1. האסיפה של מערכת תא זרימה עם כל הרכיבים מערכת זרימה התאספו כוללת: צינורות autoclavable, מלכודות בועה, בינוני / בקבוק פסולת ותאי הזרימה כפי שמוצג באיור 1. כל החלקים הללו ניתן לעשות שימוש חוזר בין הניסויים. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. התא זרימה מערכת ההתקנה (מרכיבים חיוניים של ההתקנה). מערכת התא זרימה מורכב מספר מרכיבים: בקבוק בינוני, משאבה peristaltic, מלכודות בועה, התא זרימה, בקבוק פסולת, וחתכים שונים של צינורות מחוברים על ידי מחברים שונים. איור מספקים בנדיבותם על ידי רונה Lyngklip. 2. האסיפה של התא זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התא זרימה (איור 2 א) מטופל עם נתיבי דקה של דבק סיליקון, באמצעות מזרק (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פיסת לכסות על גבי קווי סיליקון (איור 3). תלושי זכוכית לכסות משמשים תשתית עבור פ aeruginosa בעוד פתקי PVC לכסות מוחלים על S. cerevisiae biofilm. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig2.jpg" alt="איור 2" /> איור 2. שרטוט סכמטי של התא זרימה מלכודת בועה 2. תיאור מפורט של ממדים המשמש לייצור של מלכודת) תא ב) בועה זרימה, ביולוגיה DTU מערכות. והודפס מחדש באישור וג&#39;ון וילי ובניו בע&quot;מ (DTU Systems Biology היה זכאי בעבר Biocentrum, כמתואר באיור) <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig3.jpg" alt="איור 3" /> איור 3. איור של דבק סיליקון קווי הבקשה מצורף של תשתית הזכוכית. הזכוכית המכסה הצביעו מושם על הדבק סיליקון לצרף אותו התא זרימה. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התא זרימה מעל ולמקם אותו על משטח שטוח עם הצד לכסות להחליק למטה. לחצו בעדינות על גבו של התא זרימה לדחוף את תלוש לכסות על בסיס של התא זרימה. הפעל את התא זרימה מעל ולבדוק עבור אזורים שאינם חתומים על ידי הסיליקון. (בוכנה) ידית חלק מזרק יכול לשמש ככלי בעדינות ללחוץ על תא הזכוכית וזרימת יחד. </li></ol> 3. בקבוק בינוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח סיליקון צינור האכלה (2 מ&quot;מ קוטר פנימי) בבקבוק בינוני להוסיף מחבר ישר בקצה השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף בינוני עד הבקבוק (עבור תוכן בינוני לראות &quot;התקשורת&quot; פסקה) כיסוי מחבר בקבוק עם רדיד מתכת החיטוי הבינוני. ודא כי בסופו של צינור אספקה ​​קבועה מעל פני הנוזל בבקבוק בינוני או אפקט סיפון עשוי לרוקן את בקבוק בינוני כאשר מעוקר. </li></ol> 4. חיבור מלכודת הבועה, תזרים תא משאבה להרכיב את כל צינורות על פי המתווה באיור 1. השתמש בצינור סיליקון למעט החלק שעובר המשאבה peristaltic שם צינורות Marprene מוחל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לחבר את הצינור מהבקבוק בינוני לכל חדרי תזרים בודדים, לפצל צינור למספר הנדרש של פתחי הכניסה מוחל בניסוי. השתמש ב-T-מחברים כדי להפוך את המספר הרצוי של צינורות חיבור בין צינור ההזנה של צינורות Marprene בתוך המשאבה (ראה איור 1, T-מחבר). זה בדרך כלל רעיון טוב כדי לשמור על הסדר אותו רצף של צינורות ותאי לזרום בכל המערכת, כדי להקל על זיהוי של רכיבים במקרה של תקלות במערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיבור כל צינור האכלה בודדים (2 מ&quot;מ קוטר) כדי Marprene צינורות המשאבה באמצעות מחברים ישר. חבר את צינורות Marprene ללכוד בועה (איור 2b) דרך צינור סיליקון ביניים (1 מ&quot;מ קוטר). ודא כי המשאבה מחוברת כניסת בחלק הגבוה של המלכודת בועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את צינור מוצא וכתוצאה מכך של מלכודות בועה אל מפרצון את זרימת התא (1 מ&quot;מ קוטר), לוודא כי אורך tubings אלה מאפשר התא זרימה להתרגש לשלב של המיקרוסקופ confocal (בדרך כלל 1 מ &#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 5 מזרקים מ&quot;ל על גבי מלכודות בועה. סגור את צמרות עם כמוסות מתאימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מוצא התא זרימה חיבור קצר, כ 40 מ&quot;מ של חתיכה (1 מ&quot;מ קוטר), צינורות ולהשתמש &quot;צמצום&quot; מחבר ישר לצרף צינור פסולת (2 מ&quot;מ קוטר) באורך הדרוש. המקום צינורות פסולת במיכל הפסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לציין, מיכל פסולת חייב תמיד להיות ממוקם באותה רמה כמו תאים הזרימה, מעולם מתחת לרמה תזרים תאים. כמו כן, ודא כי בסופו של צינורות הפסולת הוא קבוע מעל פני הצפוי של פסולת נוזלית כדי למנוע סומק גב עקב אפקט הסיפון בעת ​​טיפול בתאי לזרום. </li></ol> 5. חיטוי ושטיפת מערכת זרימת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מלכודת כמוסות בועה ולמקם אותם באתנול 70% כדי לשמור אותם סטריליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלת המשאבה במהירות הגבוהה ביותר כדי למלא את המערכת עם 0.5% (V / V) hypochlorite נתרן במים. