עבודה זו נתמכה על ידי הקנדי הלאומי לבריאות מחקר (CIHR) מענק ויין ס Sossin. קרול א פרח הוא מקבל המלגה הבתר מן Fonds de la משוכלל ונדיר en סנטה קוויבק (FRSQ) וכן הרינגטון קונרד המילגה. המחברים מבקשים להודות ג&#39;ואנה פתילון, מרגרט הייסטינגס מרגרט Labban לעזרה עם לירות וידאו בריכת מדליין ריצ&#39;מונד לעזרה עם סקירה הגרפיקה.

1. הכנה ותחזוקה של Sf9 תרבויות monolayer Cell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sf9 תרבית תאים והתחזוקה מתבצעת במנדף בתרבית רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Sf9 תאים מתאי Spodoptera frugiperda השחלות (Sf21 תאים) וכן ניתן לרכוש תאים קפואים התקשורת של גרייס מן Invitrogen. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 8 מ&quot;ל של מדיום החרק של גרייס, בתוספת (1X), אשר 30% עוברי שור בסרום (FBS) נוספה ב 75 ס&quot;מ 2 בקבוק תרבית תאים עם צוואר הנטוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההפשרה הצינור הקפוא של Sf9 תאים במהירות אמבטיה 37 מעלות צלזיוס מים על ידי העברת צינור הלוך ושוב (כ 1-2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת Sf9 תאים 75 ס&quot;מ 2 בקבוק התרבות תאים צלחת רוק בעדינות ביד כדי לפזר את התאים באופן שווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה 1-2 שעות ב 27 ° C עד התאים המצורפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בינוני הישן ולהחליף עם 10 מ&quot;ל של מדיום של חרקים freshGrace עם 30% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 27 מעלות צלזיוס עד התאים ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על תרבויות monolayer, להסיר בינוני הישן מהבקבוק ומחוברות של Sf9 תאים להוסיף 5 מ&quot;ל של מדיום החרק של גרייס עם 10% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברז קלות בצד של הבקבוק כמה פעמים כדי לנתק Sf9 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 10 מ&quot;ל ו pipettor, פיפטה התקשורת מעלה ומטה פעם בעדינות, ריסוס קיר בקבוק תוך pipetting למטה. העברת התאים צינור סטרילי מ&quot;ל 15 Polysterene. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של השעיה Sf9 התא 8 מ&quot;ל של מדיום החרק של גרייס עם FBS 10% (בדילול 01:05 כדי לשמור על שלב הצמיחה יומן) של 75 ס&quot;מ חדש בקבוקון 2 תאים תרבות צלחת רוק בעדינות ביד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 27 מעלות צלזיוס עד התאים ומחוברות. </li></ol> 2. הביטוי של PKCS Tagged fluorescently ב Sf9 תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשביל לחיות הדמיה הניסוי, תרבות Sf9 תאים על 35 מ&quot;מ MatTek זכוכית התחתונה תרבות disheswith משטח זכוכית של 14 מ&quot;מ עובי ו coverslip של 0.16-0.19 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PKCS מתוייגים עם חלבוני ניאון באים לידי ביטוי Sf9 תאים באמצעות Cellfectin מגיב II transfection ההמלצה הבאה של היצרן בשינויים המפורטים להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 1: לפני ציפוי התאים, להתייחס לכל צלחת MatTek בינוני עם החרק של גרייס עם FBS של 10% לפחות במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרוזן Sf9 תאים משלב 11 (לעיל) באמצעות hemacytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט 0.05 x 10 6 תאים coverslip כל MatTek זכוכית בנפח כולל של 150 μL. אפשר לצרף את התאים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מ&quot;ל של גרייס בתוספת 10% FBS כדי מ&quot;ל כל מנה 1 בכל פעם לאט, כדי למנוע ניתוק התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדגור על 27 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנקודה זו ואילך, להשתמש המלצה של היצרן עבור transfection Sf9 של תאים עם פלסמיד דנ&quot;א. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יום 2: Transfect Sf9 תאים עם PKCS מתויג fluorescently באמצעות Cellfectin מגיב II transfection. יש לנו לעתים קרובות שיתוף לידי ביטוי במערכת זו PKCS מתוייגים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק משופרת (eGFP) ו monomeric חלבון פלואורסצנטי אדום (mRFP) (פרטים לבנייה פלסמיד תוארו בעבר 2,5). הביטוי של חלבון אחד ניאון בזמן התשואות על 70-80% להביע תאים 72 שעות לאחר transfection. עמית הביטוי של שני חלבונים פלורסנט פוחתת יעילות transfection כדי כ -30% משותף המבטא תאים. כאשר שיתוף להביע eGFP-tagged PKC ו-mRFP מתויג PKC, להשתמש 2x-DNA פלסמיד יותר חלבון mRFP-tagged עבור ביטוי חלבון אופטימלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע לחיות הדמיה 48-72 שעות שלאחר transfection (ביטוי חלבון אופטימלי, להמתין 72 שעות). </li></ol> 3. הביטוי של PKCS Tagged fluorescently בנוירונים Aplysia חושי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תרביות תאים עצביים Aplysia תוארה במאמר וידאו על ידי ג&#39;או 4 עמיתים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PKCS מתוייגים עם חלבוני ניאון באים לידי ביטוי נוירונים Aplysia חושית באמצעות הליך microinjection כמפורט להלן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון המניות של גרין מהיר 1% (FCF) של מים מזוקקים, מסנן באמצעות מזרק מזרק 28 מ&quot;מ פילטר (0.20 מיקרומטר). Aliquot ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microinjection של עצב סנסורי יכול להתבצע ביום 1 או 2 אחרי יום לבודד את הנוירונים אך אנו מוצאים כי מחכה 2 ימים מאפשר היצמדות התא עדיף coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום 2 לאחר בידוד של נוירונים חושיים, להפשיר aliquot של גרין מהיר לסנן אותו שוב באמצעות מזרק מזרק מסנן 28 מ&quot;מ (0.20 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון ה-DNA פלסמיד המכיל מים מזוקקים בתוך הירוק מהיר 0.5%. ריכוזים של DNA פלסמיד גבוה ככל 0.4 מיקרוגרם / μL ניתן להשתמש אך לא מומלץ ללכת מעל ערכים אלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ה-DNA פלסמיד / פתרון ירוק מהיר באמצעות מזרק 1 מ&quot;ל ו 4 מ&quot;מ מזרק מסנן (0.20 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה את הדנ&quot;א פלסמיד / גרין פתרון מהיר ב XG 16,110 במשך 15 דקות באמצעות מיקרופוןrocentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אלקטרודות חדה microinjection של הנוירונים באמצעות חולץ microelectrode (סאטר Flaming / בראון micropipette פולר, דגם P-97). שימוש נימה תיבת, למשוך microelectrodes זכוכית בקוטר 1 מ&quot;מ החיצוני, 0.75 מ&quot;מ בתוך בקוטר 100 מ&quot;מ אורך באמצעות קיר זכוכית דק נימים עם נימה בפנים (World Precision מכשירים TW100F-4). לקבלת מידע נוסף על משיכת אלקטרודות microinjection עיין ספר בישול אלקטרודה סאטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים כל אלקטרודה עם μL 2 של ה-DNA פלסמיד / גרין פתרון מהיר באמצעות פיפטה microloader קצה (Eppendorf CA32950-050). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את תחתית הכוס MatTek תרבות צלחת המכילה תרבויות Aplysia העצבית לתחנת microinjection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחנת microinjection מורכב מהפעולות הבאות: תוצרת בית בשלב זכוכית גדול להחזיק את הכלים תרבות על השולחן רטט בידוד (קינטי בידוד מערכות עבודה רטט), מערכת סטריאו, היקף עם תאורה הלוגן חיצוני, micromanipulator (סאטר האקסלי Micromanipulator וול סוג אשר מאפשר מיצוב הן גס ו-Ultra קנס של שלושה צירים), מחזיק microelectrode מחוברת משאבה פנאומטי (מכשירים העולם Precision PV820 פניאומטיים Pico-Pump). קלט הלחץ של המשאבה פנאומטי מחובר טנק חנקן דחוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנס microelectrode לתוך מחזיק microelectrode. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפייה במיקרוסקופ, סטריאו, הכנס את קצה micropipette לתוך גרעין התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת פולסים קצרים הלחץ של חנקן (10-100 ms משך: 20 £ / ב 2) עד בגרעין הופך ירוק uniformely. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר ולשמור על 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש. עבור טרנסלוקציה PKC אופטימלי, לבצע הדמיה לחיות הניסוי 20-24 שעות לאחר ההזרקה. </li></ol> 4. ויזואליזציה של טרנסלוקציה של PKC חיים Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הדמיה, אנו משתמשים במיקרוסקופ Zeiss LSM510 confocal הפוכה עם 200 Axiovert. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה פרוטוקול זהה עבור Sf9 תאים עבור נוירונים Aplysia חושית למעט הבאים: Sf9 התאים הם צילמו עם מטרה x63 טבילה שמן ואילו נוירונים Aplysia חושית הם צילמו עם מטרה טבילה שמן X40. Sf9 התאים הם צילמו בחדר בקרת טמפרטורה שמרה על 26-27 מעלות צלסיוס ואילו נוירונים Aplysia חושית הם צילמו בטמפרטורת החדר נשמר סביב 18-20 o C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משתמשים 30 mW ארגון לייזר (עירור ב 488nm) עם פלט לייזר 50% PKC תמונה מתוייגים עם חלבון ו eGFP לייזר HeNe (עירור ב 543nm) כדי PKC תמונה מתוייגים עם חלבון mRFP. ארגון ו HeNe קווי לייזר נחלש ל -4% ואת התפוקה העברת 50% בהתאמה לפני הדמיה חריר מותאם אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשוב לקבל את המנה תרבות התייצב על הבמה הדמיה כדי למנוע תנועה או רטט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסרה של 1 מ&quot;ל של התקשורת בתרבות מצלחת בעדינות בעזרת פיפטה 10 מ&quot;ל עוזב נפח 1 מ&quot;ל סך המנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלמו תמונות בחלק האמצעי של התאים בהם את הגרעין ניתן לראות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת סדרת זמן של 10-20 תמונות confocal לצלם כל 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחילו את סדרת זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 תמונות נלקחים (אחרי נקודת זמן 30 שניות), מוסיפים 1 מ&quot;ל של התרופה (2X ריכוז) בעדינות טיפה אחר טיפה על גבי התאים בעזרת פיפטה P1000. התרופה היא הוסיפה ברציפות במשך כ -30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלק מהתרופות לגרום טרנסלוקציה מהיר אשר ניתן לראות מיד לאחר טיפול תרופתי (בנקודת זמן 60 שניות), בעוד שאחרים לגרום טרנסלוקציה איטי וזה רק 50-10 דקות אופטימלי שלאחר הטיפול (סרט 1 סרט ו 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התרופה צריכה להיות נשטף, להשתמש 2 x 10 מ&quot;ל pipets לעשות כביסה, pipetting החיץ לשטוף בעדינות עם פיפטה אחת על צד אחד של תבשיל ו pipeting את המדיה בצד השני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם לשטוף את כבר יעיל אם את האפקט של התרופה הוא הפיך, PKC יחזרו cytosol בתוך 30-60 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הסרט כקובץ LSM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש NIH תוכנה J תמונה כדי לפתוח את הקבצים LSM ולכמת תמונות הקדם ואת הטיפול התרופתי הודעה. כימות תוארה במקום אחר 1. </li></ol>

