוליות, כגון ריאות של יונקים, אין לי מבנה מספיק orthologous בעובר דג הזברה. יש לנו גם סיפק הציעה תכנית מגירה לחקירה של מקרים בם הזרקת mRNA האנושית WT מובילה לפנוטיפ, למרות שאנו מזהירים זה הוא מצב חריג ולא רצוי. אז פנוטיפים מחלות מסוימים עשויים לדרוש מידה רבה יותר של הפשטה ופונדקאות. יתכן כי תפקוד גן כבר התפצל מספיק כדי להחליש את הדמיון פנוטיפי בין המודל וtrהפנוטיפ UE, או שדג זברת הפיסיולוגיה מיסודו מסבכת את ההשפעות של המחלה המושרית. במקרים כאלה, אנו ממליצים לנתיחה נוספת של הפנוטיפ הופק לפני הפיטורים. יש לנו יצרנו כמה דוגמאות מוצלחות שבי פנוטיפים בעייתיים עבור assay זה כבר דגם בעוברי דג הזברה. לדוגמה, מוטציות בTCF8, גן הקשור למחלת ניוון קרנית פוקס (FCD), היו assayed באמצעות הפרוטוקול שלנו על ידי שימוש בפגמי gastrulation כreadout פנוטיפי פונדקאית מבוסס על התפקידים הידועים של תמליל זה בהתפתחות מוקדמת. -29 במקרים אחרים, כגון כניוון שרירי מבוגרים תחילת נגרמת על ידי מוטציות בDNAJB6, שהיינו מסוגל לייצר פנוטיפים myofiber בעוברי 5dpf למרות העובדה שבני האדם הם חסרים שרירים ניכר פתולוגיה בשלושה עד ארבעה העשורים הראשונים לחייהם. 19 בנוסף לדגמי מוטציה החולפים שהוצגו כאן, אחרים לקחו גם AdvantaGE של מערכת חולפת זו למודל מחלה אנושית במגוון רחב של מערכות גוף. בדוגמה אחת, רטיניטיס פיגמנטוזה היה במתכונת בדג זברה על ידי מציאה של RP2 הגן, וכתוצאה מכך המוות של תאי רשתית וירידה בלמינציה רשתית. הצלה עם mRNA פראי סוג האנושי הביאה לפיתוח של כל שלוש השכבות של למינציה רשתית, ואילו ארבע מתוך חמש mRNAs מוטציה לא הצליחו להציל. אף 30 מודל זה של הפרעה חושית אנושית מבוסס על פנוטיפ מורפולוגי, הוא גם ניתן תגובת assay לגירויים כגון הלה אקוסטית או Prepulse עיכוב 47. לאחרונה, מודל דג הזברה היה בשימוש כדי לחקור את היווצרות המחלה אלצהיימר באמצעות חלבון מקדים עמילואיד. 31 החוקרים הראו כי מציאה הגן גרמה תולדת axonal לקויה של תאי עצב מוטורי, שניתן היה להציל עם mRNA האנושי. המודל הזה הוכיח את עצמו במיוחד אינפורמטיבי, כמודלים עכבר להציג רק phenot העדיןypes (מציאה יחידה) או קטלני לאחר לידה (מציאה כפולה). היכולת להעריך את עוברי דג הזברה in vivo לאורך פיתוח סייעה להבחין אפקט הפתוגני של חלבון עמילואיד מבשר מופחת, כמו גם עדות ישירה ובלבד שהחלבון דורש גם תחום תאי ותוך תאים לתפקוד תקין. דגמים בולטים אחרים כוללים זה של ניוון שרירים נוסף 32, 33 היהלומים Blackfan אנמיה, Axenfeld-Reiger תסמונת (פיתוח עיני וcraniofacial) 34, מחלות מעי דלקתיות 35 (פעילות נגד חיידקים), מחלת פרקינסון (36 נוירון ואובדן תנועה), ותפיסה 37 (הידרוצפלוס והיפראקטיביות). נפוץ יותר הם קווי דג הזברה מוטציה אשר הוכחו לשחזר פנוטיפ מחלה אנושי גם. נבדקו ב1,38, דגמים כוללים לוקמיה, מלנומה, cardiomyopathies המורחבים, ניוון שרירים דושן,ועוד רבים אחרים.