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את מלכודת כמוסות בועה בחזרה כאשר מלכודות בועה מלאים לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על תאים זרימת כדי להסיר בועות בחדר זרימה. הקפד לא לפגוע זכוכית לכסות שביר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר מערכת לעקר עבור 3-4 שעות בקצב הזרימה של 3 מ&quot;ל / שעה / ערוץ (0.2 מ&quot;מ / s קצב זרימה ליניארי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את המערכת 2-3 פעמים כדי לשטוף את כל hypochlorite. מילוי לרוקן את המערכת עם מים סטריליים. מלכודות הבועה צריך להיות מרוקן לחלוטין בין כל לשטוף. ניתן לעשות זאת על ידי שאיבה באוויר עד מלכודות בועה כבר התרוקן. לאחר ריקון, להסיר כמוסות מן מלכודות בועה לפני מילוי המערכת. החלף כמוסות לאחר מלכודות בועה מולאו לחלוטין בנוזל. חזור כנדרש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מים סטריליים באמצעות המערכת בקצב זרימה נמוכה (1-3 מ&quot;ל / שעה / ערוץ) במשך לילה או להמשיך לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את בקבוק בינוני עד כניסת ולשטוף את המערכת עם בינוני במשך הלילה בקצב זרימה נמוכה (3 מ&quot;ל / שעה / ערוץ) בטמפרטורה שבה הניסוי יבוצע. הערה: מלכודות בועה יש לרוקן את המים לפני מערכת מתמלא בינוני. </li></ol> 6. הרכבה של התא זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתוך התרבות לילה לעשות דילול צפיפות אופטית הרצוי (למשל עבור aeruginosa פ 0.001 OD 600nm ו - 0.1 OD 600nm עבור cerevisiae ס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במזרק 0.5 מ&quot;ל עם מחט 27G לטעון inoculum מספיק כדי למלא את החדר. 250 μL מספיק עבור לתאי תזרים בעל הממדים שצוינו בעבודה זו (איור 2., 40 מ&quot;מ x 4 מ&quot;מ x 1 מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את המשאבה peristaltic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמד את צינורות סיליקון מובילים אל התא זרימה כדי למנוע חזרה לזרום לתוך המערכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את האתר חיסון על צינורות סיליקון ידי מנגב אותו עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט לתוך הצינור סיליקון להציג את קצה לתוך מפרצון של התא זרימה. לאט לאט להזריק את inoculum החדרה (להיזהר לא להזריק בועות אוויר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המחט למחוק את האתר עם הזרקת אתנול 70% ואחריו אטימה מיידית של החור באמצעות דבק סיליקון על הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את התא זרימה ולתת מיקרו אורגניזמים לדבוק לתשתית במשך שעה 1 ללא לזרום דרך התא זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את התא זרימה, להפעיל את המשאבה בינוני (3 מ&quot;ל / שעה / ערוץ) ולקחת את מהדק את שפופרת סיליקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המערכת ממוקמת על הדגירה, בשעה 37 ° C במקרה של פ aeruginosa ו - 30 ° C במקרה של ס cerevisiae. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Biofilm בתאי תזרים כעת ניתן דמיינו ידי CLSM. </li></ol> 7. הכתמה של biofilm עבור מיקרוסקופיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע דילול מכתים המתאים (למשל 1:1000 Syto 9 לחיות כתם על cerevisiae ס) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את המשאבה peristaltic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קלאמפ של צינורות סיליקון המוביל התא זרימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר אתר חיסון על צינורות סיליקון ידי מנגב אותו עם אתנול 70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במזרק 0.5 מ&quot;ל עם מחט 27G לטעון פתרון מכתים מספיק כדי למלא את החדר. 250 μL מספיק עבור לתאי תזרים משמש כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס את המחט לתוך הצינור סיליקון להציג את קצה לתוך מפרצון של התא זרימה. לאט לאט להזריק את הפתרון מכתים החדרה (להיזהר לא להזריק בועות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המחט למחוק את האתר עם הזרקת אתנול 70% ואחריו איטום המיידית של הזריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאר את התא זרימה ללא זרימה במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוריד את מהדק ולהתחיל את הזרימה (3 מ&quot;ל / שעה / ערוץ) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוכשת את הנתונים עם CLSM </li></ol>

