NIAID מענק K22AI081748.

1. תזרים בטפטוף biofilm Reactor <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרם טפטוף biofilm הכור (זמין טכנולוגיות Biosurface או גרסאות מותאמות אישית נועד בדרך כלל ניתן על ידי החנויות אוניברסיטה מכונה, ראה תרשים 1) היא התאספו autoclaved. העצרת כוללת קופונים הדבקת בתאי ומכסים קאמרית האבטחה. החדר, יחד עם biofilm בינוני (מרק סויה tryptic 2 גרם / ליטר ו - 2 גרם גלוקוז / L), ואת צינורות ההזנה influent הם מעוקרים ידי מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרכבה של הכור זרם טפטוף הוא preformed ידי הצבת את הכור על משטח שטוח, מהדק את קווי צינורות שפכים, מילוי כל תא עם מרק סויה 10 מ&quot;ל tryptic והוספת 10 μL של ס תרבות aureus גדל בן לילה במרק סויה tryptic. הכור הוא מחוסן אז מקום 37 ° C בחממה במשך 18 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 18 שעות של דגירה, צינורות השפכים הוא unclamped ואת הכור ממוקם על בלוק עץ לחתוך בזווית של ° 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה נקייה מחיידקים, לחבר את צינורות ההזנה influent לבקבוק המכיל את מרק מזין זרימה רציפה. להאכיל את קו צינורות דרך המשאבה לבין הממשלה את הצינורות על ידי הפעלת המשאבה במהירות המקסימלית (משתנה בהתאם לדגם משאבה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בצינור influent ערוכה לעצור את המשאבה ואת לצרף מחטים להתחבר (22 מד, 1 אינץ&#39;) לסוף כל צינור. נגבו את פקק היניקה קאמרית עם אתנול לנגב בסביבה נקייה מחיידקים, להכניס את המחטים באמצעות פקק היניקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה ולאפשר התקשורת כדי לטפטף לאט (קצב זרימה ~ 125 μL / דקה) על קופונים. התקשורת צריכה לזרום כלפי מטה לאורך הקופון מנמל פקק כניסת ליציאת השפכים. הפעילו את הכור זרימה רציפה של 2-5 ימים (בהתאם ליישום), מדי פעם לבדוק את הכור לניקוז תקין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקצור את זרם טפטוף biofilms הכור, להפסיק את המשאבה בזהירות להסיר את המחטים מהכור. הכור אז יכול להיות מונח על משטח שטוח את הקופונים ניתן להסיר בסביבה נקייה מחיידקים באמצעות מלקחיים סטרילית. אם במיקרוסקופ הוא הרצוי, את הקופונים יכולים כעת להיות מעובד בהתאם (תרשים 2B הוא מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של biofilm S. aureus גדל כור biofilm טפטוף). אם כימות של ביומסה biofilm או לימודי הפיזיולוגיה הם מטרת המחקר, biofilm ניתן להסיר את הקופון באמצעות מגרד התא. בעוד מחזיק את הקופונים עם מלקחיים, בעדינות לגרד את biofilm את הקופון לתוך צינור חרוטי המכיל פוספט שנאגרו מלוחים באמצעות מגרד התא. הערה: לכמת את המושבה להרכיב יחידות biofilms, יש צורך homogenize biofilms שנקטפו עם רקמות homogenizer כדי disaggregate גושים ויוצרים ההשעיה הומוגנית. מודלים שונים של רקמות homogenizers מתאימים עבור יישום זה. אנו מנצלים מדעי פישר Tissuemiser Homogenizer (מוצר # 15-338-420) במלוא המהירות לרגע 1 עד homogenize דגימות biofilm. אי homogenize biofilm תגרום הערכה נמוכה מדי של המושבה הקמת יחידות להציג במדגם. </li></ol> 2. Biofilm סיבוב הדיסק Reactor <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biofilm מסתובב הדיסק הכור (זמין זמין טכנולוגיות Biosurface או יכול להיות מותאם אישית עשה, ראה איור 3) היא התאספו autoclaved. להרכיב את הכור על ידי המקום הראשון ספינינג