הפרשנות הפונקציונלית של מידע גנטי והמחאת הערך הקליני החזוי לגנוטיפ מייצגת בעיה עיקרית בגנטיקה רפואית, והוא הופך יותר ויותר נוגע ללב עם ההיתכנות הטכנית וכלכלית המואצת של רצף הגנום כולו. לכן, יש צורך לפתח וליישם פרדיגמות חדשות כדי לבדוק את pathogenicity של גרסאות שונות של משמעות לא ידועה (ואס) זוהו בחולים. לאחר מכן מבחני אלה חייבים להיות מדויקים, בזמן ויעיל וחסכוניים, ובנמל הפוטנציאל לזרז מעבר לתועלת קלינית. בעוד בעכבר באופן מסורתי את הכלי של בחירה בתחום דוגמנות מחלה אנושית, דג הזברה הם מתעוררים כתחליף מדעי והוגן מבחינה כלכלית. שלא כמו בעכבר, ביולוגיה דג הזברה מאפשרת גישה נוחה ומהירה לכל השלבים ההתפתחותיים, בסיוע של עוברי בהירות אופטית המאפשרת הדמיה בזמן אמת של פתולוגיות מתפתחות. <sup&gt; 1 הדור החדש יחסית של דג הזברה קווים מוטנטים סיפקה בדיקות נוספות ואפשרויות דוגמנות, מועסקות על ידי רבים במחקרים פונקציונליים, אך טכנולוגיה זו ממשיכה להיות מוגבלת (הנסקרת ב 1,38). לא רק שמוטציות גנטיות עם דפיקה תוספות של מוטציות ספציפיות מייגע כדי להשיג, הם גם לא נוחים לניתוח בינוני או תפוקה גבוהה לבדיקה של מגוון רחב של מוטציות בתוך גן יחיד. חשוב לציין, חבילה אחת של בדיקות יכולה לספק מידע לא רק לפוטנציאל הפתוגני של אללים, אלא גם לכיוון של השפעה ברמה התאית (למשל אובדן התפקוד לעומת רווח של פונקציה), שהוא קריטי ליידוע מצב של ירושה במשפחות, במיוחד כאשר שושלות יוחסי אדם קטנות נמל מידע מוגבל על המצב של העברת גנטית. לשם השוואה נוספת של את השימושים של עכבר זמין ודגמי דג הזברה, ראה טבלת מס &#39;1. אנחנו גם לציין כימחדש הם מגבלות מובנות למערכת מודל דג הזברה. למרות ד לי rerio פיתוח ראשוני מהיר של מערכות איברים, לבגרות מינית דורשת כשלושה חודשים. בגלל זה, הפרעות טרום לידתי וילדים הופעה הן נוחות ביותר למודל זה ביטוי חולף. בעוד אידיאלי לביצוע מסכי תרכובת כימית גדולים, השימוש של מוטציות גנטיות הוא לא ריאלי עבור הבדיקה השיטתית של אלפי גרסאות nonsynonymous שתורמות, וימשיך להיות מזוהים בהפרעות ילדים. בדיקות השלמה מתוארות כאן לנצל את העקיבות הזו, רמה הגבוהה של הומולוגיה, ושימור של תפקוד בין חלבונים אנושיים ודג זברה, במיוחד כך למולקולות הנדרשות לתהליכים התפתחותיים משומרים. איור 1 מתאר את הבדיקות ואסטרטגיה לזיהוי השפעות אלל שונות. ניתן לבצע גם אובדן התפקוד (LOF) ומבחנים דומיננטיים. לLOF, הניסוי מתחיל עם הדיכוי של הגן של עניין עם מציאה morpholino, וassaying לפנוטיפים שעשויות להיות רלוונטית לפנוטיפ הקליני תחת חקירה. דיכוי ניתן להשיג גם על ידי חסימת תרגום על ידי מיקוד MO ליד או אתר תחילת translational של לוקוס דג הזברה (תרגום חוסם morpholino; tbMO) או על ידי הפרעה בשחבור על ידי הצבת MO בצומת אחוי, בדרך כלל או גרימת הכללתו של אינטרון או אקסון הסוטה דילוג (אחוי החסימה morpholino; sbMO). כתוצאה מכך, ה-mRNA כתרים מהתמליל האנושי orthologous הוא הציג וההצלה כימות של הפנוטיפ נמדדת. ברגע שassay היא הוקם, יכולה להיות הציגה מוטציות מועמד במסר האנושי וassayed ביכולתם כדי להציל את הפנוטיפ-Induced MO באותה היעילות כמו ה-mRNA האנושית WT. לעומת זאת, למועמד אללים דומיננטיים, mRNA האנושי (אבל לא MO) הוא introducאד עם ציפייה שmRNA האנושי WT לא גס להשפיע אנטומיה ופיזיולוגיה דג הזברה, ואילו כניסתה של בדיקת מוטציות שיש לו השפעה דומיננטית תהיה לגרום לפנוטיפים דומים לאלה שנצפו בתנאים הקליניים בבני האדם. ניסוי זה יכול להיות עוד יותר פרטנית לנתח אם האפקט הדומיננטי מתרחש על ידי רווח של פונקציה (GOF) או מנגנון דומיננטי שלילי על ידי מיזוג mRNA האנושי WT ומוטציה; לאירועי GOF, תוספת של ה-mRNA האנושית WT צפוי להיות רלוונטי, ואילו עבור אללים דומיננטיים שליליים, מיזוג של mRNA WT מוטנט וצריך לשנות את חומרת הפנוטיפ הנגרם על ידי מסר מוטציה. בכל המקרה, אנו ממליצים שכל שילובים של זריקות (MO עם mRNA האנושי WT לעומת morpholino עם מוטציה אנושית וכו &#39;mRNA להתבצע, רצוי בתוך אותו המצמד של עוברים (ראה איור 1) פרשנות היא כדלקמן.: לבדיקות LOF: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם מציאהמייצר פנוטיפ אשר יכול היה להציל באופן שקול על ידי mRNA מוטנט וWT, אלל עשוי שפיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הצלת המוטציה של הפנוטיפ מציאה היא שאין להבחין בין פנוטיפ מציאה עצמו, אלל הוא null תפקודי סביר. הניסוי לא יכול להפלות בין nulls האמיתי (לא חלבון פונקציונלי) ורמות פעילות חלבון ultralow שאין