<ol>
	<li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+biofilms:+a+common+cause+of+persistent+infections.">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li><li>Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+and+analyzing+biofilms+in+flow+cells.">Growing and analyzing biofilms in flow cells.</a> Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, 2-2 (2006).</li><li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+reproducibility+in+flow-chamber+biofilms.">Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms.</a> Microbiology. 146, 2409-2415 (2000).</li><li>Pamp, S. J., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+biosurfactants+in+structural+biofilm+development+by+Pseudomonas+aeruginosa.">Multiple roles of biosurfactants in structural biofilm development by Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 189, 2531-2539 (2007).</li><li>Haagensen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+and+distribution+of+colistin-+and+sodium+dodecyl+sulfate-tolerant+cells+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Differentiation and distribution of colistin- and sodium dodecyl sulfate-tolerant cells in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> J Bacteriol. 189, 28-37 (2007).</li><li>Klausen, M., Aaes-Jorgensen, A., Molin, S., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+bacterial+migration+in+the+development+of+complex+multicellular+structures+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Involvement of bacterial migration in the development of complex multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Mol Microbiol. 50, 61-68 (2003).</li><li>Pamp, S. J., Gjermansen, M., Johansen, H. K., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tolerance+to+the+antimicrobial+peptide+colistin+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+is+linked+to+metabolically+active+cells,+and+depends+on+the+pmr+and+mexAB-oprM+genes.">Tolerance to the antimicrobial peptide colistin in Pseudomonas aeruginosa biofilms is linked to metabolically active cells, and depends on the pmr and mexAB-oprM genes.</a> Mol Microbiol. 68, 223-240 (2008).</li><li>Pamp, S. J., Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insight+into+the+microbial+multicellular+lifestyle+via+flow-cell+technology+and+confocal+microscopy.">Insight into the microbial multicellular lifestyle via flow-cell technology and confocal microscopy.</a> Cytometry Part A. 75A, 90-103 (2009).</li><li>Barken, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+type+IV+pili,+flagellum-mediated+motility+and+extracellular+DNA+in+the+formation+of+mature+multicellular+structures+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms.">Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Environ Microbiol. 10, 2331-2343 (2008).</li><li>Qin, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+autolysin-mediated+DNA+release+in+biofilm+formation+of+Staphylococcus+epidermidis.">Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis.</a> Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).</li><li>Allesen-Holm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+characterization+of+DNA+release+in+Pseudomonas+aeruginosa+cultures+and+biofilms.">A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms.</a> Mol Microbiol. 59, 1114-1128 (2006).</li><li>Heydorn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+biofilm+structures+by+the+novel+computer+program+COMSTAT.">Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT.</a> Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).</li><li>Palmer, R. J., Haagensen, J. A., Neu, T. R., Sternberg, C., Palmer, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 882-900 (2006).</li><li>Haagensen, J. A., Regenberg, B., Sternberg, C., M&#252;ller, S., Bley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High Resolution Microbial Single Cell Analytics Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology. , (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אנחנו הוכיחו תא זרימה מערכת המייצגת כלי רב עוצמה בחקירות biofilm. בשילוב עם הדמיה 3D ידי מיקרוסקופיה confocal, המערכת מציעה מגוון יתרונות בהשוואה לשיטות אחרות של ניתוח biofilms חיידקים באמצעות שיטות מיקרוסקופיות מסורתיים יותר. מערכת זו מאפשרת הדמיית 3D של חיים מיקרוביאליים קהילות biofilm ללא הפרעה של הקהילה. במיקרוסקופ אור לא תספק מידע מפורט על נישות של biofilm ובעוד במיקרוסקופ אלקטרונים מספקת רזולוציה ננומטרי של biofilm, הוא אינו מאפשר הדמיה תא חי. באמצעות ערוץ המתואר זרימת מערכת הובהר לנו בעבר את הפריסה המרחבית של תאים חיידקיים רגיש לאנטיביוטיקה מספר 5-8 (איור 4 א), הפצה של חומרים תאיים, למשל DNA ו 9-11, חלוקת תאים ניעתי ולא ניעתי של מאותו המין בתוך קהילה חיידקי 4,6,9 (איור 4 ג&#39;). אנו צופים כי המערכת התא זרימה ניתן ללמוד היבטים של biofilms שמרים. זה עשוי להיות הפצה spatio הזמני של biofilm שמרים בתגובה גורמים סביבתיים כמו קוטלי פטריות, וכן זיהוי של גנים המעורבים בהתפתחות biofilm שמרים. למרות שמרים לא ידוע להתמיין לתאי ניעתי ולא ניעתי, היבטים אחרים של גיוון עשוי להיות biofilm מחקרים כגון השינוי המורפולוגי של שמרים לתאי pseudohyphal ואת המעבר הפלואידים לתאי דיפלואידי. הראינו מערכת לציית מינים של חיידקים כמה יעבוד עם טכניקות צביעה שונות. מגוון בדיקות מכתים שונים חלבוני ניאון, כגון ה-GFP, לאפשר חקירות נישה ספציפיים biofilm המתפתח והוא מהווה כלי יעיל בניתוח ההשפעה של סוכני מיקרוביאלית או גורמים סביבתיים אחרים. המידע ניתן להשיג מפורט מאוד (איור 4) ותכונות biofilm ניתן לכמת עם תוכנות מחשב כגון סטטמ&quot;מ 12,13. בסך הכל, ההיבט הקריטי ביותר של פרוטוקול היא העובדה כי זהו תהליך גוזל זמן. זה גם מגבלה כי התאים צריכים להיות מסוגלים לגדול על משטח שאינו פלורסנט שקוף. . מכיוון biofilm נוצר מנותח באמצעות מיקרוסקופ confocal, עומק שניתן לחקור מוגבלת מאה מיקרומטר מספר 14 יש עוד מגבלות טכניות הטמון בעיצוב: המערכת אינו מתאים להקרנה תפוקה גבוהה, כחוקר מנוסה יכול לטפל בכ 15 ערוצי ביותר בכל ניסוי, אשר בתורו יכול לקחת כמה ימים כדי להתכונן. עם זאת, אנטיביוטיקה או מוטציות שנחשבים רלוונטיים ללימודי biofilm יכולים בתחילה להיות מסה הוקרן עם שיטות אחרות כגון מכתים סגול גביש לפני המועמדים המעניינים ביותר מועברים למערכת התא זרימה. יריעות כיסוי זכוכית דקים מאוד לשבור בקלות, יש להיזהר בעת הטיפול במערכות. בנוסף צינורות יש לבחון מדי יום במהלך הריצה של ניסוי, כמו רב &quot;גב צמיחה&quot; של צינורות כניסת רק נגד הזרם של תאים זרימת יכול להתרחש. זיהום מסוג זה ניתן לפתור על ידי הסרת כמה סנטימטרים של צינור סיליקון מהצד מפרצון של תאים הזרימה, באמצעות טכניקה סטרילית. <img src="/files/ftp_upload/2383/2383fig4.jpg" alt="איור 4" /> איור 4 PAO1 הישן) יום 4 -. Biofilm GFP שטופלו במשך 24 שעות עם Colistin ו יודיד Propidium עבור מכתים מת (כתם אדום) ב) מצגת 3D של יום שלוש פ &#39;הישן aeruginosa PAO1 (סוג P. aeruginosa בר) - GFP biofilm 6 ג) 3D מצגת תמונה של PAO1 - CFP Pila מוטציה (כחול) עם PAO1 סוג YFP בר (צהוב) ד) 5, יום PAO1 בן - GFP biofilm כפי שהוצגו 3D דואר תמונה) 26 ש &#39;ח (PTR3 מוטנטי CEN.PK רקע) biofilm cerevisiae מוכתם Syto-9 15.

<ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבועה מלכודות, פוליאתילן (DTU Systems Biology, האוניברסיטה הטכנית של דנמרק, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument 20Center/Resources/Biofilm% 20Setup.aspx%) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה פלסטיק פוליפרופילן המחברים ו-T-מחברים (קול לבן הזוג, 1 / 8 אינץ&#39; (3.175 מ&quot;מ) 1 / 16 אינץ&#39; (1.588 מ&quot;מ)) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Clamps </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Confocal מיקרוסקופ (Zeiss, Meta LSM510) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips, זכוכית (Knittel גלזר) 50 x 24 מ&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Coverslips, PVC coverslips (Rinzl) 50 x 24 מ&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תזרים תאים, פוליאתילן (DTU Systems Biology, האוניברסיטה הטכנית של דנמרק, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument 20Center/Resources/Biofilm% 20Setup.aspx% </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוקי בינוני (שוט) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Peristaltic משאבה (ווטסון, מרלו, 205S) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רולינג עגלה עבור מערכות זרימה ומשאבות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דבק סיליקון (3M איטום סופר סיליקון שקוף) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרק 5 מ&quot;ל (Terumo) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Syto 9 (בדיקות מולקולריות) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרקים 0.5 מ&quot;ל עם מחטים (27G, Terumo LU-100) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיכל פסולת </li></ul> Tubing: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיליקון, 3 מ&quot;מ קוטר חיצוני, 1 מ&quot;מ קוטר פנימי (אולה דיך) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיליקון, 4 מ&quot;מ קוטר חיצוני, קוטר פנימי 2 מ&quot;מ (אולה דיך) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Marprene, בקוטר של 3 מ&quot;מ החיצוני, 1 מ&quot;מ קוטר פנימי (ווטסון, מרלו) </li></ul> מדיה <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> P. aeruginosa בינוני </td></tr><tr><td> A10 </td><td> g / L </td></tr><tr><td> (NH 4) 2 SO4 </td><td> 2.0 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 X 2H 2 O </td><td> 6.0 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 3.0 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 3.0 </td></tr><tr><td> דוד לחץ </td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td></tr><tr><td colspan="2"> פנסיון מלא </td></tr><tr><td> MgCl 2 6 שעות 2 O </td><td> 0.20 </td></tr><tr><td> 1 מ&quot;ל 1 M CaCl 2 </td><td> 0.01 </td></tr><tr><td colspan="2"> 100 μL / L עקבות מתכות (עבור P. aeruginosa-biofilms) 4 </td></tr><tr><td colspan="2"> דוד לחץ </td></tr><tr><td colspan="2"> מערבבים A10 ו FB על יחס של 1:10. </td></tr><tr><td colspan="2"> הוסף מקור פחמן בריכוז הרצוי. </td></tr></tbody></table> <table border="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="2"> ס סינתטי cerevisiae בינוני מלא (SC) </td></tr><tr><td></td><td> g / L </td></tr><tr><td> אדנין סולפט </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L-טריפטופן </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L-היסטידין-HCL </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L-ארגנין-HCL </td><td> 0.04 </td></tr><tr><td> L-מתיונין </td><td> 0.02 </td></tr><tr><td> L-tyrosine </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L-לאוצין </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> L-isoleucine </td><td> 0.06 </td></tr><tr><td> L-ליזין-HCL </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L-פנילאלנין </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> L-חומצה אספרטית </td><td> 0.10 </td></tr><tr><td> L-חומצה גלוטמית </td><td> 0.10 </td></tr><tr><td> L-valine </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> L-תראונין </td><td> 0.20 </td></tr><tr><td> L-סרין </td><td> 0.40 </td></tr><tr><td> שמרים ניטרוגן בסיס w / o חומצות אמינו אמוניום (Bacto) </td><td> 1.6 </td></tr><tr><td> אמוניום סולפט </td><td> 5.0 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> 6.0 </td></tr><tr><td> Succinic חומצה </td><td> 10.0 </td></tr><tr><td> דוד לחץ </td><td></td></tr><tr><td> גלוקוז (autoclaved בנפרד) </td><td> 0.20 </td></tr></tbody></table>