קופונים דיסק לתוך החריצים של הדיסק ספינינג הצבת אותו לתוך כוס 1 ליטר זכוכית עם יציאת בגלישה. מספר 15-פקק גומי עם חורים שנקדחו בו כדי לאפשר זרימת מדיה אוורור משמש מכסה את הכור. הכור, biofilm מדיה (מרק סויה tryptic 2 g / L של הגלוקוז 2 g / L), צינורות היניקה הם מעוקרים לאחר מכן על ידי מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biofilm מסתובב הכור הדיסק הוא מחוסן ידי הצבת 250 MLS של המדיום סטרילי לתוך הכור, ומוסיף 0.5 מ&quot;ל של ס &#39;לילה תרבות aureus גדל מרק סויה tryptic. הכור ממוקם אז בצלחת ומערבבים מוגדר 250 סל&quot;ד ו מודגרות לילה בטמפרטורה הרצויה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 16 שעות של דגירה לחבר את צינור היניקה לנמל על מאגר בינוני ולחבר אותו המשאבה peristaltic. המשאבה ואז להפעיל זרם מוגדר ~ 0.25 mL / min (תזרים ניתן לשנות בהתאם לקצב הצמיחה הרצוי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 24 שעות לעצור את הכור בסביבה נקייה מחיידקים, להסיר את הדיסק בלי לגעת קופונים biofilm. הסר את הקופונים באמצעות מלקחיים סטרילית לטבול כל אחד לתוך פוספט שנאגרו מלוחים כדי להסיר כל חיידקים המצורפת רופף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור בדיקות מתחם מיקרוביאלית, שבבי ניתן להציב לתוך בארות בודדים של צלחת 96 באר המכילים תרכובות של עניין. לאחר דגירה, שבבי מועברים לתוך 1.5 microcentrifuge צינורות מ&quot;ל המכילה 1 מ&quot;ל תמיסת מלח פוספט חיץ הומוגני עם רקמות homogenizer לפזר את biofilm ללא פגע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הם מדולל אז סדרתי מצופה על מדיום אגר מזין לקבוע המושבה formi קיימאng יחידות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: וריאציות רבות יכול להתבצע על פרוטוקול לעיל. לדוגמה, קופונים דיסק מסתובב יכולים להיות מצופים או עשויים אנטי biofilm תרכובות פוטנציאל מבחן היעילות. Dispersants biofilm ניתן גם להעריך להיות דוגרים קופונים תרכובות dispersant וחיידקים לכימות מצורף לעומת מנותקת. </li></ol> 3. נציג תוצאות דוגמה להגדיר את הכור זרם טפטוף תוצג אם באיור 1. אחרי שלושה ימים של זרימת כמויות עצומות של biofilm יצטברו על פני השטח קופון, איור 2A. ביומסה סה&quot;כ ישתנו בהתאם זני חיידקים ותנאי צמיחה מדויקת. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של ס biofilm aureus גדל הכור זרם טפטוף מוצג תרשים 2B. הכור דיסק מסתובב מוצגת דמות 3A. הפרוטוקול המתואר ניתן להתאים את הדרישות הספציפיות של כל מיקרואורגניזם בדרך כלל מסוגל להרכיב biofilm. איור 3 ב מציג את הדיסק מסתובב עם 18 דיסקיות פלסטיק מודבקת. דיסק גדל biofilms אלה הם במיוחד גם מתאים בדיקות מיקרוביאלית ו להניב תוצאות לשעתקו מאוד 11. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. הזרימה לטפטף ההתקנה הכור. מרכיבים חשובים מסומנים. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. דוגמה זרימה טפטוף ס aureus biofilm. א) biofilm זה היה גדל במשך שלושה ימים בעקבות פרוטוקול המתואר. מכסים משני החדרים הראשונים של הכור יוסרו להראות ש צהוב biofilm aureus ביומסה. ב) Sacnning מיקרוסקופ אלקטרונים של ס biofilm aureus גדל הכור זרם טפטוף. <img src="/files/ftp_upload/2470/2470fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. הכור דיסק מסתובב. א) דוגמה של הכור מפעיל דיסק מסתובב. מרכיב מפתח מסומנים. ב) תקריב לאור דיסק מסתובב.