להם יכולת הצלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הצלת המוטציה של הפנוטיפ מציאה סטטיסטית טובה יותר מאשר MO, אבל יותר גרועה מWT, אלל עשוי hypomorph כתוצאה זו מדגימה אובדן חלקי של פונקציה. </li></ul> לבדיקות דומיננטיות: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אין פנוטיפ מציאה, אבל זריקה של mRNA WT מייצרת הפנוטיפ, חייבת לשמש תכנית מגירה אם הניסוי הוא להמשיך (ראה בהמשך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם אין פנוטיפ מציאה והזרקה של mRNA WT לא מייצר פנוטיפ, הניסוי ממשיך כרגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם זריקהמוטציה של mRNA הוא שווה ערך לזה של טבע מסוג mRNA, אלל עשוי להיות או שפיר או אובדן התפקוד, או assay אולי נכשל. זה מצריך ניסויים נוספים כדי להבחין בין האפשרויות הללו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם זריקה של mRNA מוטציה היא שאין להבחין בין מציאה MO, את הפונקציה של מוצר הגן הוא צפוי לשנות באופן כלשהו. כדי להבחין בשינוי בתפקוד, טיטרציה של mRNA מוטנט עם פראי סוג mRNA צריכה להתבצע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התוצאה של זה היא שאין להבחין טיטרציה לmRNA פראי סוג לבדו, זה כבר הראה כי מוצר חלבון המוטנטי משתמש בחלבון פראי הסוג כמצע, כהשפעתו מגוונת עם הכמות של טיטרציה. הדבר זה מצביע על הפנוטיפ שלילי דומיננטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התוצאה של זה היא שאין להבחין טיטרציה לmRNA מוטציה לבד, זה כבר הראה כי מוצר חלבון המוטנטי כבר אין לו את אותו התפקיד כמו בטבע מהסוג, ולכן אינו מושפע מכמות חלבון מראש מוצר פראי סוגנשלח. זה מוכיח שאלל הוא רווח צפוי של פונקציה. </li></ul> תכנית מגירה: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם לא מציג פנוטיפ ממציאת MO, אבל עושה כיום עם ה-mRNA WT, ניסויים נוספים יכולים להתרחש, אם כי אנו מדגישים כי מצב זה אינו אידיאלי. mRNA האנושי WT צריך להיות טיטרציה כדי למזער את הפנוטיפ, והוא יכול לשמש גם כנקודת סט חדשה. coinjection נוסף של WT וmRNA האנושי מוטציה יכולה להיות מוערך על סמך יכולת ההצלה של המוטציה. </li></ul>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S, M0530L </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DpnI restriction endonuclease</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0176L, R0176S </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Max Efficiency DH5&alpha; competent cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18258-012 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Big Dye Terminator</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE Kit </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340, AM1344, AM1348</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td >Morpholino</td>
			<td>Gene-Tools</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td >1-phenyl-2-thiourea (PTU) </td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Prepare as 0.003% PTU in embryo media </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148 </td>
			<td>For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4%</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td >Tricaine methane sulfonate</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>N/A </td>
			<td>For anesthetization and euthanasia </td>
		 </tr>
 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PTC-225 Tetrad Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>Any equivalent thermal cycler</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nano Drop 2000 spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SMZ 745T Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AZ100 Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DS Fi1 Digital Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>For color/fluorescent imaging</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DS QiMC Digital Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>For black/white imaging</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Advanced Resarch 3.2 Imaging Software</td>
			<td>NIS- Elements</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