pseudomonas aeruginosa and saccharomyces cerevisiae biofilm in flow cells

תאים של חיידקים רבים יש את היכולת ליצור קהילות מיקרוביאלי נייחים כהגדרתו biofilms כי שינו תכונות פיזיולוגיות פתולוגי לעומת מיקרואורגניזמים שחיים חינם. Biofilms בטבע הם לעתים קרובות קשה לחקור מתגוררים תחת תנאים מוגדרים היטב 1. באמצעות תשתית שקוף זה אפשרי למכשיר מערכת שבה biofilms פשוטה ניתן לבדוק באופן בלתי הרסניות בזמן אמת: כאן אנו מדגימים את הרכבה והפעלה של מערכת התא זרימה מודל, עבור במבחנה 3D של biofilms חיידקים יצירת reproducibility גבוהה תחת תנאים מוגדרים היטב 2,3. המערכת כוללת תא זרימה המשמש חדר הצמיחה biofilm. התא זרימה מסופק עם חומרי מזון וחמצן מן הבקבוק בינוני באמצעות משאבה peristaltic ובינוניים בילה נאסף במיכל אשפה. זה בנייה של מערכת הזרימה מאפשר אספקה ​​רציפה של חומרים מזינים מתן אנטיביוטיקה למשל עם הפרעה מינימלית של תאים בוגרים בחדר זרימה. יתר על כן, תנאי הזרימה בתוך התא זרימה לאפשר מחקרים biofilm שנחשפו ללחץ גזירה. בועה השמנה גבולות מכשיר בועות אוויר מן הצינור, אשר אחרת עלולה לשבש את המבנה biofilm בתוך התא זרימה. מערכת התא זרימה תואמת מיקרוסקופית סריקה Confocal לייזר (CLSM) והוא יכול ובכך לספק מידע 3D מפורט ביותר על פיתוח biofilms חיידקים. תאים biofilm יכול להיות מתויג עם בדיקות ניאון או חלבונים בקנה אחד עם ניתוח CLSM. זה מאפשר הדמיה מקוונת המאפשרת חקירת נישות biofilm המתפתח. הגומלין מיקרוביאלית, חקירת סוכני מיקרוביאלית או את הביטוי של גנים ספציפיים, הם של ניסויים רבים setups שניתן לחקור במערכת התא זרימה.