<ol>
	<li>Costerton, J. W., Lewandowski, Z., Caldwell, D. E., Korber, D. R., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+Biofilms.">Microbial Biofilms.</a> Annu. Rev. Microbiol. 49, 711-745 (1995).</li><li>Costerton, J. W., Cheng, K. J., Gessey, G. G., Ladd, T. I., Nickel, J. C., Dasgupta, M., Marrie, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms+in+nature+and+disease.">Bacterial biofilms in nature and disease.</a> Ann. Rev. Microbiol. 41, 435-464 (1987).</li><li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initiation+of+biofilm+formation+in+Pseudomonas+fluorescens+WCS365+proceeds+via+multiple,+convergent+signaling+pathways:+a+genetic+analysis.">Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis.</a> Mol. Micro. 28, 449-461 (2002).</li><li>Boles, B. R., Horswill, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agr-mediated+dispersal+of+Staphylococcus+aureus+biofilms.">Agr-mediated dispersal of Staphylococcus aureus biofilms.</a> PLoS Pathog. 4, e1000052-e1000052 (2008).</li><li>Goeres, D. M., Haamilton, M. A., Beck, N. A., Buckingham-Meyer, K., Hilyard, J., Loetterle, L. A., Walker, D. K., Stewart, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+growing+a+biofilm+under+low+shear+at+the+air-liquid+interface+using+the+drip+flow+biofilm+reactor.">A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor.</a> Nature Protocols. 4, 783-788 (2009).</li><li>Fu, W., Forster, T., Mayer, O., Curtin, J. J., Lehman, S. M., Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophage+cocktail+for+the+prevention+of+biofilm+formation+by+Pseudomonas+aeruginosa+on+catheters+in+an+in+vitro+model+system.">Bacteriophage cocktail for the prevention of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa on catheters in an in vitro model system.</a> Antimicrob Agents Chemother. 54, 397-404 (2010).</li><li>Xu, K. D., McFeters, G. A., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+resistance+to+antimicrobial+agents.">Biofilm resistance to antimicrobial agents.</a> Microbiology. 146, 547-549 (2000).</li><li>Xu, K. D., Stewart, P. S., Xia, F., Huang, C. T., McFeters, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+physiological+heterogeneity+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+is+determined+by+oxygen+availability.">Spatial physiological heterogeneity in Pseudomonas aeruginosa biofilm is determined by oxygen availability.</a> Appl. Environ. Microbiol. 64, 4035-4039 (1998).</li><li>Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-generated+diversity+produces+"insurance+effects"+in+biofilm+communities.">Self-generated diversity produces "insurance effects" in biofilm communities.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 16630-16635 (2004).</li><li>Pitts, B., Willse, A., McFeters, G. A., Hamilton, M. A., Zelver, N., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+repeatable+laboratory+method+for+testing+the+efficacy+of+biocides+against+toilet+bowl+biofilms.">A repeatable laboratory method for testing the efficacy of biocides against toilet bowl biofilms.</a> J. Appl. Microbiol. 91, 117-11 (2001).</li><li>Boles, B. R., Thoendel, M., Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhamnolipids+mediate+detachment+of+Pseudomonas+aeruginosa+from+biofilms.">Rhamnolipids mediate detachment of Pseudomonas aeruginosa from biofilms.</a> Mol. Microbiol. 57, 1210-1223 (2005).</li><li>Hentzer, M., Teitzel, G. M., Balzer, G. J., Heydorn, A., Molin, S., Givskov, M., Parsek, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+overproduction+affects+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+structure+and+function.">Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function.</a> J. Bacteriol. 183, 5395-5401 (2001).</li><li>Lin, H. Y., Chen, C. T., Huang, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+merocyanine+540+for+photodynamic+inactivation+of+Staphylococcus+aureus+planktonic+and+biofilm+cells.">Use of merocyanine 540 for photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cells.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6453-6458 (2004).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Biofilms גדל כורים שונה לעיתים קרובות יש מאפיינים שונים הכור לכל יישומים שונים. בעבודה זו אנו מתארים את השימוש של שני כורים biofilm: זרימה טפטוף biofilm הכור כור דיסק מסתובב. בטפטוף כורים תזרים שימושיים גדל biofilms גזירה נמוך בממשק אוויר נוזלי והם להתאמה למגוון רחב של מצבים. אנחנו ?...