<ol>
	<li>Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+role+for+phosphatidic+acid+in+the+translocation+of+the+novel+protein+kinase+C+Apl+II+in+Aplysia+neurons.">Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons.</a> Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).</li><li>Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Klein, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M.Isoform+specificity+of+PKC+translocation+in+living+Aplysia+sensory+neurons+and+a+role+for+Ca2+-dependent+PKC+APL+I+in+the+induction+of+intermediate-term+facilitation.">M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation.</a> J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).</li><li>Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKC+differentially+translocates+during+spaced+and+massed+training+in+Aplysia.">PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia.</a> J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).</li><li>Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Aplysia+sensory-motor+neuronal+cell+cultures.">Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-independent+PKC+Apl+II+mediates+the+serotonin+induced+facilitation+at+depressed+synapses+in+Aplysia.">Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia.</a> J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תיארנו טכניקה הדימוי של טרנסלוקציה PKCS מתויג fluorescently בזמן אמת Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושית. Sf9 תאים לספק מערכת פשוטה טרנסלוקציה תמונה PKC מאז culturing ו transfecting אותם הוא די ישר קדימה. לעומת זאת, microinjection של נוירונים Aplysia חושית לוקח קצת זמן כדי לשלוט; עד כמה חודשים. קשיי...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Sf9 frozen cells</td>
<td>Spodoptera frugiperda ovarian cells</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>B825-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Grace&#x2019;s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>11605-094</td>
<td>Use to culture Sf9 cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Corning 75cm2 canted neck cell culture flask</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>430720</td>
<td>Use to culture Sf9 cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>Reagent</td>
<td>CanSera</td>
<td>CS-C08-500</td>
<td>Supplement Grace's media with FBS prior to use</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe</td>
<td>Tool</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>309604</td>
<td>Use to filter Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Syringe</td>
<td>Tool</td>
<td>Becton Dickinson</td>
<td>309602</td>
<td>Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>431229</td>
<td>Use to filter Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Filter</td>
<td>Tool</td>
<td>Corning</td>
<td>431212</td>
<td>Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution</td>
</tr>
<tr>
<td>Glass Bottom Dish</td>
<td>Tool</td>
<td>Mattek</td>
<td>P35G-1.5-14-C</td>
<td>Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging</td>
</tr>
<tr>
<td>Cellfectin II Reagent</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>10362-100</td>
<td>Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells</td>
</tr>
<tr>
<td>Fast Green FCF</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>F-7252</td>
<td>Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons</td>
</tr>
<tr>
<td>Thin wall glass capillaries</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>TW100F-4</td>
<td>Use to make microelectrodes for microinjection</td>
</tr>
<tr>
<td>Microloader pipette tip</td>
<td>Tool</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>CA32950-050</td>
<td>Autoclave before using to fill up the microelectrodes for microinjection</td>
</tr>
<tr>
<td>PV820 Pneumatic PicoPump </td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>SYS-PV820</td>
<td>Part of microinjection station</td>
</tr>
<tr>
<td>Microelectrode holder</td>
<td>Tool</td>
<td>World Precision Instruments</td>
<td>MPH6S</td>
<td>Use to hold microelectrode </td>
</tr>
<tr>
<td>Micromanipulator</td>
<td>Tool</td>
<td>Sutter</td>
<td>MP-85</td>
<td>Use to position microelectrode in the three-axis</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