Watch this Scientific Journal Video about Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells at JoVE.com

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

הפרוטוקול מתאר את היישום של מערכת התא זרימה לגידול וניתוח biofilms חיידקים מיקרוסקופית סריקה Confocal לייזר (CLSM).

Pseudomonas aeruginosa ו biofilm Saccharomyces cerevisiae בתוך תאים Flow

Many microbial cells have the ability to form sessile microbial communities defined as biofilms that have altered physiological and pathological ...

pseudomonas-aeruginosa-saccharomyces-cerevisiae-biofilm-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

36.5K Views.  Danish Technical University. הפרוטוקול מתאר את היישום של מערכת התא זרימה לגידול וניתוח biofilms חיידקים מיקרוסקופית סריקה Confocal לייזר (CLSM).

Video: Pseudomonas aeruginosa and Saccharomyces cerevisiae Biofilm in Flow Cells

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living surfaces. In this paper, we describe protocols for forming Pseudomonas aeruginosa biofilms on human airway epithelial cells (CFBE cells) grown in culture. In the first method (termed the Static Co-culture Biofilm Model), P. aeruginosa is incubated with CFBE cells grown as confluent monolayers on standard tissue culture plates. Although the bacterium is quite toxic to epithelial cells, the addition of arginine delays the destruction of the monolayer long enough for biofilms to form on the CFBE cells. The second method (termed the Flow Cell Co-culture Biofilm Model), involves adaptation of a biofilm flow cell apparatus, which is often used in biofilm research, to accommodate a glass coverslip supporting a confluent monolayer of CFBE cells. This monolayer is inoculated with P. aeruginosa and a peristaltic pump then flows fresh medium across the cells. In both systems, bacterial biofilms form within 6-8 hours after inoculation. Visualization of the biofilm is enhanced by the use of P. aeruginosa strains constitutively expressing green fluorescent protein (GFP). The Static and Flow Cell Co-culture Biofilm assays are model systems for early P. aeruginosa infection of the Cystic Fibrosis (CF) lung, and these techniques allow different aspects of P. aeruginosa biofilm formation and virulence to be studied, including biofilm cytotoxicity, measurement of biofilm CFU, and staining and visualizing the biofilm.

Co-culture Models of Pseudomonas aeruginosa Biofilms Grown on Live Human Airway Cells

This paper describes different methods of growing Pseudomonas aeruginosa biofilms on cultured human airway epithelial cells. These protocols can be adapted to study different aspects of biofilm formation, including visualization of the biofilm, staining of the biofilm, measuring the colony forming units (CFU) of the biofilm, and studying biofilm cytotoxicity.

Co-מודלים של תרבות Pseudomonas aeruginosa Biofilms גדל על תאים חיים Airway האדם

Bacterial biofilms have been associated with a number of different human diseases, but biofilm development has generally been studied on non-living ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA בידוד Pseudomonas aeruginosa מיישבים את מערכת העיכול Murine

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model itself. Early phases of inflammation and infection have been widely studied by using the Pseudomonas aeruginosa agar-beads mouse model, while only few reports have focused on the long-term chronic infection in vivo. The main challenge for long term chronic infection remains the low bacterial burden by P. aeruginosa and the low percentage of infected mice weeks after challenge, indicating that bacterial cells are progressively cleared by the host.
This paper presents a method for obtaining efficient long-term chronic infection in mice. This method is based on the embedding of the P. aeruginosa clinical strains in the agar-beads in vitro, followed by intratracheal instillation in C57Bl/6NCrl mice. Bilateral lung infection is associated with several measurable read-outs including weight loss, mortality, chronic infection, and inflammatory response. The P. aeruginosa RP73 clinical strain was preferred over the PAO1 reference laboratory strain since it resulted in a comparatively lower mortality, more severe lesions, and higher chronic infection. P. aeruginosa colonization may persist in the lung for over three months. Murine lung pathology resembles that of CF patients with advanced chronic pulmonary disease.
This murine model most closely mimics the course of the human disease and can be used both for studies on the pathogenesis and for the evaluation of novel therapies.

Long Term Chronic Pseudomonas aeruginosa Airway Infection in Mice

We describe the agar-beads method to establish persistent long-term chronic Pseudomonas aeruginosa airway infection in the mouse model.

כרוני לטווח ארוך<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; זיהום דרכי הנשימה בעכברים

A mouse model of chronic airway infection is a key asset in cystic fibrosis (CF) research, although there are a number of concerns regarding the model ...