Erratum: The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Drip Flow Reactors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioSurface Technologies Corporation</td>
<td>DFR 110</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rotating Disk Reactors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BioSurface Technologies Corporation</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

the use of drip flow and rotating disk reactors for staphylococcus aureus biofilm analysis

רוב החיידקים בטבע נחשבים להתקיים משטח הקשורים הקהילות biofilms. Biofilms 1 חיידקית נארזים בתוך מטריצה ​​ומצורפת היווצרות של 2 פני. Biofilm ופיתוח נלמדים בדרך כלל במעבדה באמצעות מערכות אצווה כגון צלחות microtiter או זרימה מערכות, כגון תאים הזרימה. מתודולוגיות אלה שימושיים להקרנה ספריות מוטציה כימיים (צלחות microtiter) 3 או גדל biofilms להדמיה (תאים זרימה) 4. כאן אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים סטפילוקוקוס גדל בשני סוגים נוספים של biofilms מערכת זרימה: זרימת לטפטף הכור biofilm ו biofilm המסתובב הכור דיסק. תזרים בטפטוף כורים biofilm מיועדים ללימוד biofilms גדל בתנאים גזירה נמוך. 5 הכור זרם טפטוף מורכבת מארבעה ערוצי בדיקה במקביל, כל אחד מסוגל להחזיק כוס אחת רגילה מיקרוסקופ שקופיות בגודל קופון, או אורך של קטטר או תפקיד. הכור זרם טפטוף אידיאלית עבור ניטור microsensor, כללי מחקרים biofilm, דגימות biofilm cryosectioning, ייצור ביומסה גבוהה, הערכות חומר רפואי, בדיקות שכינת המכשור הרפואי. 6,7,8,9 הכור דיסק מסתובב כולל דיסק המכיל טפלון נבכי קופונים נשלף. 10 קופונים נשלף ניתן על ידי מכל חומר machinable. התחתון של הדיסק מסתובב מכיל מגנט לבר כדי לאפשר סיבוב הדיסק כדי ליצור גזירה פני הנוזל על פני השטח, סומק קופונים. דיסק שלם המכיל 18 קופונים ממוקם ספינת 1000 מ&quot;ל בצד זרוע זכוכית הכור. התקשורת גידול נוזלי מופץ באמצעות כלי ואילו הדיסק הוא הסתובב על ידי stirrer מגנטי. קופונים מוסרים כלי הכור ואז מגורד לאסוף את דגימת biofilm למחקר נוסף או הדמיה במיקרוסקופ. כורים דיסק סיבוב מיועדים הערכות מעבדה יעילות biocide, הסרת biofilm, ואת הביצועים של חומרים אנטי עכירות. 9,11,12,13

Watch this Scientific Journal Video about The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis at JoVE.com

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

הפרוטוקולים של ניצול לפתוח זרימת biofilms מערכת עם כורים זרימה טפטוף וסיבוב כורים דיסק מוצגים בפירוט.