live-imaging of pkc translocation in sf9 cells and in aplysia sensory neurons

חלבון קינאז Cs (PKCS) הם סרין קינאזות תראונין כי תפקיד מרכזי בוויסות מגוון רחב של תהליכים תאיים כגון צמיחת תאים למידה וזיכרון. ישנן ארבע משפחות הידועים של isoforms PKC בבעלי חוליות: PKCS קלאסית (α, βI, βII ו γ), סוג הרומן אני PKCS (ε ו η), רומן מסוג II PKCS (δ ו θ), ו PKCS טיפוסיות (ζ ו ι ). PKCS קלאסית מופעלים על ידי Ca 2 + ו diacylclycerol (דאג), בעוד PKCS רומן מופעלים על ידי DAG, אבל הם Ca 2 + עצמאית. PKCS טיפוסיות מופעלים על ידי לא Ca 2 + וגם לא דאג. ב Aplysia californica, מערכת המודל שלנו ללמוד היווצרות הזיכרון, ישנם שלושה ספציפיים מערכת העצבים isoforms PKC אחד מתוך כל שיעור גדול, כלומר קונבנציונלי PKC Apl אני, סוג הרומן אני PKC Apl השנייה טיפוסיות PKC Apl III. PKCS הם שומנים בדם מופעל קינאזות ובכך ההפעלה של PKCS קלאסית רומן בתגובה לאותות תאיים כבר בקורלציה לעתים קרובות עם טרנסלוקציה PKC מן הציטופלסמה אל קרום התא. לכן, טרנסלוקציה PKC חזותי בזמן אמת בתאים חיים הפך להיות כלי רב ערך עבור הבהרת הולכת אותות מסלולים שיובילו הפעלת PKC. לדוגמה, טכניקה זו אפשרה לנו לקבוע כי isoforms שונים של PKC translocate בתנאים שונים לתווך סוגים שונים של הפלסטיות הסינפטית וכי (5HT) סרוטונין הפעלת PKC Apl השנייה דורשת ייצור של שני DAG ו phosphatidic חומצה (רש&quot;פ) עבור טרנסלוקציה 1-2. חשוב לציין, את היכולת לדמיין את אותו הדבר שוב ושוב נוירון אפשרה לנו, למשל, כדי למדוד את הפחתת רגישות התגובה PKC בפירוט מעולה 3. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את כל שלב הכנת Sf9 תרביות תאים, תרביות של נוירונים Aplysia חושית תוארו במאמר אחר וידאו 4, להביע PKCS מתויג fluorescently ב Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי לחיות הדמיה טרנסלוקציה של PKC בתגובה activators שונים באמצעות לייזר מיקרוסקופיית.