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen which establishes chronic pulmonary infections in patients with cystic fibrosis (CF). The overproduction of a capsular polysaccharide called alginate, also known as mucoidy, promotes the formation of mucoid biofilms which are more resistant than planktonic cells to antibiotic chemotherapy and host defenses. Additionally, the conversion from the nonmucoid to mucoid phenotype is a clinical marker for the onset of chronic infection in CF. Alginate overproduction by P. aeruginosa is an endergonic process which heavily taxes cellular energy. Therefore, alginate production is highly regulated in P. aeruginosa. To better understand alginate regulation, we describe a protocol using the mini-himar1 transposon mutagenesis for the identification of novel alginate regulators in a prototypic strain PAO1. The procedure consists of two basic steps. First, we transferred the mini-himar1 transposon (pFAC) from host E. coli SM10/&#955;pir into recipient P. aeruginosa PAO1 via biparental conjugation to create a high-density insertion mutant library, which were selected on Pseudomonas isolation agar plates supplemented with gentamycin. Secondly, we screened and isolated the mucoid colonies to map the insertion site through inverse PCR using DNA primers pointing outward from the gentamycin cassette and DNA sequencing. Using this protocol, we have identified two novel alginate regulators, mucE (PA4033) and kinB (PA5484), in strain PAO1 with a wild-type mucA encoding the anti-sigma factor MucA for the master alginate regulator AlgU (AlgT, &#963;22). This high-throughput mutagenesis protocol can be modified for the identification of other virulence-related genes causing change in colony morphology.

Identification of Novel Genes Associated with Alginate Production in Pseudomonas aeruginosa Using Mini-himar1 Mariner Transposon-mediated Mutagenesis

Here we describe a protocol using the mini-himar1 mariner transposon-mediated mutagenesis for generating a high-density insertion mutant library to screen, isolate and identify novel alginate regulators in the prototypic Pseudomonas aeruginosa strain PAO1.

זיהוי גנים הקשורים לרומן אלגינט ייצור ב<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; שימוש מיני<em&gt; Himar1</em&gt; Mutagenesis תיווך transposon מרינר

Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, environmental bacterium with versatile metabolic capabilities. P. aeruginosa is an opportunistic bacterial ...

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. Here we have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa or PA). Using this model, we were able to show lung inflammation at the early phase of injury. In addition, alveolar epithelial barrier leakiness was observed by analyzing bronchoalveolar lavage (BAL); and alveolar cell death was observed by Tunel assay using tissue prepared from injured lungs. At a later phase following injury, we observed cell proliferation required for the repair process. The injury was resolved 7 days from the initiation of P. aeruginosa injection. This model mimics the sequential course of lung inflammation, injury and repair during pneumonia. This clinically relevant animal model is suitable for studying pathology, mechanism of repair, following acute lung injury, and also can be used to test potential therapeutic agents for this disease.

Pseudomonas aeruginosa Induced Lung Injury Model

We have developed a mouse lung injury model by intra-tracheal injection of bacteria Pseudomonas aeruginosa. This model mimics lung injury during pneumonia and is clinically relevant.

Pseudomonas aeruginosa מושרה ריאות פגיעה דגם

In order to study human acute lung injury and pneumonia, it is important to develop animal models to mimic various pathological features of this disease. ...

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. Chronic mouse wounds models have been used to understand the underlying interactions between the microorganisms and the host. The models developed to date rely on the use of haired animals and terminal collection of wound tissue for determination of viable bacteria. While significant insight has been gained with these models, this experimental procedure requires a large number of animals and sampling is time consuming. We have developed a novel murine model that incorporates several optimal innovations to evaluate biofilm progression in chronic wounds: a) it utilizes hairless mice, eliminating the need for hair removal; b) applies pre-formed biofilms to the wounds allowing for the immediate evaluation of persistence and effect of these communities on host; c) monitors biofilm progression by quantifying light production by a genetically engineered bioluminescent strain of Pseudomonas aeruginosa, allowing real-time monitoring of the infection thus reducing the number of animals required per study. In this model, a single full-depth wound is produced on the back of STZ-induced diabetic hairless mice and inoculated with biofilms of the P. aeruginosa bioluminescent strain Xen 41. Light output from the wounds is recorded daily in an in vivo imaging system, allowing for in vivo and in situ rapid biofilm visualization and localization of biofilm bacteria within the wounds. This novel method is flexible as it can be used to study other microorganisms, including genetically engineered species and multi-species biofilms, and may be of special value in testing anti-biofilm strategies including antimicrobial occlusive dressings.

Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model

Here we describe a novel diabetic murine model utilizing hairless mice for real-time, non-invasive, monitoring of biofilm wound infections of bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. This method can be adapted to evaluate infection of other bacterial species and genetically modified microorganisms, including multi-species biofilms, and test the efficacy of antibiofilm strategies.