in vivo modeling of the morbid human genome using danio rerio

כאן, אנו מציגים שיטות לפיתוח מבחני לבצע שאילתות שינויי nonsynonymous פוטנציאל קליני משמעותיים בשימוש בשלמת vivo בדג הזברה. הזברה (Danio rerio) הן מערכת חיה שימושית בשל נהילות הניסיונית שלהם; עוברים הם שקופים כדי לאפשר צפייה קלילה, עובר vivo לשעבר ההתפתחות המהירה, ניתן להשפיע גנטי 1 היבטים אלו אפשרו להתקדמות משמעותית בניתוח של עובר,. תהליכים מולקולריים, והמוךפו&quot;גנטי איתות. יחדיו, את היתרונות של מודל חוליות זו להפוך דג הזברה נוחה מאוד לדוגמנות הפגמים התפתחותיים במחלה בילדים, ובמקרים מסוימים, הפרעות במבוגרים. כי הגנום דג הזברה הוא שמור ביותר עם זה של בני אדם (~ 70% orthologous), ניתן לשחזר מצבי מחלה אדם בדג הזברה. מטרה זו מושגת גם באמצעות ההזרקה של מוטציה אנושית מ &#39;RNA כדי לגרום לעלייה בדומיננטי שלילית או של אללים פונקציה או ניצול של oligonucleotides (MO) morpholino antisense לדכא גנים לחקות אובדן גרסאות פונקציות. באמצעות שלמה של פנוטיפים-Induced MO עם mRNA האנושי כתרים, הגישה שלנו מאפשרת פרשנות של ההשפעה המזיקה של מוטציות ברצף חלבון אנושי המבוסס על יכולתו של ה-mRNA מוטציה להציל את הפנוטיפ מדידה, רלוונטי מבחינה פיזיולוגית. מודלים של אללים המחלה האנושיים מתרחש באמצעות microinjection של עוברי דג הזברה עם מ.ו. ו / או mRNA האנושי בשלב תא 1-4, וphenotyping עד שבע ימים לאחר הפריה (DPF). אסטרטגיה כללית זו ניתנת להארכה למגוון רחב של מחלות פנוטיפים, כפי שמודגם בפרוטוקול הבא. אנו מציגים מודלים הוקמו למוךפו&quot;גנטי איתות, יושרת craniofacial, לב, כלי דם, תפקוד כליות, ופנוטיפים הפרעת שריר שלד, כמו גם לאחרים.