Watch this Scientific Journal Video about Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons at JoVE.com

Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

בסרטון הזה אנחנו מדגימים להדמיה טרנסלוקציה של PKC בתאים חיים באמצעות PKCS מתויג fluorescently.

Live-הדמיה של טרנסלוקציה של PKC Sf9 תאים בנוירונים Aplysia חושי

Protein kinase Cs (PKCs) are serine threonine kinases that play a central role in regulating a wide variety of cellular processes such as cell growth and ...

live-imaging-pkc-translocation-sf9-cells-aplysia-sensory

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K Views.  McGill University. בסרטון הזה אנחנו מדגימים להדמיה טרנסלוקציה של PKC בתאים חיים באמצעות PKCS מתויג fluorescently.

Video: Live-imaging of PKC Translocation in Sf9 Cells and in Aplysia Sensory Neurons

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

זמן לשגות הדמיה חיה של Related Clonally ובתאים עצבית של פיתוח דג הזברה forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

Neuromodulation ותחבורה מיטוכונדריאלי: הדמיה חיה נוירונים בהיפוקמפוס פני משכי זמן ארוכים

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Lentivirus בתיווך ויזואליזציה מניפולציה גנטית של עצב סנסורי חוש הריח In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Flash Photolysis of Caged Compounds in the Cilia of Olfactory Sensory  Neurons

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. Caged compounds are molecules made physiologically inactive by a chemical cage that can be broken by a flash of ultraviolet light. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged compounds for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons. The process of olfactory transduction (Figure 1) takes place in the cilia of olfactory sensory neurons, where odorant binding to receptors leads to the increase of cAMP that opens cyclic nucleotide-gated (CNG) channels2. Ca entry through CNG channels activates Ca-activated Cl channels. We show how to dissociate neurons from the mouse olfactory epithelium3 and how to activate CNG channels or Ca-activated Cl channels by photolysis of caged cAMP4 or caged Ca5. We use a flash lamp6,7 to apply ultraviolet flashes to the ciliary region to uncage cAMP or Ca while patch-clamp recordings are taken to measure the current in the whole-cell voltage-clamp configuration8-11.

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds. Here, we show how to obtain patch-clamp recordings combined with photolysis of caged cAMP or caged Ca for the study of olfactory transduction in dissociated mouse olfactory sensory neurons.

פלאש Photolysis של תרכובות כלואה צילה של עצב סנסורי חוש הריח

Photolysis of caged compounds allows the production of rapid and localized increases in the concentration of various physiologically active compounds1. ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracellularly זיהוי תאי עצב מוטורי לשריר בברכת מוטור<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

בידוד של נוירונים חושיים של<em&gt; Aplysia californica</em&gt; להקלטות מהדק תיקון של זרמי glutamatergic

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

הר immunolabeling השלם של חוש הריח קולטן נוירונים<em&gt; דרוזופילה</em&gt; אנטנה

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

A Method to Target and Isolate Airway-innervating Sensory Neurons in Mice

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of these afferent neurons are located within the sensory ganglia. Sensory ganglia innervate a specific organ or portion of the body. For instance, the dorsal root ganglia (DRG) are located in the vertebral column and extend processes throughout the body and limbs. The trigeminal ganglia are located in the skull and innervate the face, and upper airways. Vagal afferents of the nodose ganglia extend throughout the gut, heart, and lungs. The nodose neurons control a diverse array of functions such as: respiratory rate, airway irritation, and cough reflexes. Thus, to understand and manipulate their function, it is critical to identify and isolate airway specific neuronal sub-populations. In the mouse, the airways are exposed to a fluorescent tracer dye, Fast Blue, for retrograde tracing of airway-specific nodose neurons. The nodose ganglia are dissociated and fluorescence activated cell (FAC) sorting is used to collect dye positive cells. Next, high quality ribonucleic acid (RNA) is extracted from dye positive cells for next generation sequencing. Using this method airway specific neuronal gene expression is determined.

Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.

שיטה לכוון ולבודד Airway-innervating עצב סנסורי של עכברים

Somatosensory nerves transduce thermal, mechanical, chemical, and noxious stimuli caused by both endogenous and environmental agents. The cell bodies of ...