השימוש זרימה טפטוף ו כורים דיסק סיבוב עבור Staphylococcus aureus Biofilm ניתוח

Most microbes in nature are thought to exist as surface-associated communities in biofilms.1  Bacterial biofilms are encased within a matrix and attached ...

the-use-drip-flow-rotating-disk-reactors-for-staphylococcus-aureus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

17.0K Views.  University of Michigan. הפרוטוקולים של ניצול לפתוח זרימת biofilms מערכת עם כורים זרימה טפטוף וסיבוב כורים דיסק מוצגים בפירוט.

Video: The Use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus Biofilm Analysis

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological properties compared to free living microorganisms. Biofilms in nature are often difficult to investigate and reside under poorly defined conditions1. Using a transparent substratum it is possible to device a system where simple biofilms can be examined in a non-destructive way in real-time: here we demonstrate the assembly and operation of a flow cell model system, for in vitro 3D studies of microbial biofilms generating high reproducibility under well-defined conditions2,3.
The system consists of a flow cell that serves as growth chamber for the biofilm. The flow cell is supplied with nutrients and oxygen from a medium flask via a peristaltic pump and spent medium is collected in a waste container. This construction of the flow system allows a continuous supply of nutrients and administration of e.g. antibiotics with minimal disturbance of the cells grown in the flow chamber. Moreover, the flow conditions within the flow cell allow studies of biofilm exposed to shear stress. A bubble trapping device confines air bubbles from the tubing which otherwise could disrupt the biofilm structure in the flow cell.
The flow cell system is compatible with Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and can thereby provide highly detailed 3D information about developing microbial biofilms. Cells in the biofilm can be labeled with fluorescent probes or proteins compatible with CLSM analysis. This enables online visualization and allows investigation of niches in the developing biofilm. Microbial interrelationship, investigation of antimicrobial agents or the expression of specific genes, are of the many experimental setups that can be investigated in the flow cell system.

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Protocol describing the application of a flow cell system for growing and analyzing microbial biofilms for Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa ו biofilm Saccharomyces cerevisiae בתוך תאים Flow

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the United States. Among soft-tissue infections, myositis, pyomyositis, and necrotizing fasciitis have been increasingly reported in association with MRSA arising from the community. To understand the interplay between MRSA and host immunity leading to more severe infection, the availability of animal models is critical, permitting the study of host and bacterial factors. Several infection models have been introduced to assess the pathogenesis of S. aureus during superficial skin infection. Here, we describe a subcutaneous infection model that examines the skin, subcutaneous, and muscle pathologies.

Subcutaneous Infection of Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus MRSA

Murine skin and soft tissue infection model is utilized for assessing the virulence function of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and the host immunological responses. Here, we presented a subcutaneous infection model for skin and soft tissue infection.

זיהום תת עורי של סטפילוקוקוס אוראוס עמיד Methicillin (MRSA)

MRSA is a worldwide threat to public health, and MRSA skin and soft-tissue infections now account for more than half of all soft-tissue infections in the ...

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Rat

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause of such syndromes with unacceptably high morbidity and mortality even with appropriate antimicrobial agent treatments4-6. The increase in infections due to methicillin-resistant S. aureus (MRSA), the high rates of vancomycin clinical treatment failures and growing problems of linezolid and daptomycin resistance have all further complicated the management of patients with such infections, and led to high healthcare costs7, 8. In addition, it should be emphasized that most recent studies with antibiotic treatment outcomes have been based in clinical settings, and thus might well be influenced by host factors varying from patient-to-patient. Therefore, a relevant animal model of endovascular infection in which host factors are similar from animal-to-animal is more crucial to investigate microbial pathogenesis, as well as the efficacy of novel antimicrobial agents. Endocarditis in rat is a well-established experimental animal model that closely approximates human native valve endocarditis. This model has been used to examine the role of particular staphylococcal virulence factors and the efficacy of antibiotic treatment regimens for staphylococcal endocarditis. In this report, we describe the experimental endocarditis model due to MRSA that could be used to investigate bacterial pathogenesis and response to antibiotic treatment.

Experimental Endocarditis Model of Methicillin Resistant Staphylococcus aureus MRSA in Rat

Experimental rat endocarditis model due to methicillin-resistant S. aureus.