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio at JoVE.com

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

כאן, אנו מציגים גישה שיטתית לפיתוח רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, רגיש וספציפי<em&gt; In vivo</em&gt; מבחני לפרשנות שונים בהפתולוגיה אנושית. מניפולציה גנטית חולפת דרך microinjection של mRNA האנושי וWT מוטנט וoligonucleotides (MO) morpholino antisense לרתום נהילות של דג הזברה מתפתח עובר במהירות מוטציות assay פתוגניים, במיוחד, אך לא רק, בהקשר של הפרעות התפתחותיות אדם.

בדוגמנות Vivo של הגנום האנושי החולנית באמצעות Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

in-vivo-modeling-of-the-morbid-human-genome-using-danio-rerio

Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

20.4K Views.  Duke University Medical Center. כאן, אנו מציגים גישה שיטתית לפיתוח רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, רגיש וספציפי In vivo מבחני לפרשנות שונים בהפתולוגיה אנושית. מניפולציה גנטית חולפת דרך microinjection של mRNA האנושי וWT מוטנט וoligonucleotides (MO) morpholino antisense לרתום נהילות של דג הזברה מתפתח עובר במהירות מוטציות as...

Video: In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Predicting the Effectiveness of Population Replacement Strategy Using Mathematical Modeling

Charles Taylor and John Marshall explain the utility of mathematical modeling for evaluating the effectiveness of population replacement strategy.  Insight is given into how computational models can provide information on the population dynamics of mosquitoes and the spread of transposable elements through A. gambiae subspecies.  The ethical considerations of releasing genetically modified mosquitoes into the wild are discussed.

Charles Taylor and John Marshall explain the utility of mathematical modeling for evaluating the effectiveness of population replacement strategy. Insight is given into how computational models can provide information on the population dynamics of mosquitoes and the spread of transposable elements through A. gambiae subspecies. The ethical considerations of releasing genetically modified mosquitoes into the wild are discussed.

חיזוי את האפקטיביות של אסטרטגיה החלפת אוכלוסייה באמצעות מודלים מתמטיים

Charles Taylor and John Marshall explain the utility of mathematical modeling for evaluating the effectiveness of population replacement strategy.  ...

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissection גרוס פיין epithelia של האוזן הפנימית חושית למבוגרים דג הזברה ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

הלב Dissection ב הזחל, דג הזברה לנוער ו למבוגרים, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and behavioural research. As a vertebrate, zebrafish share considerable genetic sequence similarity with humans and are being used as an animal model for various human disease conditions. The advantages of zebrafish in comparison to other common vertebrate models include high fecundity, low maintenance cost, transparent embryos, and rapid development. Due to the spur of interest in zebrafish research, the need to establish and maintain a productive zebrafish housing facility is also increasing. Although literature is available for the maintenance of a zebrafish laboratory, a concise video protocol is lacking. This video illustrates the protocol for regular housing, feeding, breeding and raising of zebrafish larvae. This process will help researchers to understand the natural behaviour and optimal conditions of zebrafish husbandry and hence troubleshoot experimental issues that originate from the fish husbandry conditions. This protocol will be of immense help to researchers planning to establish a zebrafish laboratory, and also to graduate students who are intending to use zebrafish as an animal model.

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

This protocol outlines regular maintenance and care to maintain optimal conditions for zebrafish husbandry. The video illustrates the protocol for system maintenance, regular housing, feeding, breeding, and raising of zebrafish larvae.

טיפול קבוע ותחזוקה של דג זברה (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) מעבדה: מבוא

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

עכבר הגנום הנדסה באמצעות nucleases מעצב

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

תפוקה גבוהה<em&gt; Danio rerio</em&gt; Assay הוצאה אנרגיה

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.

In vivo לחקר האדם האנדותל-pericyte אינטראקציה באמצעות assay Plug מטריקס ג&#39;ל עכבר

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

מדידת הקשיחות של<em&gt; Ex Vivo</em&gt; עכבר Aortas באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.