שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום המיקרוביולוגיה, כגון כיצד זרימת נוזלים משנה צמיחה והתפתחות של ביופילם פטרייתי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו להעריך כמותית את השפעות הזרימה על צמיחה והתפתחות ביופילם בזמן אמת. התחל ניסוי זה בהרכבה של מנגנון הזרימה, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
ביום הניסוי, חבר את מלכודת הבועה, את גשושית הטמפרטורה ואת כל רכיבי השימוש הבודד. כדי להרכיב את המסנן, הסר את הבוכנה ממזרק של מיליליטר אחד כדי להפוך אותו למתאם. כפו את הצינורות מבקבוק המסנן לקצה זה והצמידו מסנן 2 מיקרון לצנרת המובילה לבקבוק הגדילה.
החל גריז ואקום סיליקון סביב העקיצה של מתאם השקופית לפני חיבורו, כמו זה עוזר למנוע דליפות אוויר לתוך המערכת. מלאו את בקבוקון ההחזקה ב-100 מיליליטר של YPD, ומלאו את בקבוק הגדילה ב-200 מיליליטר של YPD. ודאו שצנרת הצד הירוק מגיעה למדיה בכל בקבוקון.
ודא שכל השסתומים פתוחים. חבר את מלכודת הבועה לוואקום, וחבר את המשאבה לצד הירוק צינורות במורד הזרם של מלכודת הבועה. לשאוב את הנוזל בקצב זרימה של 3.3 מיליליטר לדקה כדי למלא לחלוטין את הצד הירוק.
לאחר מכן, לוותר ולהשליך כאחד עד שני מיליליטר של התקשורת, כי הזוג הראשון של מיליליטר לעתים קרובות מכילים תאים מתים או פסולת אקראית. ודא שהצד הירוק של הצינור מלא במדיה ואין לו בועות במורד הזרם של מלכודת הבועה לפני שתמשיך. מלא את שקופית הערוץ ואת המאגר עם YPD, דואג לא להציג בועות.
חבר את השקופית למנגנוני הזרימה. לאחר מכן לשאוב נוזלים יותר כדי ליצור חיץ של כ 5 מטר בצד הכתום. זאת כדי למנוע השמנה בטעות של אוויר בשקופית במקרה של זרימה אחורית.
עכשיו, להכין את מנגנון הזרימה להובלה למיקרוסקופ על ידי נטיעת תחילה את שקע ושקע של מלכודת הבועה סגור. ואז להדק את שסתומי בקבוקון בצד הירוק והתפוז סגור. ודא כי מכסות בורג עבור dampener פעימה ובקבוק מסנן הדוקים, כפי שהם יכולים להשתחרר במהלך autoplating.
נתק את המשאבה מהצנרת כדי להקל על ההובלה. לאחר מכן להעביר את כל הרכיבים, כולל מערבב צלחת חמה, לתוך מיכל משני ליד המיקרוסקופ. חבר את גשוש הטמפרטורה לצלחת החמה, ולהתחיל לחמם את בקבוקון ההחזקה ל 37 מעלות צלזיוס.
מערבבים את המדיה ב-300 סל"ד, ושומרים על זה לכל הניסוי. תן את השקופית במיקרוסקופ, ולהשתמש בקלטת במידת הצורך כדי לאבטח אותה היטב. ואז לחבר את מלכודת הבועה לוואקום.
עכשיו, לחבר את המשאבה למנגנוני הזרימה. הפעל את המשאבה בקצב זרימה של 3.3 מיליליטר לדקה, ואפשר לה לפעול במשך כחמש עד עשר שניות. לאחר מכן, להסיר את מלכודת הבועה שבט המכסה לשחרר החוצה.
אפשר למשאבה להמשיך לפעול בזמן שבקבוק ההחזקה מתחמם. לאחר בקבוק ההחזקה ותא הדגירה הם שניהם ב 37 מעלות צלזיוס, להוסיף מספיק תרבות לילה של תאים פטרייתיים לבקבוק ההחזקה כדי להגיע למיליון תאים למיליליטר. המתן 15 דקות כדי לאפשר לתאים להתאקלם.
פתח שסתומי בקבוקון בצד הירוק והתפוז תוך סגירת שני שסתומי בקבוק הצמיחה כדי להתחיל את זרימת התאים. המתן כחמש דקות כדי לאפשר לתאים להגיע לשקופית. במהלך תקופה זו, למקד את המיקרוסקופ ולהתאים אותו לאותם פרמטרי הדמיה המשמשים בניסויים קודמים.
התחל רכישת תמונה עבור שלב הקובץ המצורף. בדוק שוב לאחר כחמש ו -10 דקות כדי להבטיח כי המיקוד נשמר. אם לא, נסה להתאים את המוקד מיד לאחר שהתמונה הבאה תירכש.
מיד לאחר סיום שלב הקובץ המצורף, שמור את הקובץ. לאחר מכן פתח שסתומי בקבוקון צמיחה בצד הירוק והתפוז תוך סגירת שני שסתומי בקבוקון מצורף. יש לדאוג לא להקפיץ את הבמה אם כל שסתומים נמצאים בתוך תא הדגירה.
נתק את בדיקה מדחום, ולהחליף את בקבוקון המצורף עם בקבוק הצמיחה. עכשיו, להגדיר את התוכנה כדי לרכוש תמונה כל 15 דקות על פני 22 שעות, ולהתחיל רכישת תמונה לשלב הצמיחה. לאחר רכישת שלב הצמיחה הסתיימה והקובץ נשמר, לפתוח את שסתומי בקבוקון בצד הירוק והכתום, אשר עשוי לעשות רעש כמו הלחץ משחרר בצד הכתום.
משוך על צינורות הצד הירוק מגיע משני flasks התקשורת, עד שהם לפחות כמה סנטימטרים מעל התקשורת. לאחר מכן, להפעיל את המשאבה במהירות גבוהה כדי להסיר את כל המדיה מן הצינור, מה שהופך את הניקוי הרבה יותר קל. לבסוף, לכמת את קטעי הווידאו כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
הפעם לשגות שדה כהה מיקרוסקופיה וידאו מראה את ההחזקה של סוג הבר קנדידה תאים אלביקניים לתת הזרימה מצע במהלך שלב ההחזקה, ואחריו הצמיחה וההתפתחות הבאים במהלך שלב הצמיחה המוביל היווצרות biofilm. הנתונים מסרטונים אלה ניתן לנתח עבור שיעורי ההחזקה התא וניתוק ביומסה לאורך זמן, המוצגים כאן הוא ביומסה הכולל בתוך אזור ההדמיה כפי שנקבע על ידי ניתוח densitometry. הקצב המצטבר של חיבור תאים וניתוק הביומסה באחוזים לאורך זמן מוצגים גם הם.
בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להשתמש באותם תנאי הדמיה בכל הניסויים, מכיוון שזה מאפשר השוואות כמותיות ביניהם.