לצידו. אור: בויוו ניטור של דלקות Biofilm Pseudomonas aeruginosa לפצעים כרוניים במודל מאתר של שיער סוכרתית

The presence of bacteria as structured biofilms in chronic wounds, especially in diabetic patients, is thought to prevent wound healing and resolution. ...

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa is able to form biofilms, develop antibiotic resistance, produce virulence factors, and rapidly evolve in the course of a chronic infection. Thus P. aeruginosa can cause both acute and chronic, difficult to treat infections, resulting in significant morbidity in certain patient populations. P. aeruginosa strain PA14 is a human clinical isolate with a conserved genome structure that infects a variety of mammalian and nonvertebrate hosts making PA14 an attractive strain for studying this pathogen. In 2006, a nonredundant transposon insertion mutant library containing 5,459 mutants corresponding to 4,596 predicted PA14 genes was generated. Since then, distribution of the PA14 library has allowed the research community to better understand the function of individual genes and complex pathways of P. aeruginosa. Maintenance of library integrity through the replication process requires proper handling and precise techniques. To that end, this manuscript presents protocols that describe in detail the steps involved in library replication, library quality control and proper storage of individual mutants.

Replication of the Ordered, Nonredundant Library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 Transposon Insertion Mutants

Pseudomonas aeruginosa infection causes significant morbidity in vulnerable hosts. The nonredundant transposon insertion mutant library of P. aeruginosa strain PA14, designated as PA14NR Set, facilitates analysis of gene functionality in numerous processes. Presented here is a protocol to generate high-quality copies of the PA14NR Set mutant library.

שכפול של הוזמן, ספריית Nonredundant של Pseudomonas aeruginosa זן PA14 Transposon ההכנסה מוטציות

Pseudomonas aeruginosa is a phenotypically and genotypically diverse and adaptable Gram-negative bacterium ubiquitous in human environments. P. aeruginosa ...

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary tissue during pneumonia results in the production of long-lived cytotoxins that can lead to subsequent end organ failure. We have developed in vitro assays to test the hypothesis that cytotoxins are produced during pulmonary infection. Isolated rat pulmonary endothelial cells and the bacterium Pseudomonas aeruginosa are used as model systems, and the production of cytoxins following infection of the endothelial cells by the bacteria is demonstrated using cell culture followed by direct quantitation using lactate dehydrogenase assays and a novel microscopic method utilizing ImageJ technology. The amyloid nature of these cytotoxins was demonstrated by thioflavin T binding assays and by immunoblotting and immunodepletion using A11 anti-amyloid antibody. Further analyses using immunoblotting demonstrated that oligomeric tau and A&#946; were produced and released by endothelial cells following infection by P. aeruginosa. These methods should be readily adaptable to analyses of human clinical samples.

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Simple methods are described for demonstrating the production of cytotoxic amyloids following infection of pulmonary endothelium by Pseudomonas aeruginosa.

שיטות זיהוי ציטוטוקסיות Amyloids הבאים זיהום של אנדותל תאי הריאות על ידי Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of these products are naturally produced by the organisms, other products require genetic engineering of the organism to increase the yields of production. Avirulent strains of Escherichia coli have traditionally been the preferred bacterial species for producing biopharmaceuticals; however, some products are difficult for E. coli to produce. Thus, avirulent strains of other bacterial species could provide useful alternatives for production of some commercial products. Pseudomonas aeruginosa is a common and well-studied Gram-negative bacterium that could provide a suitable alternative to E. coli. However, P. aeruginosa is an opportunistic human pathogen. Here, we detail a procedure that can be used to generate nonpathogenic strains of P. aeruginosa through sequential genomic deletions using the pEX100T-NotI plasmid. The main advantage of this method is to produce a marker-free strain. This method may be used to generate highly attenuated P. aeruginosa strains for the production of commercial products, or to design strains for other specific uses. We also describe a simple and reproducible mouse model of bacterial systemic infection via intraperitoneal injection of validated test strains to test the attenuation of the genetically engineered strain in comparison to the FDA-approved BL21 strain of E. coli.

Generation of In-Frame Gene Deletion Mutants in Pseudomonas aeruginosa and Testing for Virulence Attenuation in a Simple Mouse Model of Infection

Here, we describe a simple and reproducible protocol of mouse model of infection to evaluate the attenuation of the genetically modified strains of Pseudomonas aeruginosa in comparison to the United States Food and Drug Administration (FDA)-approved Escherichia coli for commercial applications.

הדור של המסגרת של גן In-Frame מוטציות מחיקה ב פסאודומונס aeruginosa ובדיקת התקפה אלימה מודל עכבר פשוט של זיהום

Microorganisms are genetically versatile and diverse and have become a major source of many commercial products and biopharmaceuticals. Though some of ...