אנדוקרדיטיס דגם ניסיוני של Methicillin עמיד<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; (MRSA) ב עכברוש

Endovascular infections, including endocarditis, are life-threatening infectious syndromes1-3. Staphylococcus aureus is the most common world-wide cause ...

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant reservoir of iron inside the human host is heme, which is the cofactor of hemoglobin. To acquire iron from hemoglobin, S. aureus utilizes an elaborate system known as the iron-regulated surface determinant (Isd) system1. Components of the Isd system first bind host hemoglobin, then extract and import heme, and finally liberate iron from heme in the bacterial cytoplasm2,3. This pathway has been dissected through numerous in vitro studies4-9. Further, the contribution of the Isd system to infection has been repeatedly demonstrated in mouse models8,10-14. Establishing the contribution of the Isd system to hemoglobin-derived iron acquisition and growth has proven to be more challenging. Growth assays using hemoglobin as a sole iron source are complicated by the instability of commercially available hemoglobin, contaminating free iron in the growth medium, and toxicity associated with iron chelators. Here we present a method that overcomes these limitations. High quality hemoglobin is prepared from fresh blood and is stored in liquid nitrogen. Purified hemoglobin is supplemented into iron-deplete medium mimicking the iron-poor environment encountered by pathogens inside the vertebrate host. By starving S. aureus of free iron and supplementing with a minimally manipulated form of hemoglobin we induce growth in a manner that is entirely dependent on the ability to bind hemoglobin, extract heme, pass heme through the bacterial cell envelope and degrade heme in the cytoplasm. This assay will be useful for researchers seeking to elucidate the mechanisms of hemoglobin-/heme-derived iron acquisition in S. aureus and possibly other bacterial pathogens.

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

Here we describe a growth assay for Staphylococcus aureus using hemoglobin as the sole source of available nutrient iron. This assay establishes the role of bacterial factors involved in hemoglobin-derived iron acquisition.

צמיחת סטפילוקוקוס אוראוס באמצעות ההמוגלובין אנושי כמקור ברזל

S. aureus is a pathogenic bacterium that requires iron to  carry out vital metabolic functions and cause disease. The most abundant  reservoir of iron ...

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and clonal strain relatedness of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), particularly with the emerging outbreaks of community-associated MRSA (CA-MRSA) occurring on a worldwide basis. Traditional PCR typing schemes classify SCCmec by targeting and identifying the individual mec and ccr gene complex types, but require the use of many primer sets and multiple individual PCR experiments. We designed and published a simple multiplex PCR assay for quick-screening of major SCCmec types and subtypes I to V, and later updated it as new sequence information became available. This simple assay targets individual SCCmec types in a single reaction, is easy to interpret and has been extensively used worldwide. However, due to the sophisticated nature of the assay and the large number of primers present in the reaction, there is the potential for difficulties while adapting this assay to individual laboratories. To facilitate the process of establishing a MRSA SCCmec assay, here we demonstrate how to set up our multiplex PCR assay, and discuss some of the vital steps and procedural nuances that make it successful.

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

We demonstrate a simple multiplex PCR assay for quick-screening and typing of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) types I-V for methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and provide some of the vital steps and procedural nuances that make it successful for adapting this assay to individual laboratories.

Multiplex assay PCR ?????? ?? ???? Mec ???????? ???? Staphylococcal I ?V ?-methicillin<em&gt; ???????????</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs) and other toxins produced and secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils. To study the effects of the PSMs on neutrophils we isolate fresh neutrophils using density gradient centrifugation. These neutrophils are loaded with a dye that fluoresces upon calcium mobilization. The activation of neutrophils by PSMs initiates a rapid and transient increase in the free intracellular calcium concentration. In a flow cytometry experiment this rapid mobilization can be measured by monitoring the fluorescence of a pre-loaded dye that reacts to the increased concentration of free Ca2+. Using this method we can determine the PSM concentration necessary to activate the neutrophil, and measure the effects of specific and general inhibitors of the neutrophil activation.	
	To investigate the expression of the PSMs in the intracellular space, we have constructed reporter fusions of the promoter of the PSM&alpha; operon to GFP. When these reporter strains of S. aureus are phagocytosed by neutrophils, the induction of expression can be observed using fluorescence microscopy.

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

We present methods to study the effect of PSMs and other toxins secreted by Staphylococcus aureus on neutrophils using flow cytometry and fluorescence microscopy.

חקר אינטראקציות של<em&gt; סטפילוקוקוס</em&gt; עם נויטרופילים ידי cytometry זרימה מיקרוסקופית וזמן לשגות

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

מיקוד Associated Biofilm<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Assay רגישות בסמים בהתבסס Resazurin שימוש

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, therefore, suitable to be used for routine purposes. For best resolution, data evaluation and data management, a miniaturized electrophoresis system is required. Together with such an electrophoresis system and the in-house developed software (freely available here) assignment of the pattern of bands to a genotype is standardized and straight forward. DNA extraction is simple (boiling prep), setting-up of the reactions is easy and they can be run on any standard PCR machine. PCR cycling is common except prolonged ramping and elongation times. Compared to spa typing and Multi Locus Sequence Typing (MLST), RS-PCR does not require DNA sequencing what simplifies the analysis considerably and allows a high throughput. Furthermore, the resolution for bovine strains of S. aureus is at least as good as spa typing and better than MLST or pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). The RS-PCR data base includes presently a total of 141 genotypes and variants. The method is highly associated with the virulence gene pattern, contagiosity and pathogenicity of S. aureus strains involved in bovine mastitis. S. aureus genotype B (GTB) is contagious and causes herds problems causing large costs in the Switzerland and other European countries. All the other genotypes observed in Switzerland infect individual cows and quarters. Genotyping by RS-PCR allows the reliable prediction of the epidemiological and the pathogenic potential of S. aureus involved in bovine intramammary infection (IMI), two key factors for clinical veterinary medicine. Because of these beneficial properties together with moderate costs and a high sample throughput the goal of this publication is to give a detailed, step-by-step protocol for easily establishing and running RS-PCR for genotyping S. aureus in other laboratories.

Genotyping of Staphylococcus aureus by Ribosomal Spacer PCR RS-PCR

Here, ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is used together with a miniaturized electrophoresis system as a fast and high resolution method for genotyping S. aureus at moderate costs allowing a high throughput.

genotyping של<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; על ידי ריבוזומלי Spacer PCR (RS-PCR)

The ribosomal spacer PCR (RS-PCR) is a highly resolving and robust genotyping method for S. aureus that allows a high throughput at moderate costs and is, ...

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to antibiotics. Genomic studies reveal that S. aureus carries many virulence and resistance genes located in mobile genetic elements, suggesting that horizontal gene transfer (HGT) plays a critical role in S. aureus evolution. However, a full and detailed description of the methodology used to study HGT in S. aureus is still lacking, especially regarding natural transformation, which has been recently reported in this bacterium. This work describes three protocols that are useful for the in vitro investigation of HGT in S. aureus: conjugation, phage transduction, and natural transformation. To this aim, the cfr gene (chloramphenicol/florfenicol resistance), which confers the Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A (PhLOPSA)-resistance phenotype, was used. Understanding the mechanisms through which S. aureus transfers genetic materials to other strains is essential to comprehending the rapid acquisition of resistance and helps to clarify the modes of dissemination reported in surveillance programs or to further predict the spreading mode in the future.

Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus

We describe here three different protocols for the in vitro investigation of conjugation, transduction, and natural transformation in Staphylococcus aureus.

מתודולוגיה לחקר ההעברה האופקית ג&#39;ין<em&gt; Staphylococcus aureus</em

One important feature of the major opportunistic human pathogen Staphylococcus aureus is its extraordinary ability to rapidly acquire resistance to ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

אפיון של קבוצות משנה מונוציט האנושית על ידי דם לזרום Cytometry ניתוח

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...